块茎蛋白质的稳定化的制作方法

块茎蛋白质的稳定化


背景技术：

1.对素食和传统食品的素食类似物的需求增加，这主要是由于对肉源食品带来的环境负担的认识提高。然而，植物性蛋白质在各个方面仍不能与动物源性产品竞争。一个原因是，在制备成食品产品之前，植物性蛋白质往往必须经过分离和加工。这种分离可以是以凝固的形式，这是最具成本效益的方法，但是这也会导致蛋白质损失所有的功能特性。天然蛋白质具有众多特性，这使得其在食品或饲料工业中的使用比凝固蛋白质更令人感兴趣。然而，分离天然蛋白质更麻烦。
2.在分离天然蛋白质并将其加工成食品期间，优选使用在溶液中的蛋白质。处理粉末本质上比处理溶液更困难，特别是在大规模上。与使用蛋白质粉末相比，使用蛋白质溶液具有易于配量、有效泵送和更快清洁的优势。但是为了避免处理过量的流体，优选使用浓缩的而不是稀释的蛋白质溶液。
3.处理根或块茎天然蛋白质溶液，特别是浓缩的溶液(例如具有至少5wt.％蛋白质浓度的溶液)的一个问题是，在这种溶液中，蛋白质具有形成凝胶的倾向。一旦凝胶化，浓缩的溶液甚至比粉末更难处理。凝胶化的蛋白质溶液只能困难地从容器中取出，不能再泵送或倾倒，因此难以加工。据此，希望找出避免浓缩的蛋白质溶液凝胶化的方法。
4.传统上，通过各种工艺从根或块茎中分离根或块茎天然蛋白质。这类工艺通常包含至少一个需要升高温度(例如高于40℃的温度)的步骤。
5.例如，在从马铃薯淀粉废物流中分离块茎蛋白质时，从马铃薯汁中分离淀粉和纤维之后通常是浓缩脱淀粉汁以促进和改进蛋白质分离的效率的步骤。实现浓缩的成本效益的方法通常包含热处理至至少40℃。此外，从含有天然马铃薯蛋白质的液体中去除配糖生物碱通常在42℃的温度下进行
6.另外，马铃薯淀粉加工流通常暴露于来自机械装置(例如脱水机、泵、水力旋流器、分离器和倾析器)的废热中。这显著提高了汁的温度。例如，筛分块茎果肉以从汁中分离纤维会将温度升高5-10℃。从汁中分离淀粉的水力旋流器会产生类似的增加，并且马铃薯汁的超滤通常将温度升高3℃或更多。
7.本发明公开了将天然蛋白质暴露于较高温度的结果是增加蛋白质的凝胶化倾向，特别是在蛋白质在溶液中保持较长时间和/或处于高浓度的情况下。因此，本发明提供一种分离天然根或块茎蛋白质的方法，利用该方法可避免形成蛋白质凝胶。
附图说明
8.图1：16wt.％蛋白酶抑制剂的蛋白质溶液在加热至各种温度后长期储存的动态粘度。
9.图2：在环境条件下长期储存时粘度随ph和浓度的变化。a：16wt.％、b：20wt.％、c：24wt.％。
10.图3：作为总暴露温度的函数的动态粘度。
具体实施方式
11.本发明公开了一种分离根或块茎天然蛋白质的方法，所述方法包含至少以下工艺步骤：
12.a)加工根或块茎以获得含根或块茎天然蛋白质的根或块茎加工水；
13.b)从所述根或块茎加工水中分离所述根或块茎天然蛋白质以获得含至少5wt.％根或块茎天然蛋白质的水性溶液，
14.其特征在于，执行所有工艺步骤以防止天然蛋白质暴露于高于40℃的温度中。
15.本发明涉及一种含至少以下工艺步骤的方法：
16.a)加工马铃薯以获得含天然马铃薯蛋白酶抑制剂的马铃薯加工水；
17.b)从所述马铃薯加工水中分离天然马铃薯蛋白酶抑制剂以获得含至少5wt.％天然马铃薯蛋白酶抑制剂作为唯一马铃薯蛋白质类型的ph 2.5-4.0的水性溶液，
18.其特征在于，执行所有工艺步骤以防止所述天然马铃薯蛋白酶抑制剂暴露于高于40℃的温度中。
19.本发明涉及根或块茎天然蛋白质的浓缩的水性溶液，以及从该溶液获得的蛋白质。在这方面，浓缩表示水性溶液包含至少5wt.％，优选至少8wt.％，更优选至少12wt.％，甚至更优选至少15wt.％。然而，蛋白质浓度优选低于24wt.％，优选低于23wt.％，更优选低于22wt.％。优选的浓缩的蛋白质溶液的浓度为5-24wt.％，优选8-20wt.％。
20.通过本方法获得的水性溶液具有比其它浓缩的根或块茎天然蛋白质溶液的稳定性更高的优势。在这方面，稳定性是物理稳定性，其在本文中基本上表示溶液保持其物理特性，最显著的是粘度和颜色等。本文中的粘度是动态粘度，使用thermo haake mars model iii流变仪在25℃下使用实施例中陈述的方案而确定。
21.已经发现，通过在分离根或块茎天然蛋白质期间避免高温暴露而获得的浓缩的蛋白质溶液比经受了高温的相同浓度的相同蛋白质的溶液表现出更少的凝胶化。因此，浓缩的天然蛋白质溶液保持流体，并且是可长时间使用的。这对于加工液体蛋白质溶液具有优势。在本文中，液体和/或可使用的表示浓缩的蛋白质溶液的动态粘度至多为10pa
·
