用于麸质降解的包含至少一种芽孢杆菌属和乳杆菌属菌株的细菌聚生体的制作方法

用于麸质降解的包含至少一种芽孢杆菌属和乳杆菌属菌株的细菌聚生体
1.本发明涉及包含作为活细胞或其细胞质提取物的属于芽孢杆菌属物种(bacillus sp.)、乳杆菌属物种(lactobacillus sp.)和片球菌属物种(pediococcus sp.)的益生菌菌株以及蛋白酶的制剂，以及其用于在人中和在生产用于人和动物的食品期间的安全的麸质降解的用途。
2.麸质是谷物例如小麦、黑麦和大麦的主要蛋白质网络。麸质包括单体的α-麦醇溶蛋白、γ-麦醇溶蛋白、ω-麦醇溶蛋白，其携带具有免疫原性和/或毒性潜能的肽序列(最突出的例子列在表1中)。
3.表1：免疫原性麦醇溶蛋白肽
4.麦醇溶蛋白位置序列α9-麦醇溶蛋白57-68qlqpfpqpqlpya-麦醇溶蛋白62-75pqpqlpypqpqsfpy-麦醇溶蛋白134-153qqlpqpqqpqqsfpqqqrpfα2-麦醇溶蛋白57-89lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf
5.麦醇溶蛋白的不完全消化可以释放出这些肽，从而在易感个体中导致不利反应。文献也显示了免疫原性肽从麦谷蛋白(构成麸质的另一蛋白质级分)中的释放。麸质相关病症的范围包括乳糜泻(cd)、小麦变态反应(wa)、非乳糜泻麸质敏感(non-celiac gluten sensitivity；ncgs)和麸质敏感性肠易激惹综合征[1]。虽然这些病症具有致病差异，但是它们显示出相关的症状，并且因为它们是不可治愈的而因此通过回避麸质/包含麸质的食品来进行治疗。此外，已提出各种其他健康状况(例如，精神分裂症、特应性、纤维肌痛、子宫内膜异位症、肥胖症、非特异性胃肠综合征)受益于麸质回避[2]。这些事实解释了无麸质膳食(gfd)的兴起；并且这样的实践也扩展至大量的和越来越多的健康的、无症状的人群。例如，据报道33％的美国人口想要回避麸质，并且报道说41％的运动员群体以多于50％的时间处于gfd[3]。
[0006]
但是，实践gfd与需要在风险和益处评价中考虑的挑战和副作用相关联，尤其是当不存在明确的指示需要维持gfd时，即在麸质回避是一种生活方式选择而不是医学需要时。gfd经常是失衡的，例如由于谷物产品的回避而具有微量营养物和纤维缺乏，同时卡路里过量并且在许多麸质替代食品中发现糖和饱和脂肪含量增加[4-6]。因此，gfd的潜在危害包括关于儿童和青少年的生长/发育迟缓、各种营养不良相关病症、高脂血症、高血糖症和冠状动脉疾病[6]。此外，长期坚持gfd可以引起肠道微生物组生态失调和随后的不利健康效应[7]。
[0007]
gfd目前是用于cd、wa和ncgs患者的唯一的有效疗法。特别是对于cd，麸质或相似蛋白质的摄取是关于该疾病发展和加重的触发剂，由此麸质摄取的严格回避具有至关重要性。但是，即使被认为或声称无麸质的食品产品也经常包含高于麸质摄入的安全界限(对于cd患者，典型地《20ppm)的麸质的量(痕量)。为了确保对于cd患者的食品安全，已经设想了策略以支持麸质回避或解毒。麸质的肠道命运和对于它的生理学应答的一个关键决定因素
是肠道微生物区系，如已经从用经差异移殖建群的小鼠的实验[8]和从来自cd患者与来自健康个体的微生物区系的比较[9,10]所揭示的那样。与此相符，已经开发了几项靶向微生物区系的技术，旨在改善麸质相关病症。这些技术可以归类为：1.口服应用乳杆菌属物种或双歧杆菌属物种(bifidobacterium spp.)以纠正与gfd或麸质相关病症相关联的生态失调；2.口服应用乳杆菌属物种或双歧杆菌属物种，作为通过不明机制的对于麸质相关病症的非特异性支持；3.口服应用乳杆菌属物种或双歧杆菌属物种以支持麸质的降解；4.口服应用肽水解酶以支持麸质的降解(“麸质酶(glutenase)”)。毒性/免疫原性的麸质表位的降解需要肽酶pepn、pepo、pepi、pepx、pepp的联合活性[11]。
[0008]
最近，根据zheng j,wittouck s,salvetti e,cmap franz hmb,harris p,mattarelli pw,o’toole b,pot p,vandamme j,walter k,watanabe s,wuyts ge,felis mg,ganzle a和lebeer s,2020.ataxonomic note on the genus lactobacillus:description of 23novel genera,emended description of the genus lactobacillus beijerinck1901,and union of lactobacillaceae and leuconostocaceae.international journal of systematic and evolutionary microbiology.https://doi.org/10.1099/ijsem.0.004107，已经更新了乳杆菌属的几个物种的分类学分类。在本发明的情景中特别相关的是下列物种：
[0009][0010]
au2015261774 aa要求保护干酪乳杆菌(干酪乳干酪杆菌)ipla12038用于预防或治疗cd的用途。该菌株已被描述为在12小时内降解一定量的33-聚体，但不是任何其他重要的免疫原性肽，并且具有下列酶促活性：pepn 8.03meu/mg；pepq 9.5meu/mg；pepi 0.58meu/mg；pepx 3.19meu/mg。该菌株在酸性条件(ph《3.0)不存活，并且因此不提供对于麸质相关病症的技术解决办法。
[0011]
wo2017139659 a1要求保护来自罗氏菌属(rothia)物种的枯草杆菌蛋白酶对于xpq基元和仅两种免疫原性肽(33-聚体和26-聚体)的切割。
[0012]
au2008341708 aa要求保护长双歧杆菌(bifidobacterium longum)cect 7347在治疗麸质相关病症中的用途；未提及该菌株的任何针对麸质或其中的关键性表位的肽酶或蛋白酶活性。
[0013]
wo17134240 a1要求保护包含普拉氏栖粪杆菌(faecalibacterium prausnitzii)、鸡盲肠丁酸球菌(butyricicoccus pullicaecorum)、食胰岛素罗斯伯里氏菌(roseburia inulinivorans)、人罗斯伯里氏菌(roseburia hominis)、嗜粘蛋白阿克曼
氏菌(akkermansia muciniphila)、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)和泄物嫌气棒状菌(anaerostipes caccae)这些物种的组合物，其用于治疗cd。
[0014]
us2017000830 aa要求保护包含乳球菌属(lactococcus)物种和用于改善麸质敏感的酶的组合物。francavilla等人报道了在应用来自乳杆菌属和双歧杆菌属的五种菌株的组合后，处于gfd的cd患者的肠易激惹综合征(ibs)样症状的改善[12]。该治疗与肠道微生物区系组成的变换相关联；但是，未报道所述菌株对于麸质消化的效应。同时，同一小组评估了乳杆菌属菌株的体外肽酶活性，其中对于植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)和干酪乳杆菌(干酪乳干酪杆菌)这些物种的菌株显示出直至10mu/mg(对于pepn)、10mu/mg(对于pepi)、5mu/mg(对于pep)、25mu/mg(对于pepq)的活性[13]。这些菌株中的十种菌株的联合应用导致在24小时的温育后在表1中所列出的麦醇溶蛋白表位的水解。未测定在胃和小肠条件下所述菌株的存活，因此无法预测这些菌株对于在人的胃肠道中麸质消化的有效性。
[0015]
herran等人从人的小肠中分离出了27种属于唾液乳杆菌(l.salivarius)、鼠李糖乳杆菌、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)、干酪乳杆菌(干酪乳干酪杆菌)、口乳杆菌(l.oris)、加氏乳杆菌(l.gasseri)、发酵乳杆菌(l.fermentum)、卷曲乳杆菌(l.crispatus)、短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(b.pumilus)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)这些物种的细菌菌株，它们仅在24小时的非常长的温育时间后才显示出针对33-聚体的蛋白水解活性，但没有针对其他肽的蛋白水解活性[14]。类似地，对于人小肠来源的其他菌株(再次包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌这些物种)，发现了针对该表位的弱的活性[15]。
[0016]
ca3069659a1公开了用于用包含真菌酶和从解淀粉芽孢杆菌、短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)、德氏乳杆菌(lactobacillus delbrueckii)、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)和瑞士乳杆菌(lactobacillus helvetivus)这些物种中选择的益生细菌的组合物来制备无麸质面粉的方法。未测定在胃和小肠条件下这些细菌的存活，因此无法预测这些菌株对于在人的胃肠道中麸质消化的有效性。此外，尚未公开由这些组合物消化的麸质的命运；既未评估免疫原性肽的出现或消失，也未评估消化物的免疫原性。
[0017]
已描述了肽水解酶的商业用途，目的是在食品加工期间[16]和在人中[17]使麸质解毒。但是，包含这些酶的相关产品具有很少的功效证据[17]。
[0018]
总而言之，麸质相关病症的问题仍未得到解决，因为所有上面提及的应用都具有几个问题并且还未成功地转化为临床。应用1和2可能仅提供了间接益处，因为并未直接专注处理麸质毒性的根本性问题。应用3迄今为止局限于麸质的离体消化，针对麸质/麦醇溶蛋白蛋白质的仅蛋白酶活性的评估(从而导致仅部分消化)，或在12小时或更长的非常长的温育时间后仅非常少的免疫原性麸质肽的消化的评估。
[0019]