s，优选至多为5pa
·
s。根据本方法获得的浓缩的天然蛋白质溶液能在环境条件下保持数周或数月，同时保持其物理特性，并保持流体和可使用的。
22.不希望受理论束缚，目前认为高于40℃的温度导致稳定蛋白质三维结构的二硫键断裂。结构完整的蛋白质不易凝胶化。其中，二硫键的显著部分被破坏的蛋白质更易凝胶化。因此，在分离天然蛋白质期间避免高温而获得的蛋白质具有不易凝胶化的效果。
23.较高的蛋白质浓度也导致凝胶化的倾向增加。因此，存在于浓缩的溶液中的蛋白质本文定义的未暴露于高温中是特别重要的。
24.通常易于凝胶化的浓缩的溶液能够通过应用分离工艺保持低粘度，其中，执行所有工艺步骤以防止天然蛋白质暴露于高于40℃的温度中。因此，本发明还公开了获得稳定的浓缩的蛋白质溶液的方法，或稳定蛋白质溶液的方法，该方法包含本文陈述的步骤，其特征在于，执行所有工艺步骤以防止天然蛋白质暴露于高于40℃的温度中。
25.出乎意料的是，应用蛋白质未暴露于高于40℃的温度中的分离工艺可及时避免形成凝胶。大多数有凝胶化倾向的物质在暴露于高温后冷却时会发生凝胶化；对于大多数物质，升高温度避免了形成凝胶，或者甚至熔化凝胶。在本发明的根或块茎天然蛋白质的浓缩
的溶液的情况下，在蛋白质溶液的储存期间较低温度防止形成凝胶。因此，加工天然蛋白质溶液应当在低于40℃的温度下执行，并且储存浓缩的蛋白质溶液应当优选在低温下执行(例如在至多25℃、优选至多20℃、更优选至多15℃、甚至更优选至多5℃)，以避免形成凝胶。
26.另外，已经发现还原剂的存在还导致二硫键的断裂，从而增强蛋白质凝胶化的敏感性。然而，添加诸如so2或亚硫酸氢盐的还原剂是加工马铃薯以防止马铃薯汁褐变的常见做法。
27.因此，在一些实施方案中，本发明提供分离蛋白质、获得稳定的浓缩的蛋白质溶液或稳定蛋白质溶液的方法，其中，最终溶液中亚硫酸盐的量低于800ppm，优选低于500ppm，更优选低于200ppm，甚至更优选低于100ppm。具有该浓度的亚硫酸盐的溶液也显示出增强的粘度稳定性。优选地，通过防止蛋白质暴露于高于40℃的温度中来实现增强的粘度稳定性，但是通过应用如所描述的低浓度亚硫酸盐来获得增强的粘度稳定性的观点与通过避免蛋白质暴露于高于40℃的温度中来获得增强的粘度稳定性的观点无关。
28.本发明还涉及分离的天然蛋白质，不论是作为浓缩的溶液或干燥所述浓缩的溶液后的蛋白质粉末，该天然蛋白质在结构上(例如在氨基酸顺序、三维结构和功能特性(例如酶活性、在水中的溶解性和/或质地性质)的方面)是完整的。该蛋白质的特征是蛋白质中二硫键的量比经传统加工的蛋白质中的高。
29.在本文中，根或块茎天然蛋白质是从根或块茎中分离的天然蛋白质。它可以称为源自根或块茎的天然蛋白质，或者来自根或块茎的天然蛋白质。术语根或块茎被赋予其常规含义，并且指在任何类型的根或块茎植物中发现的任何根或块茎。优选地，本文中的根或块茎是可食用的根或块茎，其可以在人类食品生产的情况下生长。尽管正常情况下，根或块茎天然蛋白质是指来自一种类型的根或块茎的单一类型的蛋白，或来自一种类型的根或块茎的特定蛋白级分。在特殊情况下，根或块茎天然蛋白质可包含源自两种或更多种类型的根或块茎的天然蛋白质的混合物。
30.优选地，本文中的根或块茎包含马铃薯(solanum tuberosum)、甘薯(ipomoea batatas)、木薯(包括manihot esculenta，m.utilissima，也称为manioc、mandioca或yuca，并且还包括m.palmata、m.dulcis，也称为yuca dulce)、山药(dioscorea spp)和/或芋头(colocasia esculenta)。更优选地，根或块茎是马铃薯、甘薯、木薯或山药，甚至更优选地，根或块茎是马铃薯、甘薯或木薯，甚至更优选地，根或块茎是马铃薯或甘薯，并且最优选地，根或块茎是马铃薯(solanum tuberosum)。
31.因此，优选的根或块茎天然蛋白质是天然马铃薯蛋白质、天然甘薯蛋白质、天然木薯蛋白质、天然山药蛋白质和/或天然芋头蛋白质。
32.优选地，根或块茎天然蛋白质包含天然根或块茎蛋白酶抑制剂、天然根或块茎patatin或含蛋白酶抑制剂和patatin的混合物。含蛋白酶抑制剂和patatin的混合物可称为总根或块茎蛋白质。
33.最优选地，根或块茎天然蛋白质源自马铃薯(solanum tuberosum)，即包含天然马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂、天然马铃薯patatin，或含源自马铃薯蛋白酶抑制剂和源自马铃薯patatin的混合物。这种混合物可称为总马铃薯蛋白。
34.在本文中，天然是蛋白质加工领域中传统上已知的术语。在其自然环境中发生的
蛋白质被认为是天然的。当从其自然环境中分离蛋白质时，蛋白质容易降解和/或变性，即至少在一定程度上失去其三维结构和功能性。因此，天然蛋白质表示未显著降解和未显著变性的蛋白质。因此，本文中的天然蛋白质基本上保留其天然酶活性和其天然三维结构。
35.蛋白质的天然度可通过溶解实验来测试。与天然蛋白质相比，非天然蛋白质在水中的溶解性较低。蛋白质溶解度可通过将蛋白质分散在水中，将所得液体分成两个级分，并将一个级分以800g离心5min以产生不溶解的材料的颗粒，并回收上清液来确定。通过测量上清液和未经处理的溶液中的蛋白质含量，并将上清液的蛋白质含量表示为未经处理的溶液中的蛋白质含量的百分比，以确定溶解度。确定蛋白质含量的方便方法是通过sprint rapid蛋白质分析仪(cem)测量在280nm处的吸光值。在本文中，如果蛋白质的溶解度为至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％，则蛋白质被认为是天然的。
36.如本文所定义的，patatin是根或块茎蛋白质，优选马铃薯蛋白质，其是在块茎中起储存蛋白质作用的酸性糖蛋白。在根和块茎加工工业中，通常知道哪些根或块茎蛋白质被认为是patatin。在本文中，patatin是指根或块茎蛋白质级分，其中至少80wt.％，优选至少85wt.％，更优选至少90wt.％的所有蛋白质具有通过sds-page确定的大于35kda的分子量。
37.如本文所定义的蛋白酶抑制剂是根或块茎蛋白质，优选马铃薯蛋白质，其天然形式能够抑制蛋白酶的蛋白酶活性。哪些根或块茎蛋白质被认为是蛋白酶抑制剂是众所周知的。在本文中，蛋白酶抑制剂是指根或块茎蛋白质级分，其中至少80wt.％，优选至少85wt.％，更优选至少90wt.％的所有蛋白质具有通过sds-page确定的至多35kda的分子量。
38.sds-page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)是确定蛋白质分子量的熟知技术。
39.在本文中，分离根或块茎天然蛋白质表示从根或块茎中提取如上定义的在根或块茎中以天然形式存在的蛋白质而不显著影响该蛋白质。因此，天然蛋白质没有显著降解，也没有显著变性。也就是说，与存在于根或块茎中的蛋白质相比，氨基酸顺序、三维结构和功能特性基本上是完整的。
40.在优选的实施方案中，本发明的工艺应用于作为唯一类型的根或块茎蛋白质的根或块茎天然蛋白质。含作为唯一类型的根或块茎蛋白质的根或块茎patatin的溶液不包含patatin定义以外的其他类型的根或块茎蛋白质。同样地，含根或块茎蛋白酶抑制剂作为唯一类型的根或块茎蛋白质的溶液不包含蛋白酶抑制剂定义以外的其他类型的根或块茎蛋白质。在这些实施方案中，本发明允许获得纯的根或块茎patatin分离物，或纯的根或块茎蛋白酶抑制剂分离物(例如马铃薯蛋白酶抑制剂分离物)。然而，也可以执行该工艺以获得含蛋白酶抑制剂和patatin的根或块茎天然蛋白质分离物。
41.含根或块茎patatin作为唯一类型的根或块茎蛋白质的溶液可以通过已知方法获得(例如通过选择性吸附蛋白酶抑制剂)。含根或块茎蛋白酶抑制剂作为唯一类型的根或块茎蛋白质的溶液可以通过已知的方法获得(例如通过选择性沉淀patatin和/或选择性吸附patatin)。在wo2008/069650中描述了如何实现选择性吸附patatin或蛋白酶抑制剂。
42.如本领域熟知的，浓缩的蛋白质溶液可进一步包含源自根或块茎的各种其它成分(例如淀粉、纤维、细胞碎片、糖类、盐类等)。然而，优选地，浓缩的蛋白质溶液包含或多或少
的纯天然蛋白质，例如包含基于总干物质(dm)的至少50wt.％蛋白质，优选至少75wt.％dm，更优选至少85wt.％dm，甚至更优选至少90wt.％dm，最优选至少95wt.％dm蛋白质。蛋白质的量能使用cem sprint rapid蛋白质分析仪确定。
43.为了获得浓缩的根或块茎天然蛋白质溶液，必须执行至少两个步骤。必须加工根或块茎以获得含天然蛋白质的根或块茎加工水(步骤a)，并且必须从所述加工水中分离所述天然蛋白质以获得根或块茎天然蛋白质的浓缩的溶液(步骤b)。两个步骤基本上都是已知的步骤。然而，已经发现，为了获得具有稳定物理特性的浓缩的蛋白质溶液，应当执行这些步骤和可以应用的任何其它任选步骤以防止天然蛋白质暴露于高于40℃的温度中。