缺乏成功的临床转化可以通过相组合的微生物菌株在胃肠道中的实际条件下差的存活来解释，并且是由于针对在食物基质中的麸质肽的有限活性。
[0020]
用于cd患者的微生物酶治疗(应用4)具有在胃肠穿过期间酶促活性的差的蛋白水解抗性、程度和持续时间的主要限制[18]。此外，它们甚至被认为是危险的，因为它们仅可
以部分地降解麸质并且由此潜在地释放毒性表位[17]。
[0021]
本发明旨在通过基于下列考虑开发出创新的和有效的技术来克服这些限制：
[0022]
■
在人消化期间的麸质/麦醇溶蛋白/麦谷蛋白降解本身不是有益的，因为不完全的降解可以导致毒性的和/或免疫原性的肽的形成；
[0023]
■
关于用于触发体内麸质降解的目前可得的手段的安全性已表达了关心，因为这些手段可能仅部分地降解麸质并且可以由此诱导麸质毒性或使麸质毒性变得更坏；
[0024]
■
任何用于触发体内麸质降解的尝试需要确保这样的降解是完全的并且导致安全的降解产物；
[0025]
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鉴于具有免疫原性潜力的麸质固有肽序列存在多样性，那么就需要来自不同微生物的肽水解酶的组合来确保所有肽的完全降解；
[0026]
■
这样的组合优选地由在胃肠道的相关部分(即，胃和十二指肠)中在代谢上活跃并且相互协同的益生微生物的聚生体来提供，以促进来自相关食物基质的麸质蛋白质安全、快速和完全地消化为非毒性的、非免疫原性的小肽或氨基酸；
[0027]
■
我们设想这样的协同作用可以通过组合具有合适的蛋白质/肽底物特异性的耐酸和耐胆汁菌株来实现，并且发现来自特定生态位的某些乳杆菌属物种、芽孢杆菌属物种和在一些情况下还有片球菌属物种(包括其细胞质提取物)的组合对于此来说是特别有用的。
[0028]
在本发明中，我们公开了应用由乳杆菌属和芽孢杆菌属物种(任选地添加有片球菌属菌株)构成的聚生体，作为用于在人和动物的胃肠道中以及在食品生产期间的麸质降解之中进行使用的技术。
[0029]
这样的技术如何能够对有此需要的人以及对出于预防或其他原因而愿意使他们对麸质的暴露最小化的人带来益处的手段如下：
[0030]
(i)安全地清除有意地或意外地摄取的麸质，作为用于cd、wa和ncgs患者的治愈或互补疗法。返回常规的、包含麸质的膳食的可能性。
[0031]
(ii)安全地清除有意地或意外地摄取的麸质，作为用于具有可能产生自所摄取的麸质的非特异性的肠或肠外症状的人的治愈或互补疗法。返回常规的、包含麸质的膳食的可能性。
[0032]
(iii)为想要使他们的麸质暴露最小化的无症状的人提供解决办法，作为对坚持gfd的一种备选方案。
[0033]
本发明旨在包含乳杆菌属和芽孢杆菌属物种(任选地添加有片球菌属菌株)的制剂。这些新的制剂促进在人胃肠道中和在包含麸质的食品生产期间将麸质消化为无毒性的和非免疫原性的肽/氨基酸。
[0034]
因此，本发明的主题为包含至少一种从芽孢杆菌属中选择的益生菌菌株和至少一种从乳杆菌属中选择的益生菌菌株的聚生体的制剂，其用于在麸质的安全和完全降解之中使用。
[0035]
本发明还旨在包含至少一种从芽孢杆菌属中选择的细菌菌株和至少一种从乳杆菌属中选择的细菌菌株的聚生体的制剂，其用于在将麸质降解至20ppm或更少的麸质含量之中使用，
[0036]
a)其中所述菌株聚生体可以降解12-聚体肽qlqpfpqpqlpy(seq id no.1)、14-聚
体肽pqpqlpypqpqsfp(seq id no.2)、20-聚体肽qqlpqpqqpqqsfpqqqrpf(seq id no.3)、33-聚体肽lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf(seq id no.4)。
[0037]
在一个优选的方案中，所述菌株聚生体可以将12-聚体肽qlqpfpqpqlpy(seq id no.1)、14-聚体肽pqpqlpypqpqsfp(seq id no.2)、20-聚体肽qqlpqpqqpqqsfpqqqrpf(seq id no.3)、33-聚体肽lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf(seq id no.4)降解至少1％，或至少10％，或至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，优选地或至少80％，或至少90％，优选地至少95％，更优选地至少98％。
[0038]
麸质含量经由elisa测定法来测定，优选地通过按照aoac(association of official agricultural chemists；官方农业化学家协会)国际官方分析方法(oma)(方法编号aacci 38-55.01)使用基于r5抗体的夹心式和竞争性elisa(r5-elisa)测定经水解的麸质[22]，或者通过使用elisa系统麸质残留物检测试剂盒(elisa systems gluten residue detection kit)(windsor,australia)测定残留的麸质。
[0039]
在一个优选的方案中，所述制剂能够在6小时后将残留的麸质减少至少85％，优选地至少90％，更优选地至少95％，或者在16小时后减少至少95％，更优选地至少98％，或者在48小时后减少至少99％。备选地，所述制剂能够在6小时后将麸质片段减少至少90％，或者在16小时后减少至少95％，或者在48小时后减少至少97％。
[0040]
在另一个优选的方案中，所述制剂能够在6小时后将残留的麸质减少至少95％，优选地至少97％，或者在16小时后减少至少99％。备选地，所述制剂能够在6小时后将麸质片段减少至少94％，或者在16小时后减少至少97％，或者在48小时后减少100％。
[0041]
一个进一步的优选的方案为用于所述用途的制剂，
[0042]
b)其中所述菌株聚生体能够将麸质降解至这样的消化物，所述消化物在受麸质相关病症影响的受试者或动物的小肠或小肠外植体中不引起免疫原性或毒性应答，和/或
[0043]
c)其中所述聚生体的所有菌株在模拟的胃(ph 1.0-4.0)和肠(ph5.4-6.8；0.05-0.6％胆汁酸，或在体内条件下在人中存在的胆汁酸浓度)条件下存活(小于2log cfu损失)，和/或
[0044]
d)其中所述聚生体的成员具有互补的pepp、pepo、pepx、pepi和pepn活性，其具有等于或大于3u/g(pepp)、5u/g(pepo)、20u/g(pepx)、17u/g(pepi)、20u/g(pepn)的至少一种肽酶活性。
[0045]
枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)和解淀粉芽孢杆菌以及植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)、旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)、短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)这些物种，和在一些情况下，还有片球菌属物种的细菌，被发现尤其适合于该效应。
[0046]
因此，在一个优选的实施方案中，所述芽孢杆菌属菌株选自短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，优选地选自短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355、dsm 33301，枯草芽孢杆菌dsm 33353、dsm 33298，地衣芽孢杆菌dsm 33354，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356。
[0047]
所述乳杆菌属菌株选自植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)、干酪乳杆菌(干酪乳干酪杆菌)、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)、短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)、旧金山乳杆菌
(旧金山水果乳杆菌)、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)，优选地选自植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33363、dsm 33364、dsm 33366、dsm 33367、dsm 33368、dsm 33369、dsm 33370，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373、dsm 33375、dsm 33376，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378、dsm 33379。
[0048]
在一个优选的实施方案中，根据本发明的用于所述用途的制剂包含下列菌株中的一种或多种：
[0049]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33363、dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355，地衣芽孢杆菌dsm 33354，巨大芽孢杆菌dsm 33300，和枯草芽孢杆菌dsm 33353，或者
[0050]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33367、dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，枯草芽孢杆菌dsm 33298、dsm 33353，或者
[0051]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366、dsm 33369，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376，戊糖片球菌(pediococcus pentosaceus)dsm 33371，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378，地衣芽孢杆菌dsm 33354，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，和枯草芽孢杆菌dsm 33298，或者
[0052]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，短小芽孢杆菌dsm 33297，和巨大芽孢杆菌dsm 33300，或者
[0053]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，枯草芽孢杆菌dsm 33298，和短小芽孢杆菌dsm 33301。
[0054]
特别优选的根据本发明的用于所述用途的制剂包含下列菌株：
[0055]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，枯草芽孢杆菌dsm 33298，和短小芽孢杆菌dsm 33301，或者
[0056]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，和短小芽孢杆菌dsm 33297，或者
[0057]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，短小芽孢杆菌dsm 33355。
[0058]
本发明的菌株的细胞可以存在于本发明的组合物中，作为孢子(其是休眠的)，作为营养细胞(其是正在生长的)，作为过渡状态细胞(其正在从营养细胞转变至孢子，或者相反)，作为全细胞提取物，或者作为经富集的酶级分或经纯化的酶，或者作为这些类型的细胞或提取物/分离物中的至少两种的组合。
[0059]
本发明还涉及包含微生物菌株的组合物，在所述微生物菌株中已经借助于基因克隆和基因转移程序转移入了从上面提及的菌株中分离出的蛋白酶基因；以及此类基因工程
菌株的用途，作为孢子(如果适用)，作为营养细胞，作为过渡状态细胞，作为全细胞提取物，或者作为经富集的酶级分或经纯化的酶，或者作为这些类型的细胞或提取物/分离物中的至少两种的组合。
[0060]
在一个优选的实施方案中，所述益生菌菌株以休眠形式或作为营养细胞存在。在备选的实施方案中，使用所述益生菌菌株的细胞质提取物或无细胞上清液或热灭活生物质。
[0061]
在一个进一步的优选的实施方案中，所述制剂进一步包含一种或多种益生菌菌株，其优选地选自片球菌物种、魏斯氏菌属物种(weissella sp.)，更优选地戊糖片球菌dsm 33371。
[0062]
在一个进一步的优选的实施方案中，所述制剂进一步包含下列中的一种或多种：从黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、芽孢杆菌属物种、乳杆菌属物种、片球菌属物种、魏斯氏菌属物种、粘质罗氏菌(rothia mucilaginosa)、空气罗氏菌(rothia aeria)中纯化的微生物蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，纳豆激酶(nattokinase)，阿拉伯木聚糖，大麦谷粒纤维，燕麦谷粒纤维，黑麦纤维，小麦麸皮纤维，菊粉，果寡糖(fos)，半乳寡糖(gos)，抗性淀粉，β-葡聚糖，葡甘露聚糖，半乳葡甘露聚糖，瓜尔胶，木寡糖，藻酸盐。
[0063]
本发明还旨在用于所述用途的制剂，用于在有此需要的受试者或动物中治疗或预防麸质相关病症，所述麸质相关病症优选地选自乳糜泻、非乳糜泻麸质敏感、小麦变态反应和麸质敏感性肠易激惹综合征。
[0064]
此外，本发明旨在用于所述用途的制剂，用于从小麦、大麦、黑麦和燕麦这些包含麸质的谷物产生无麸质食品，其优选地包含小于20ppm麸质。
[0065]
在一个优选的实施方案中，用于所述用途的制剂进一步包含充当芽孢杆菌属物种、乳杆菌属物种、片球菌属物种、魏斯氏菌属物种的成员的微生物细胞膜的透化剂(permeabilizer)的物质，优选地藻酸盐。
[0066]
在一个备选的实施方案中，将选自芽孢杆菌属物种、乳杆菌属物种、片球菌属物种和魏斯氏菌属物种的益生菌菌株中的一种或多种独自地或作为聚生体进行固定化。固定化可以在固体表面例如纤维素和壳聚糖上进行，例如包载在多孔基质例如多糖凝胶如藻酸盐、k-角叉藻聚糖、琼脂、壳聚糖和聚半乳糖醛酸或者其他聚合物基质例如明胶、胶原和聚乙烯醇之内，或者通过絮凝和微包囊或电喷雾技术。就在模拟的胃肠条件下的存活和就pepn、pepo、pep、pepx、pepq活性来筛选乳杆菌属、芽孢杆菌属和片球菌属的菌株。下列菌株在模拟的胃肠条件下存活(小于2log cfu减少)并且显示出异常高的肽酶活性例如pepn、pepo、pep、pepx、pepq：
[0067]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33362、dsm 33363、dsm 33364、dsm 33367、dsm 33366、dsm 33369、dsm 33368；
[0068]
路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374；
[0069]
短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377；
[0070]
类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373、dsm 33375、dsm 33376；
[0071]
旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378、dsm 33379；
[0072]
枯草芽孢杆菌dsm 33298、dsm 33353；
[0073]
短小芽孢杆菌dsm 33301、dsm 33297、dsm 33355；
[0074]
巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356；
[0075]
地衣芽孢杆菌dsm 33354；
[0076]
戊糖片球菌dsm 33371。
[0077]
因此，优选地用于根据本发明的制剂的芽孢杆菌属/乳杆菌属/片球菌属菌株选自下列组：
[0078]
以dsm 33298、dsm 33353保藏于dsmz的枯草芽孢杆菌菌株；以dsm 33301、dsm 33297、dsm 33355保藏于dsmz的短小芽孢杆菌菌株；以dsm 33300、dsm 33356保藏于dsmz的巨大芽孢杆菌菌株；以dsm 33354保藏于dsmz的地衣芽孢杆菌菌株；以dsm 33371保藏于dsmz的戊糖片球菌菌株；以dsm 33378、dsm 33379保藏于dsmz的旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)菌株；以dsm 33370、dsm 33362、dsm 33363、dsm 33364、dsm 33367、dsm 33366、dsm 33369、dsm 33368保藏于dsmz的植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)菌株；以dsm 33374保藏于dsmz的路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)菌株；以dsm 33377保藏于dsmz的短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)菌株；以dsm 33373、dsm 33375、dsm 33376保藏于dsmz的类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)菌株。
[0079]
当组合植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33363、dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355，地衣芽孢杆菌dsm 33354，巨大芽孢杆菌dsm 33300，枯草芽孢杆菌dsm 33353这些菌株(组合1)时，在表1中所列出的所有四种所测试的麸质表位都在12小时内完全降解。
[0080]
同样地，组合2(其包含植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33367、dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，枯草芽孢杆菌dsm 33298、dsm 33353)和组合3(其包含植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366和dsm 33369，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376，戊糖片球菌dsm 33371，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378，地衣芽孢杆菌dsm 33354，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，枯草芽孢杆菌dsm 33298)导致在表1中所列出的麸质表位在12小时内完全降解。
[0081]
进一步地，植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，以及短小芽孢杆菌dsm 33297和巨大芽孢杆菌dsm 33300的组合与菌株组合1-3类似地有效。
[0082]
进一步地，植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，短小芽孢杆菌dsm 33297和dsm 33355，和巨大芽孢杆菌dsm 33300的组合与菌株组合1-3类似地有效。
[0083]
因此，本发明的一个优选的方案旨在包含从下列中选择的菌株组合的制剂：
[0084]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33363、dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355，地衣芽孢杆菌dsm 33354，巨大芽孢杆菌dsm 33300，和枯草芽孢杆菌dsm 33353，或者