44.因此，在本文中，任何蛋白质溶液或悬浮液不应在高于40℃的温度中加工，并且将溶液加工成粉末不应在高于40℃的温度中执行。
45.使用较高加工温度限于蛋白质不受应用热量影响的情况。例如，可以对整个马铃薯进行短暂的热暴露，而不影响马铃薯内部的蛋白质。这是因为在这种处理的情况下，马铃薯的内部没有足够快地加热到超过40℃。因此，尽管在高于40℃的温度中执行这些步骤，但是诸如漂白、灭菌和蒸汽去皮之类的短暂热暴露步骤能包含在本方法中的步骤中。
46.然而，优选地，在本文中分离蛋白质的所有工艺步骤在低于40℃的温度中执行，和/或没有一个工艺步骤应用高于40℃的温度。
47.为了达到本文所述的有利效果，优选将蛋白质的总温度暴露(total temperature exposure)保持在最小。总温度暴露被定义为时间(以小时为单位)和温度(以℃为单位，因为水在0℃下冻结)的乘积，并且被称为tte。优选地，tte小于250℃
·
hr，更优选地小于200℃
·
hr。
48.在步骤a中，加工根或块茎以获得含天然蛋白质的根或块茎加工水。天然蛋白质是存在于原生的根或块茎中的蛋白质，其溶解在加工水中。这种加工包含例如制浆、捣碎、锉磨、研磨、压制或切割根或块茎，以及任选地与水的组合。
49.在优选的实施方案中，将经加工(制浆、捣碎、磨碎、研磨、压制、切割等)的根或块茎与水结合以获得含天然蛋白质和淀粉的根或块茎汁。可对这种加工水进行淀粉去除的步骤(例如通过本领域已知的倾析、旋流或过滤)，以获得含天然蛋白质的根或块茎加工水。在这些实施方案中，根或块茎加工水优选是来自淀粉工业的废物(例如在淀粉分离之后获得的马铃薯汁(pfj))。
50.在其它优选实施方案中，通过切割来加工根或块茎以形成根或块茎的形状，该形状是经加工的根或块茎产品(如薯片和薯条)的基础。在存在水的情况下执行这种切割产生含根或块茎的天然蛋白质的根或块茎加工水。
51.在一个实施方案中，可通过水喷射流切割根或块茎来加工根或块茎。在另一个实施方案中，例如在水的存在下，可通过切割刀来加工根或块茎。这种来自切割工艺的水包含根或块茎天然蛋白质，因此是步骤a意义上的根或块茎加工水。
52.根据步骤a的加工能在整个根或块茎上或者在已去皮的根或块茎上进行。
53.在步骤b中，从根或块茎加工水中分离出根或块茎天然蛋白质以获得含根或块茎天然蛋白质的浓缩的水性溶液。实现这一点的方法基本上是熟知的。从加工水中分离蛋白质的优选方法包括超滤、渗滤、等电沉淀、热沉淀、络合、吸附或色谱法，或者这些方法中的两种或更多种的结合。任选地，所述分离步骤后是浓缩步骤(例如通过超滤、渗滤、反渗透或
冷冻浓缩)，以获得所述根或块茎天然蛋白质的浓缩的溶液。
54.分离天然蛋白质的优选技术是使用超滤(uf)。超滤分离分子量范围为5kda至500kda的溶质，因此能用于从低分子量溶质中分离蛋白质。uf膜可具有直径范围为1至20nm的孔。优选的uf膜是各向异性uf膜。优选地，超滤膜包括聚偏二氟乙烯、再生纤维素、聚醚砜(pes)或聚砜(ps)。uf膜可以管式、螺旋缠绕、中空纤维、板和框架，或作为交叉旋转诱导的剪切改变单元来实施。
55.超滤膜保留大分子的能力传统上是根据其分子截留值(mwco)来说明的。10kda的mwco值表示膜能从进料溶液中保留90％的分子量为10kda的分子。本文中优选的mwco是1-300kda膜，优选2-250kda，更优选3-200kda，更优选5-150kda。在一些实施方案中，使用5-20kda膜，优选5-10kda。在其它实施方案中，使用30-200kda膜，优选50-150，更优选80-120。
56.优选使用具有如上定义的分子量截留值的pes或ps膜以获得蛋白酶抑制剂。可在ph 3-7，优选3.2-4.5中对蛋白酶抑制剂进行uf。
57.优选使用具有如上定义的分子量截留值的pes、ps或再生纤维素膜以获得patatin。可以在ph值4.0-8.0，优选ph6.0-7.5中对patatin进行uf。在除去杂质之后，ph可以增加到ph 7-10以使得高通量通过膜。在本发明中，如下所述，分离步骤之后优选地是ph调节步骤。
58.蛋白质分离的另一优选技术是渗滤(df)。可以通过与超滤相同的膜对水或盐溶液，优选盐溶液实现渗滤。渗滤后优选地是浓缩步骤(例如超滤或反渗透，优选超滤)。
59.在优选的实施方案中，浓缩后获得的根或块茎天然蛋白质的蛋白质含量大于干物质含量的75％。这里的蛋白质含量定义为凯氏氮含量乘以6.25。蛋白质含量以干物质表示，其优选大于80％，更优选大于85％，甚至更优选大于90％，甚至更优选大于95％。
60.可通过如ep2083634、wo2014/011042中所描述的吸附和洗脱或者本领域已知的其它方法执行蛋白质的分离。