[0085]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33367、dsm 33368，类干酪乳杆菌
(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，枯草芽孢杆菌dsm 33298和dsm 33353，或者
[0086]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366和dsm 33369，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376，戊糖片球菌dsm 33371，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378，地衣芽孢杆菌dsm 33354，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，和枯草芽孢杆菌dsm 33298，或者
[0087]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，短小芽孢杆菌dsm 33297，和巨大芽孢杆菌dsm 33300，或者
[0088]
植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，短小芽孢杆菌dsm 33297和dsm 33355，和巨大芽孢杆菌dsm 33300。
[0089]
上面所列出的芽孢杆菌属物种、乳杆菌属物种和片球菌属物种的菌株之间的许多其他组合显示出与已经指出的那些组合相当的性能。
[0090]
更特别地，本发明的优选的方案包含总体上提供高的pepi、pepn、pepx、pepo和pepp酶促活性的菌株组合；因此，这样的组合包含下述组1-5中每一组中的至少一种菌株，其中组成员具有特别高的关于pepi(组1)、pepn(组2)、pepx(组3)、pepo(组4)、pepp(组5)的酶促活性。
[0091]
因此，本发明的另一个主题为包含下述组1-5中每一组中的至少一种菌株的制剂：
[0092]
组1：类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，
[0093]
组2：枯草芽孢杆菌dsm 33298、短小芽孢杆菌dsm 33297、地衣芽孢杆菌dsm 33354、巨大芽孢杆菌dsm 33356、戊糖片球菌dsm 33371、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33367、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362，
[0094]
组3：旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378、旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379、戊糖片球菌dsm 33371、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33369、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，
[0095]
组4：枯草芽孢杆菌dsm 33353、短小芽孢杆菌dsm 33355、短小芽孢杆菌dsm 33301，
[0096]
组5：巨大芽孢杆菌dsm 33300、旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378、戊糖片球菌dsm 33371、短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33368、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33367、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33364、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373。
[0097]
在一个优选的方案中，所述制剂包含至少三种不同的菌株，优选地至少四种不同的菌株，更优选地至少五种不同的菌株。
[0098]
当所述制剂包含下列菌株时，这是特别优选的：
[0099]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33363、dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355，地衣芽孢杆菌dsm 33354，巨大芽孢杆菌dsm 33300，和枯草芽孢杆菌dsm 33353，或者
[0100]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33367、dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，枯草芽孢杆菌dsm 33298和dsm 33353，或者
[0101]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366和dsm 33369，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376，戊糖片球菌dsm 33371，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378，地衣芽孢杆菌dsm 33354，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，和枯草芽孢杆菌dsm 33298，或者
[0102]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，枯草芽孢杆菌dsm 33298，和短小芽孢杆菌dsm 33301，或者
[0103]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，和短小芽孢杆菌dsm 33297，或者
[0104]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，短小芽孢杆菌dsm 33355，或者
[0105]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355、dsm 33301，或者
[0106]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33367和dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，枯草芽孢杆菌dsm 33298，地衣芽孢杆菌dsm 33354，和巨大芽孢杆菌dsm 33300，或者
[0107]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366、dsm 33369，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376，戊糖片球菌dsm 33371，巨大芽孢杆菌dsm 33356，和枯草芽孢杆菌dsm 33353，或者
[0108]-短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，戊糖片球菌dsm 33371，植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33369，短小芽孢杆菌dsm 33297，和巨大芽孢杆菌dsm 33300，或者
[0109]-类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33367、dsm 33368，短小芽孢杆菌dsm 33355，和地衣芽孢杆菌dsm 33354，或者
[0110]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33362和dsm 33366，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33356，和枯草芽孢杆菌dsm 33353，或者
[0111]-类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33367，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，地衣芽孢杆菌dsm 33354，或者
[0112]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363、dsm 33364、dsm 33370，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33297，巨大芽孢杆菌dsm 33356，或者
[0113]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33367、dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，巨大芽孢杆菌dsm 33300、枯草芽孢杆菌dsm 33353，或者
[0114]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366、dsm 33369，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376，戊糖片球菌dsm 33371，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355，或者
[0115]-短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，戊糖片球菌dsm 33371，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，或者