61.此外，可通过色谱法(如本领域已知的阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法)分离根或块茎天然蛋白质。分离根或块茎天然蛋白质的其它技术包括本领域已知的等电聚焦、等电沉淀和络合。
62.本方法优选应用于工业规模上。因此，优选操作本方法以产生每小时至少5kg蛋白质，更优选每小时至少25kg蛋白质，甚至更优选每小时至少50kg蛋白质。
63.本方法可包含其它工艺步骤，如本文所定义的，只要执行这些工艺步骤以防止蛋白质暴露于高于40℃的温度中。
64.在一个实施方案中，该方法进一步包含配糖生物碱去除的步骤。这可以通过已知的方式(例如吸附到活性炭、疏水性树脂或各种类型的粘土、通过色谱法、通过酸萃取、通过酶转化或通过发酵)来实现。示例性技术描述在wo2008/056977和wo2008/069651中。
65.在另一个实施方案中，该方法可包含絮凝的步骤，以便除去脂类和微粒等。例如，絮凝可如wo2016/036243中所描述的执行。
66.该方法可进一步包含过滤的步骤，优选微过滤。
67.此外，该方法可包含各种其它已知步骤以帮助分离蛋白质、淀粉或其它根或块茎成分。例如，该方法可包含一个或更多个过滤步骤、一个或更多个ph调节步骤、一个或更多个离心步骤以及旋流。如本领域熟知的，可以通过添加酸或碱来调节溶液的ph。合适的酸是
例如盐酸、柠檬酸、乙酸、甲酸、磷酸、硫酸和乳酸，而合适的碱是例如氢氧化钠或氢氧化钾、氯化铵、碳酸钠或碳酸钾、钙和镁的氧化物和氢氧化物。
68.为了稳定浓缩的根或块茎天然蛋白质溶液的物理特性，进一步优选浓缩的根或块茎天然蛋白质溶液的ph高于2.5，优选高于2.75。该实施方案适合于任何根或块茎天然蛋白质，但特别适合于根或块茎蛋白酶抑制剂，特别是马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂。如所描述的，该ph值可通过适当添加酸或碱获得。
69.为了稳定浓缩的根或块茎天然蛋白质溶液的物理特性，进一步优选浓缩的根或块茎天然蛋白质溶液的ph低于4.0，优选低于3.5，优选低于3.25，更优选低于3.0。该实施方案适合于任何根或块茎天然蛋白质，但特别适合于源自根或块茎的patatin和蛋白酶抑制剂，特别是源自马铃薯的蛋白酶抑制剂。如所描述的，该ph值可通过适当添加酸或碱获得。
70.为了稳定含蛋白酶抑制剂和/或patatin的浓缩的根或块茎天然蛋白质溶液的物理特性，非常优选浓缩的溶液的ph高于2.5，优选高于2.75，并且低于3.5，优选低于3.25，更优选低于3.0。如所描述的，该ph值可通过适当添加酸或碱获得。
71.在小于4.0、优选2.5-4.0、更优选2.5-3.5的ph中稳定蛋白质溶液具有减少微生物生长并因此增加溶液的微生物稳定性的额外益处。
72.此外，优选地，含蛋白酶抑制剂和/或patatin的浓缩的根或块茎天然蛋白质溶液的亚硫酸盐浓度小于800ppm，优选小于500ppm，优选小于200ppm，优选小于100ppm。
73.在非常优选的实施方案中，该方法进一步包含干燥浓缩的溶液的步骤。干燥步骤是熟知的，并且可以包含蒸发(evaporation)、喷雾干燥(spray drying)、冷冻干燥(freeze drying)等。这种干燥产生根或块茎天然蛋白质粉末，该粉末更不容易凝胶化。
74.此外，本发明涉及天然蛋白酶抑制剂，其中，二硫键的量为4
–
8g/kg，表示为每kg蛋白质中以二硫键形式存在的g半胱氨酸。
75.此外，本发明涉及天然patatin，其中，二硫键的量为6
–
24g/kg，表示为每kg蛋白质中以二硫键形式存在的g半胱氨酸。
76.本发明还涉及根或块茎天然蛋白质，其中二硫键的量为4-24g/kg，优选6-24g/kg，更优选12-24g/kg，甚至更优选18g/kg，表示为每kg蛋白质中以二硫键形式存在的g半胱氨酸。二硫键的量取决于天然蛋白质的种类。蛋白酶抑制剂包含4-8g/kg二硫键，但patatin包含6-24g/kg二硫键。二硫键的量优选为40-235mmol/kg蛋白质，更优选60-235mmol/kg蛋白质，甚至更优选120mmol/kg蛋白质，甚至更优选180mmol/kg蛋白质。具有上述量的二硫键的蛋白质不易凝胶化，特别是在存在于浓缩的溶液中的情况下。
77.每单位蛋白质的二硫键的量可以通过确定游离硫醇浓度，然后还原二硫键来测量。随后定量额外暴露的硫醇以提供存在于样本中的二硫键的量。这可以根据需要表示为g半胱氨酸/kg蛋白质，或mol半胱氨酸/kg蛋白质。