[0116]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，地衣芽孢杆菌dsm 33354，或者
[0117]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33366、dsm 33370，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378、dsm 33379，地衣芽孢杆菌dsm 33354，枯草芽孢杆菌dsm 33353。
[0118]
在一个进一步的优选的方案中，所述制剂包含下列菌株：
[0119]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，枯草芽孢杆菌dsm 33298，和短小芽孢杆菌dsm 33301，或者
[0120]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，和短小芽孢杆菌dsm 33297，或者
[0121]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，短小芽孢杆菌dsm 33355。
[0122]
本发明的另一个优选的方案为待在从谷物制备食品(通过例如发酵和烘焙过程)中使用的配制剂。
[0123]
因此，本发明还涉及食品或宠物食品补充剂或者食品或宠物食品产品，其包含根据本发明的制剂。
[0124]
本发明的一个主题为根据本发明的制剂作为食品补充剂的用途或者其在食品中的用途。优选的根据本发明的食品为巧克力产品、软糖、木斯里(muesli)、木斯里棒和乳制品。
[0125]
本发明的一个进一步的主题还为本发明的制剂作为食品或饲料产品中的合生成分(synbiotic)的用途。
[0126]
本发明的一个进一步的主题为食品组合物，其包含根据本发明的制剂和至少一种另外的食品成分，所述另外的食品成分优选地选自蛋白质、碳水化合物、脂肪、另外的益生菌、益生元、酶、维生素、免疫调节剂、乳替代品、矿物质、氨基酸、抑球虫剂、基于酸的产品、
药品及其组合。
[0127]
根据本发明的食品或饲料组合物还包括膳食补充剂，例如以丸剂、胶囊、片剂、粉末或液体的形式。
[0128]
本发明的一个进一步的主题为药学组合物，其包含根据本发明的制剂和在药学上可接受的载体。
[0129]
当施用给人类或动物时，根据本发明的制剂优选地改善人类的健康状态，特别是肠道健康、心血管健康、精神健康或免疫健康。
[0130]
根据本发明的一个有利的方案为用于改善人类或动物的健康状态的组合物，通过下列中的一个或多个：
[0131]-减少毒性麸质表位(优选地，在表1中所列出的那些)的量。
[0132]-将初始麸质的量减少至小于20ppm。
[0133]
条目
[0134]
1.包含至少一种从芽孢杆菌属(bacillus)中选择的细菌菌株和至少一种从乳杆菌属(lactobacillus)中选择的细菌菌株的聚生体的制剂，其用于在麸质降解之中使用。
[0135]
2.包含至少一种从芽孢杆菌属(bacillus)中选择的细菌菌株和至少一种从乳杆菌属(lactobacillus)中选择的细菌菌株的聚生体的制剂，其用于在将麸质降解至20ppm或更少的麸质含量之中使用。
[0136]
3.根据条目1或2的用于所述用途的制剂，
[0137]
a)其中所述菌株聚生体可以降解12-聚体肽qlqpfpqpqlpy(seq id no.1)、14-聚体肽pqpqlpypqpqsfp(seq id no.2)、20-聚体肽qqlpqpqqpqqsfpqqqrpf(seq id no.3)、33-聚体肽lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf(seq id no.4)。
[0138]
4.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述麸质含量通过elisa测定法，优选地基于抗体的夹心式或竞争性测定法来测定。
[0139]
5.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述制剂能够在6小时后将残留的麸质减少至少85％，优选地至少90％，更优选地至少95％，或者在16小时后减少至少95％，更优选至少98％，或者在48小时后减少至少99％。
[0140]
6.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述制剂能够在6小时后将麸质片段减少至少90％，或者在16小时后减少至少95％，或者在48小时后减少至少97％。
[0141]
7.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述制剂能够在6小时后将残留的麸质减少至少95％，优选地至少97％，或者在16小时后减少至少99％。
[0142]
8.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述制剂能够在6小时后将麸质片段减少至少94％，或者在16小时后减少至少97％，或者在48小时后减少100％。
[0143]
9.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述菌株聚生体可以将12-聚体肽qlqpfpqpqlpy(seq id no.1)、14-聚体肽pqpqlpypqpqsfp(seq id no.2)、20-聚体肽qqlpqpqqpqqsfpqqqrpf(seq id no.3)、33-聚体肽lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf(seq id no.4)降解至少80％，或至少90％，优选地至少95％，更优选地至少98％。
[0144]
10.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，
[0145]
b)其中所述菌株聚生体能够将麸质降解至这样的消化物，所述消化物在受麸质相关病症影响的受试者或动物的小肠或小肠外植体中不引起免疫原性或毒性应答，和/或
[0146]
c)其中所述聚生体的所有菌株在模拟的胃(ph 1.0-4.0)和肠(ph 5.4-6.8；0.05-0.6％胆汁酸，或在体内条件下在人中存在的胆汁酸浓度)条件下存活(小于2log cfu损失)，和/或
[0147]
d)其中所述聚生体的成员具有互补的pepp、pepo、pepx、pepi和pepn活性，其具有等于或大于3u/g(pepp)、5u/g(pepo)、20u/g(pepx)、17u/g(pepi)、20u/g(pepn)的至少一种肽酶活性。
[0148]
11.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述芽孢杆菌属菌株选自短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，优选地选自短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355、dsm 33301，枯草芽孢杆菌dsm 33353、dsm 33298，地衣芽孢杆菌dsm 33354，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356。
[0149]
12.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述乳杆菌属菌株选自植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)、干酪乳杆菌(干酪乳干酪杆菌)、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)、短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)、旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)，优选地选自植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33363、dsm 33364、dsm 33366、dsm 33367、dsm 33368、dsm 33369、dsm 33370，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373、dsm 33375、dsm 33376，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378、dsm 33379。
[0150]
13.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述益生菌菌株以休眠形式或作为营养细胞存在。
[0151]
14.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中使用所述益生菌菌株的细胞质提取物或无细胞上清液或热灭活生物质。
[0152]
15.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述制剂进一步包含一种或多种益生菌菌株，其优选地选自片球菌物种、魏斯氏菌属物种，更优选地戊糖片球菌dsm 33371。
[0153]
16.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中所述制剂进一步包含下列中的一种或多种：从黑曲霉、米曲霉、芽孢杆菌属物种、乳杆菌属物种、片球菌属物种、魏斯氏菌属物种、粘质罗氏菌、空气罗氏菌中纯化的微生物蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，纳豆激酶，阿拉伯木聚糖，大麦谷粒纤维，燕麦谷粒纤维，黑麦纤维，小麦麸皮纤维，菊粉，果寡糖(fos)，半乳寡糖(gos)，抗性淀粉，β-葡聚糖，葡甘露聚糖，半乳葡甘露聚糖，瓜尔胶，木寡糖，藻酸盐。
[0154]
17.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，用于在有此需要的受试者或动物中治疗或预防麸质相关病症，所述麸质相关病症优选地选自乳糜泻、非乳糜泻麸质敏感、小麦变态反应和麸质敏感性肠易激惹综合征。
[0155]
18.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，用于从小麦、大麦、黑麦和燕麦这些包含麸质的谷物产生无麸质食品，其优选地包含小于20ppm麸质。
[0156]
19.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其进一步包含充当芽孢杆菌属物种、乳杆菌属物种、片球菌属物种、魏斯氏菌属物种的成员的微生物细胞膜的透化剂的物质，优选地藻酸盐。
[0157]
20.根据任一项前述条目的用于所述用途的制剂，其中将选自芽孢杆菌属物种、乳杆菌属物种、片球菌属物种和魏斯氏菌属物种的益生菌菌株中的一种或多种独自地或作为聚生体进行固定化。
[0158]
21.包含下述组1-5中每一组中的至少一种菌株的制剂：
[0159]
组1：类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，
[0160]
组2：枯草芽孢杆菌dsm 33298、短小芽孢杆菌dsm 33297、地衣芽孢杆菌dsm 33354、巨大芽孢杆菌dsm 33356、戊糖片球菌dsm 33371、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33367、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362，
[0161]
组3：旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378、旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379、戊糖片球菌dsm 33371、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33369、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，
[0162]
组4：枯草芽孢杆菌dsm 33353、短小芽孢杆菌dsm 33355、短小芽孢杆菌dsm 33301，
[0163]
组5：巨大芽孢杆菌dsm 33300、旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378、戊糖片球菌dsm 33371、短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33368、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33367、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366、植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33364、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373。
[0164]
22.根据条目21的制剂，其包含至少三种不同的菌株，优选地至少四种不同的菌株，更优选地至少五种不同的菌株。
[0165]
23.根据条目21或22的制剂，其包含下列菌株：
[0166]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33363、dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355，地衣芽孢杆菌dsm 33354，巨大芽孢杆菌dsm 33300，和枯草芽孢杆菌dsm 33353，或者
[0167]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33367、dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，枯草芽孢杆菌dsm 33298和dsm 33353，或者
[0168]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366和dsm 33369，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376，戊糖片球菌dsm 33371，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378，地衣芽孢杆菌dsm 33354，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，和枯草芽孢杆菌dsm 33298，或者
[0169]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，枯草芽孢杆菌dsm 33298，和短小芽孢杆菌dsm 33301，或者
[0170]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，和短小芽孢杆菌dsm 33297，或者
[0171]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，短小芽孢杆菌dsm 33355，或者
[0172]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355、dsm 33301，或者
[0173]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33367和dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，枯草芽孢杆菌dsm 33298，地衣芽孢杆菌dsm 33354，和巨大芽孢杆菌dsm 33300，或者
[0174]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366、dsm 33369，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376，戊糖片球菌dsm 33371，巨大芽孢杆菌dsm 33356，和枯草芽孢杆菌dsm 33353，或者
[0175]-短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，戊糖片球菌dsm 33371，植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33369，短小芽孢杆菌dsm 33297，和巨大芽孢杆菌dsm 33300，或者
[0176]-类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33367、dsm 33368，短小芽孢杆菌dsm 33355，和地衣芽孢杆菌dsm 33354，或者
[0177]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33362和dsm 33366，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33356，和枯草芽孢杆菌dsm 33353，或者
[0178]-类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33367，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，地衣芽孢杆菌dsm 33354，或者
[0179]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363、dsm 33364、dsm 33370，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33297，巨大芽孢杆菌dsm 33356，或者
[0180]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33367、dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，巨大芽孢杆菌dsm 33300、枯草芽孢杆菌dsm 33353，或者
[0181]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366、dsm 33369，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376，戊糖片球菌dsm 33371，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355，或者
[0182]-短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，戊糖片球菌dsm 33371，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，或者
[0183]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，地衣芽孢杆菌dsm 33354，或者
[0184]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33366、dsm 33370，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378、dsm 33379，地衣芽孢杆菌dsm 33354，枯草芽孢杆菌dsm 33353。
[0185]
24.根据条目21-23中任一项的制剂，其包含下列菌株：
[0186]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，枯草芽孢杆菌dsm 33298，和短小芽孢杆菌dsm 33301，或者
[0187]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，和短小芽孢杆菌dsm 33297，或者