78.可以用分光光度法定量游离硫醇，通过将样本与例如ellmans试剂(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，dtnb)、4,4'-二硫代二吡啶(4-dps)、一溴双马烷(mbbr)或苯并呋喃(例如7-氟苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-磺酸盐(sbd-f)或4-(氨基磺酰基)-7-氟-2,1,3-苯并恶二唑(abd-f))反应。
79.优选地，所述蛋白质具有至多200mg/kg dm的配糖生物碱含量，更优选至多100mg/kg dm，甚至更优选50mg/kg dm。进一步优选地，所述蛋白质具有如通过sprint测定的基于
总干物质(dm)的至少50wt.％蛋白质，优选至少75wt.％dm，更优选至少85wt.％dm，甚至更优选至少90wt.％dm，和最优选至少95wt.％dm蛋白质的蛋白质含量。
80.在许多优选的实施方案中，所述天然蛋白质是天然马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂、天然源自马铃薯的patatin或含蛋白酶抑制剂和patatin的天然总马铃薯蛋白质。
81.此外，本发明提供了一种含如上定义的根或块茎天然蛋白质的食品或饲料产品。优选地，该食品或饲料产品包含0.1-10wt.％的天然蛋白质，更优选0.5-5wt.％。这种食品或饲料产品的优势在于，出于常规原因可以包括根或块茎天然蛋白质，但提供更少的凝胶倾向，特别是在以高浓度存在的情况下。
82.此外，本发明关于根或块茎patatin能用以下项(term)描述：
83.1、一种分离根或块茎天然patatin的方法，所述方法包含至少以下工艺步骤：
84.a)加工根或块茎以获得含根或块茎天然patatin的根或块茎加工水；
85.b)从所述根或块茎加工水中分离所述根或块茎天然patatin以获得ph小于3.5的水性溶液，所述水性溶液包含至少5wt.％的根或块茎天然patatin作为唯一类型的马铃薯蛋白质，
86.其特征在于，执行所有工艺步骤以防止天然蛋白质暴露于高于40℃的温度中。
87.2、根据项1所述的方法，其中，操作所述方法以产生每小时至少5kg蛋白质。
88.3、根据项1或2所述的方法，其中，所述水性溶液的所述ph高于2.5，优选高于2.75。
89.4、根据项1-3中任一项所述的方法，其中，所述水性溶液的所述ph低于3.25。
90.5、根据项1-4中任一项所述的方法，其中，用于获得根或块茎加工水的所述加工包含对根或块茎进行制浆、捣碎、锉磨、研磨、压制或切割，以及任选地与水的组合。
91.6、根据项1-5中任一项所述的方法，其中，所述加工进一步包含淀粉去除的步骤。
92.7、根据项1-6中任一项所述的方法，其中，所述分离所述根或块茎天然patatin包含超滤、渗滤、吸附、沉淀或色谱法的步骤。
93.8、根据项1-7中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包含配糖生物碱去除步骤。
94.9、根据项1-8中任一项所述的方法，其中，所述根或块茎天然patatin是天然马铃薯patatin、天然甘薯patatin、天然木薯patatin、天然山药patatin或天然芋头patatin。
95.10、根据项1-9中任一项所述的方法，其中，所述根或块茎天然patatin包含天然马铃薯patatin。
96.11、根据项1-10中任一项所述的方法，其中，干燥所述水性溶液以获得根或块茎天然patatin粉末。
97.12、根据项1-11中任一项所述的方法，其中，总温度暴露(tte)小于250℃
·
hr，优选小于200℃
·
hr。
98.13、由项1-12中任一项所获得的根或块茎天然patatin，其中，二硫键的量为6-24g/kg，表示为每kg蛋白质中以二硫键形式存在的半胱氨酸g。
99.14、根据项13所述的根或块茎天然patatin，所述根或块茎天然patatin的配糖生物碱的含量为至多200mg/kg蛋白质。
100.15、一种人类食品或动物饲料产品，所述人类食品或动物饲料产品包含根据项13-14中任一项所述的根或块茎天然patatin。
101.本发明关于根或块茎总蛋白质还可以用以下项描述：
102.1、一种分离根或块茎天然蛋白质的方法，其中，所述方法包含至少以下工艺步骤：
103.a)加工根或块茎以获得含根或块茎天然蛋白质的根或块茎加工水；
104.b)从所述根或块茎加工水中分离所述根或块茎天然蛋白质以获得含至少5wt.％的根或块茎天然蛋白质的ph 2.5-4.0的水性溶液，其中，所述根或块茎天然蛋白质包含天然patatin和天然蛋白酶抑制剂，
105.其特征在于，执行所有工艺步骤以防止天然蛋白质暴露于高于40℃的温度中。
106.2、根据项1所述的方法，其中，操作所述方法以产生每小时至少5kg蛋白质。
107.3、根据项1或2所述的方法，其中，所述水性溶液的ph高于2.75。
108.4、根据项1-3中任一项所述的方法，其中，所述水性溶液的ph低于3.5。
109.5、根据项1-4中任一项所述的方法，其中，用于获得根或块茎加工水的所述加工包含对根或块茎进行制浆、捣碎、锉磨、研磨、压制或切割，以及任选地与水的组合。
110.6、根据项1-5中任一项的所述方法，其中，所述加工进一步包含淀粉去除的步骤。
111.7、根据项1-6中任一项所述的方法，其中，根或块茎天然蛋白质的所述分离包含超滤、渗滤、吸附、沉淀或色谱法的步骤。
112.8、根据项1-7中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包含配糖生物碱去除步骤。
113.9、根据项1-8中任一项所述的方法，其中，所述根或块茎天然蛋白质是天然马铃薯蛋白质、天然甘薯蛋白质、天然木薯蛋白质、天然山药蛋白质或天然芋头蛋白质。
114.10、根据项1-9中任一项所述的方法，其中，干燥所述水性溶液以获得根或块茎天然蛋白质粉末。
115.11、根据项1-10中任一项所述的方法，其中，总温度暴露(tte)小于250℃
·
hr，优选小于200℃
·
hr。
116.12、一种根或块茎天然蛋白质，其包含能通过项1-11中任一项所获得的天然蛋白酶抑制剂和天然patatin，其中，二硫键的所述量为4-24g/kg，表示为每kg蛋白质中以二硫键形式存在的半胱氨酸g。
117.13、根据项12所述的根或块茎天然蛋白质，其中，所述根或块茎天然蛋白质的配糖生物碱的含量为至多200mg/kg蛋白质。
118.15、一种人类食品或动物饲料产品，所述人类食品或动物饲料产品包含根据项12-13中任一项所述的根或块茎天然蛋白质。
119.为了清楚和简明的描述，在此将特征描述为相同或单独实施方案的一部分，然而，应当理解，本发明的范围可包括具有所描述的全部或一些特征的结合的实施方案。本发明现在将通过以下非限制性实施例来说明。
120.实施例
121.动态粘度是使用thermo haake mars model iii流变仪确定的，该流变仪装备有z40转子din 53019/iso 3219(rv/rs/mars的低惯性)和z40杯使用haake rheowin软件。通过在以下三个阶段应用方案，在25℃下测量蛋白质浓缩物的动态粘度(η)：
122.1)振荡(f＝0.100hz)
123.2)提高剪切速率(0.1-1000 1/s)
124.3)降低剪切速率(1000～0.1 1/s)
125.以最低剪切速率在步骤2)中确定的值作为动态粘度(η)的量度(pa
·
s)。在粘度为10pa
·
s或更低的情况下，溶液被认为是可使用的并且是流体。
126.使用根据凯氏定氮法校准的cem sprint rapid蛋白质分析仪确定蛋白质浓度。sprint测量蛋白质结合染料的信号损失。损失越高，存在的蛋白质越多。该系统使用凯氏定氮法对广泛透析的蛋白质样本进行校准，因此检测到的所有氮都来自蛋白质，而不是来自游离氨基酸、肽或其他氮源。然后通过乘以6.25将氮数转换为蛋白质含量。
127.实施例1
128.研磨马铃薯并在15-25℃之间的温度中执行所有的工艺步骤的情况下对其进行淀粉去除。得到的马铃薯汁使用ep 1920662中描述的方法2加工以产生分离的蛋白酶抑制剂。
129.获得浓度为16wt.％的分离的马铃薯蛋白质，将ph调节至2.8，并且将蛋白质溶液在35℃、39℃、43℃、47℃的温度下暴露四小时，并储存在环境条件(20-25℃)下。在储存之前(第0周)和在1、2、4、9、18和52周之后确定粘度。
130.结果表明，未经受高于40℃温度的材料保持其物理稳定性(在动态粘度的方面)并保持流体和可使用的。经受高于40℃温度的材料形成凝胶，由于其到达后无法再加工，所以不能储存或运输。同样参见图1。
131.表1：ph2.8 16wt.％马铃薯蛋白酶抑制剂浓缩物经不同热处理后，长期储存在环境温度下的动态粘度([pa
·
s])
[0132][0133]
实施例2
[0134]