[0188]-植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，短小芽孢杆菌dsm 33355。
[0189]
25.根据条目21-24中任一项的制剂，其中所述益生菌菌株以休眠形式或作为营养细胞存在。
[0190]
26.根据条目21-25中任一项的制剂，其中使用所述益生菌菌株的细胞质提取物，或无细胞上清液，或经富集的酶级分，或经纯化的酶，或热灭活生物质。
[0191]
27.根据条目21-26中任一项的制剂，其中所述制剂进一步包含一种或多种益生菌菌株，其优选地选自片球菌物种、魏斯氏菌属物种，更优选地戊糖片球菌dsm 33371。
[0192]
28.根据条目21-27中任一项的制剂，其中所述制剂进一步包含下列中的一种或多种：从黑曲霉、米曲霉、芽孢杆菌属物种、乳杆菌属物种、片球菌属物种、魏斯氏菌属物种、粘质罗氏菌、空气罗氏菌中纯化的微生物蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，纳豆激酶，阿拉伯木聚糖，大麦谷粒纤维，燕麦谷粒纤维，黑麦纤维，小麦麸皮纤维，菊粉，果寡糖(fos)，半乳寡糖(gos)，抗性淀粉，β-葡聚糖，葡甘露聚糖，半乳葡甘露聚糖，瓜尔胶，木寡糖，藻酸盐。
[0193]
29.食品或宠物食品补充剂或者食品或宠物食品产品或者药学产品，其包含根据条目21-28中任一项的制剂。
[0194]
工作实施例
[0195]
实施例1.耐胃肠条件的益生微生物
[0196]
如由fern
á
ndez等人[19]所描述那样，使用模拟的胃液和肠液。将在静止期生长的细胞以8000g收获10分钟，用生理溶液进行洗涤，并且悬浮在50ml的模拟胃液中(10log cfu/ml的细胞密度)，所述模拟胃液包含nacl(125mm/l)、kcl(7mm/l)、nahco3(45mm/l)和胃蛋白酶(3g/l)(sigma-aldrich co.,st.louis,mo,usa)[20]。将最终ph调节至2.0、3.0和8.0。ph 8.0的值用于调查所述模拟胃液的组分的影响，除了低ph的效应之外。将悬浮液在厌氧条件下在37℃下进行温育，并且进行搅动以模拟蠕动。在0、90和180分钟时取该悬浮液的等分试样，并且测定活细胞计数。还通过在接种处于ph 2.0的模拟胃液之前将细胞悬浮在重构脱脂乳(rsm)(11％固体，w/v)中来测定胃消化的效应。在添加rsm后最终ph为大约3.0。对该条件进行检定以模拟在胃穿过期间食品基质的效应[20]。在180分钟的胃消化后，收获细胞并且悬浮在模拟肠液(处于ph 8.0)中，所述模拟肠液包含0.1％(w/v)胰酶制剂和0.15％(w/v)牛胆汁胆汁盐(sigma-aldrich co.)。将悬浮液在搅动下在37℃下进行温育，并且在0、90和180分钟时取等分试样[21]。《400种受试菌株中的119种显示出小于2log的初
始1
×
10
10
cfu/ml的下降，并且被定义为对模拟的胃肠条件具有抵抗力。
[0197]
实施例2.单一的耐胃肠条件的菌株的蛋白酶和肽酶活性
[0198]
就其对于合成底物的肽酶和蛋白酶活性，测试了显示出对于模拟的胃肠条件的抵抗力的所有119种菌株(乳杆菌属物种，63种菌株；魏斯氏菌属物种，3种菌株；片球菌属物种，1种菌株；和芽孢杆菌属物种，51种菌株)。为了检定肽酶活性，使用来自晚指数生长期(大约9.0log cfu/ml)的每种菌株的培养物。将经洗涤的细胞粒状沉淀的等分试样(0.3g[干重])重悬浮在50mm tris-hcl(ph 7.0)中，在30℃下温育30分钟，并且以13,000
×
g离心10分钟以去除与细胞壁松散地相联合的酶。通过在搅拌条件(大约160rpm)下在37℃下将细菌悬浮液与在包含24％蔗糖的50mm tris-hcl(ph 7.5)缓冲液中的溶菌酶一起温育60分钟来制备细胞质提取物。将原生质球重悬浮在等渗缓冲液中，并且在16a/s下超声处理40秒(sony prep model 150；sanyo,united kingdom)。将提取物通过冷冻干燥浓缩10倍，重悬浮于5mm tris-hcl(ph 7.0)中，并且在4℃下透析24小时。分别通过使用leu-对硝基苯胺(p-na)、pro-p-na、gly-pro-p-na、z-gly-gly-leu-p-na和z-gly-pro-4-硝基苯胺底物(sigma chemical co)来测量乳杆菌的细胞质提取物的总的n型氨肽酶(pepn)、脯氨酸亚氨基肽酶(pepi)、x-脯氨酰基二肽基氨肽酶(pepx)、内肽酶(pepo)和脯氨酰基内肽酶(pepp)活性。检定混合物包含900μl的在0.05m磷酸钾缓冲液(ph 7.0)中的2.0mm底物，和100μl的细胞质提取物。将混合物在37℃下温育180分钟，并且在410nm处测量吸光度。将数据与通过使用对硝基苯胺而建立的标准曲线进行比较。将一个活性单位定义为在检定条件下每分钟释放1μmol的对硝基苯胺所需要的酶的量。基于来自上述肽酶活性的主要组分分析(principal component analysis；pca)数据，一些菌株清楚地与其他菌株相分开(图1)。图2报道了显示出非常高的肽酶活性(至少对于一种肽酶活性)的菌株。pepn活性从0.0(u002-c04；u541-c05；u776-c02；dsm 33301；u021-c01；dsm 32540；u567-c04)至31.400
±
0.09u(dsm 33362)变动(中值3.08)。未进一步评价具有低肽酶活性的菌株(具有内部编号/或保藏于dsmz：u002-c04；u541-c05；u776-c02；dsm 33301；u021-c01；dsm 32540；u567-c04)。其他最有活性的菌株为dsm 33367，dsm 33374，dsm 33370，dsm33371，dsm 33377，dsm 33373，短小芽孢杆菌dsm 33297，枯草芽孢杆菌dsm 33298，dsm 33376，dsm 33375，dsm 33363，地衣芽孢杆菌dsm 33354，和巨大芽孢杆菌dsm 33356(图1，图2)。pepi的中值为1.66。最有活性的菌株(pepi活性》18u)为dsm 33375、dsm 33373。pepx活性从0.0至大约24u变动。最有活性的菌株为dsm 33379、dsm 33371、dsm 33370、dsm 33369、dsm 33374、dsm 33373和dsm 33363(图1和图2)(1.81的中值)。pepo的中值为0.54。最有活性的菌株(pepo活性》5u)为dsm 33353、dsm33355和dsm 33301。pepp活性从0.0至6.23u(dsm 33368)变动(中值0.22)。其他最有活性的菌株(pepp活性》3u)为巨大芽孢杆菌dsm 33300，dsm 33378，dsm 33371，dsm 33377，dsm 33367，dsm 33374，dsm 33366，dsm 33373，和dsm 33364。
[0199]
图1显示了在基于119种芽孢杆菌属、乳杆菌属、片球菌属和魏斯氏菌属菌株的细胞质提取物的总的n型氨肽酶(pepn)、脯氨酸亚氨基肽酶(pepi)、x-脯氨酰基二肽基氨肽酶(pepx)、内肽酶(pepo)和脯氨酰基内肽酶(pepp)活性的主要组分分析(pca)后第一和第二主要组分的得分图(a)和负荷图(b)。分别通过使用leu-对硝基苯胺(p-na)、pro-p-na、gly-pro-p-na、z-gly-gly-leu-p-na和z-gly-pro-4-硝基苯胺底物来测量pepn、pepi、pepx、pepp。以红色报告了显示出非常高的肽酶活性(至少对于一种肽酶)的菌株。
[0200]
图2显示了所选择的单一的芽孢杆菌属、乳杆菌属和片球菌属菌株的肽酶活性(pepn、pepi、pepx、pepo和pepp)。将一个活性单位(u)定义为在检定条件下每分钟释放1μmol的对硝基苯胺所需要的酶的量。
[0201]
实施例3.针对免疫原性表位的菌株混合物的肽酶活性
[0202]
作为混合菌株来评估显示出非常高的肽酶活性(至少对于一种肽酶)的芽孢杆菌属、乳杆菌属和片球菌属菌株，以组合强烈的和互补的酶活性。使用各种混合物来检定它们在体外降解对于麸质不耐受负有责任的免疫原性表位的能力。
[0203]
肽的水解通过使用先前所选择的细菌菌株的细胞质提取物的组合来进行。化学合成相应于α9-麦醇溶蛋白的57-68(q-l-q-p-f-p-q-p-q-l-p-y)、a-麦醇溶蛋白的62-75(p-q-p-q-l-p-y-p-q-p-q-s-f-p)、γ-麦醇溶蛋白的134-153(q-q-l-p-q-p-q-q-p-q-q-s-f-p-q-q-q-r-p-f)和α2-麦醇溶蛋白的57-89(l-q-l-q-p-f-p-q-p-q-l-p-y-p-q-p-q-l-p-y-p-q-p-q-l-p-y-p-q-p-q-p-f)(33-聚体)这些片段的免疫原性表位，并且以1mm的初始浓度进行使用。通过rp-hplc来监测水解。通过nano-esi串联质谱法(nano-esi-ms/ms)来分析来自rp-hplc的单个峰。显示出合成的免疫原性表位的最佳水解的菌株混合物为编号3、4和5(图3)，其完全水解所有的毒性肽(90％水解或更多)。图3显示了针对免疫原性表位的菌株混合物的肽酶活性。
[0204]
菌株混合物如下：
[0205]
1.植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33363、dsm 33364、dsm 33366，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355，地衣芽孢杆菌dsm 33354，巨大芽孢杆菌dsm 33300，枯草芽孢杆菌dsm 33353。
[0206]
2.类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375、dsm 33376，植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33369、dsm 33368，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378，地衣芽孢杆菌dsm 33354，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33301。