将实施例1中获得的浓度为16wt.％的马铃薯蛋白酶抑制剂在30℃、33℃、36℃、39℃的温度中暴露3、6或12小时。随后，蛋白质储存在环境条件(20-25℃)下，并在一天后确定粘度。
[0135]
结果表明较高的温度和较长的暴露时间使得凝胶化的倾向增加。不仅应当最小化工艺温度，而且应当最小化蛋白质暴露于较高温度的时间。
[0136]
表2：ph2.8 16wt.％马铃薯蛋白酶抑制剂浓缩物经不同热处理后第二天的动态粘度([pa
·
s])
[0137]
时间/温度：30℃33℃36℃39℃00.020.020.020.0230.20.70.82.260.56.111.620.61215.342.862.583.4
[0138]
实施例3
[0139]
通过超滤浓缩实施例1中获得的马铃薯蛋白酶抑制剂以获得16wt.％、20wt.％和24wt.％的蛋白质浓缩物。随后，将ph值调节至2.5、2.75和3.0，并将溶液储存在环境条件
(20-25℃)下。在1、2、4、9、18、52周后确定溶液的粘度。
[0140]
结果表明该蛋白的凝胶化倾向是依赖于ph和浓度的。优选ph高于2.5，更优选高于2.75。同样，凝胶化倾向是依赖于浓度的。蛋白质浓度优选低于24wt.％以保持流体和可加工的。还参见图2a(16wt.％)、图2b(20wt.％)和图2c(24wt.％)。
[0141]
表3：储存在不同ph值下的16wt.％、20wt.％、24wt.％马铃薯蛋白酶抑制剂浓缩物的动态粘度([pa
·
s])
[0142][0143][0144]
实施例4
[0145]
合并实施例1、2和3的结果以了解温度历史与蛋白质凝胶化倾向的相关性。从暴露的时间和温度计算蛋白质材料的总暴露温度。时间-温度产物称为总温度暴露(tte)，其针对粘度绘制。参见图3。
[0146]
结果表明，蛋白质样本的tte是其凝胶化倾向的重要预测因子。优选地，tte小于250℃
·
hr，更优选地小于200℃
·
hr。
[0147]
表4：对于实施例1-3中的所有数据，以动态粘度([pa
·
s])作为tte的函数。
[0148][0149]
实施例5
[0150]
研磨马铃薯并在15至25℃之间的温度中执行所有工艺步骤以对其进行除去淀粉。
得到的马铃薯汁使用ep 1920662中描述的方法1加工以分离马铃薯蛋白质patatin的溶液。
[0151]
将溶液稀释至8wt.％的浓度，并用盐酸调节至ph值为3.5、3.0、2.7、2.3、2.0和1.7，并在环境温度(20-25℃)中储存6天。目视确定粘度以评估5小时、22小时和5天后的凝胶形成。
[0152]
结果表明ph是该蛋白质的凝胶形成的合理预测因子。为了保持可工作的，ph必须低于3.5，优选低于3.0。
[0153]
表5：不同ph下在环境温度中储存5小时、22小时和6天后的粘度
[0154]
ph5小时22小时6天3.5液体凝胶凝胶3.0液体凝胶凝胶2.7液体液体凝胶2.3液体液体液体2.0液体液体液体1.7液体液体液体
[0155]
实施例6
[0156]
实施例1中获得的马铃薯蛋白酶抑制剂在16wt.％的浓度下使用。随后，将ph值调节到3.3，并且加入亚硫酸氢钠以达到所示浓度，并在环境温度或40℃中储存。一天后测量溶液的粘度。
[0157]
表6：在ph 3.3、各种亚硫酸盐浓度下在环境温度或40℃中储存一天后的粘度
[0158] 环境温度40℃ppm亚硫酸盐粘度pa*s粘度pa*s00.020.22100.020.22250.020.251000.041.67
[0159]
表6中的结果表明马铃薯蛋白质溶液的粘度是依赖于温度的。较高的亚硫酸盐浓度使得储存时粘度增加，并且这种效应在较高的温度下更强。
[0160]
实施例7
[0161]
在不同的实验中研究了亚硫酸盐对patatin的影响，尽管蛋白质浓度较低，但亚硫酸盐水平较高。软化水稀释实施例5中获得的马铃薯蛋白质(patatin)溶液至浓度约5.3wt.％。在剧烈搅拌下加入浓缩的柠檬酸溶液(1/10份40％柠檬酸)。将溶液分成两份，并且加入6％的so2溶液，使最终的亚硫酸盐浓度达到0.9g/l。作为对照，加入相同体积的去离子水。用10m hcl将ph设定为1.8-1.9。使用cem sprint rapid蛋白质分析仪确定最终蛋白质含量。
[0162]
表7：在环境温度(20-25℃)中储存1天和6天后不同亚硫酸盐浓度的粘度
[0163]
样本蛋白质浓度亚硫酸盐1天6天15.30％900ppm液体凝胶25.37％0ppm液体液体
[0164]
结果清楚地显示了亚硫酸盐的存在对patatin蛋白质溶液的稳定性的负面影响。