[0207]
3.植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33363、dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355，地衣芽孢杆菌dsm 33354，巨大芽孢杆菌dsm 33300，枯草芽孢杆菌dsm 33353。
[0208]
4.植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33367、dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，和枯草芽孢杆菌dsm 33298、dsm 33353。
[0209]
5.植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33366、dsm 33369，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33376，戊糖片球菌dsm 33371，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378，地衣芽孢杆菌dsm 33354，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，枯草芽孢杆菌dsm 33298。
[0210]
6.植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33370、dsm 33367，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，短小芽孢杆菌dsm 33301，巨大芽孢杆菌dsm 33300、dsm 33356，枯草芽孢杆菌dsm 33298。
33371，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355；
[0226]
13.短乳杆菌(短发酵潜能乳杆菌)dsm 33377，戊糖片球菌dsm 33371，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33379，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297；
[0227]
14.植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33368，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33375，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297，地衣芽孢杆菌dsm 33354；
[0228]
15.植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33366、dsm 33370，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，旧金山乳杆菌(旧金山水果乳杆菌)dsm 33378、dsm 33379，地衣芽孢杆菌dsm 33354，枯草芽孢杆菌dsm 33353；
[0229]
16.植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363、dsm 33364，类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373，路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374，巨大芽孢杆菌dsm 33300，短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355。
[0230]
将五克的小麦面包(咀嚼30秒并且收集在具有10ml的nak-磷酸盐0.05m,ph 6.9的烧杯中)或相关的面团悬浮在模拟胃液中，所述模拟胃液包含nacl(125mm)、kcl(7mm)、nahco3(45mm)和胃蛋白酶(3g/l)(sigma-aldrich co.,st.louis,mo,usa)。向所述悬浮液添加汇集的所选择的菌株，作为活的细菌(具有大约9.0log cfu/ml的最终细胞密度)和经裂解的细菌(相应于9.0log个细胞/ml)。经计算的在反应混合物中麸质的初始量为7,000ppm。还使没有添加细菌混合物的对照面团经历模拟消化。将所述悬浮液在搅拌下在37℃下进行温育以模拟蠕动。在180分钟的胃消化后，给所述悬浮液添加模拟肠液，其包含0.1％(w/v)胰酶制剂和0.15％(w/v)牛胆汁胆汁盐(sigma-aldrich co.)(ph 8.0)。除了胰酶制剂和胆汁盐外，所述肠液还包含酶制备物e1、e2(每种以0.2g/kg)，veron hpp(10g/100kg的蛋白质)和veron ps(25g/100kg的蛋白质)酶。常规地用于面包房应用的米曲霉的蛋白酶(500,000个基于酪氨酸的血红蛋白单位/g；酶1[e1])和黑曲霉的蛋白酶(3,000个分光光度酸性蛋白酶单位/g；酶2[e2])由bio-cat inc.(troy,va)提供。veron hpp和veron ps是来自枯草芽孢杆菌的细菌蛋白酶(ab酶)。在对照面团中不添加酶混合物(e1、e2、veron ps、veron hpp)。肠消化在搅拌条件(大约200rpm)下在37℃下进行48小时。在消化后，将样品放置在冰上，并且按照aoac(官方农业化学家协会)国际官方分析方法(oma)(方法编号aacci 38-55.01)使用基于r5抗体的夹心式和竞争性elisa(r5-elisa)测定经水解的麸质的浓度[22]。按照制造商(r-biopharm ag,germany)的说明书，用麦醇溶蛋白竞争性检测试剂盒来进行r5-elisa分析。此外，elisa系统麸质残留物检测试剂盒(windsor,australia)用于进行残留的麸质的定量。在6、16、24、36和48小时的温育后通过hplc分析来监测在经消化的样品中表位的存在。还使用液相色谱法以及与之偶联的纳米电喷雾离子化-离子阱串联质谱法(nano-esi-ms/ms)以确认麸质的水解和毒性表位的不存在。
[0231]
如在6小时的消化后通过r5-elisa(aoac官方分析方法，方法编号aacci 38-55.01)所估计的，经水解的麸质的浓度对于对照在810
±
0.02ppm的范围内，而对于混合物3在310
±
0.06ppm的范围内(表2)。在16和24小时的消化后，麸质含量对于大多数的混合物来说≥100ppm，除了混合物16外。重要的是，用混合物4和16在36小时的消化后，麸质片段水平低于20ppm；而对于混合物4、5、6、8和16，在温育结束时(48小时)麸质片段完全不存在。
[0232]
关于残留的麸质，大多数的混合物(mc1-9、16)在消化的24小时内将它降低到
20ppm的临界阈值以下。此外，混合物4-9和16能够在16小时内将残留的麸质降低至≤20ppm。最重要的是，在16小时的消化的后混合物4显示出完全(图5)。mc8和mc16在消化的前六个小时内已经导致完全的麸质降解。总之，mc4、mc8和mc16引起完整以及片段化麸质的最有效的去除(表2)。
[0233]
[0234]
[0235]
[0236][0237]
基于所计算的7,000ppm的在反应混合物中麸质的初始量，关于残留的麸质，所有混合物都能够在6小时后将它降低至少94％(与关于对照的大约84％的降低相比较)，在16小时后降低至少98％，和在48小时后降低直至至少99.1％。关于麸质片段，它们被所有混合物在6小时后降低至少91％(与关于对照的大约88％的降低相比较)，在16小时后降低至少95％，和在48小时后降低直至至少97％。
33363和dsm 33364、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374、巨大芽孢杆菌dsm 33330和短小芽孢杆菌dsm 33297和dsm 33355的活的和经裂解的细胞以及e1、e2、veron ps、veron hpp商业酶进行消化的小麦面包)的面团；(iv)用消化了48小时的对照面团(对照)；和(v)用培养基(rpmi 1640+胃液和肠液，负对照)。对来自每位患者的活组织检查样本进行漂洗，并且于-80℃储存在rnalater(qiagen gmbh,germany)中以保存rna。按照制造商的说明书，使用rneasy minikit(qiagen gmbh)从组织中提取总rna。mrna的浓度通过在260nm处测定uv吸光度来估计。将总rna的等分试样(500ng)通过使用随机六聚体、taqman逆转录试剂(applied biosystems,monza,italy)和3.125u/μl的multiscribe逆转录酶进行逆转录，最终体积为50μl。将cdna样品储存于-20℃。使用abi prism 7500ht快速序列检测系统(applied biosystems)，在96-孔平板中进行rt-pcr。数据收集和分析通过使用机器软件来进行。关于靶基因(ifn-γ、il-2和il-10)的pcr引物和发荧光探针以及内源对照(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶[gapdh]的基因)分别作为taqman基因表达测定法和预开发的taqman测定法(applied biosystems)进行购买。所述测定法作为pcr引物和taqman minor groove binder 6-羧基荧光素染料标记的探针(其在探针的3’末端处具有非荧光猝灭剂)的20x混合物来进行提供。以1x taqman基因表达测定法混合物和1x taqman通用pcr主混合物的最终浓度，使用第一链cdna来进行两步骤逆转录pcr。最终反应体积为25μl。以三个重复分析每个样品，并且所有实验重复两次。每个平板都包括非模板对照(无rna酶的水)。使用下面的热循环仪条件：50℃下2分钟(尿嘧啶dna糖基化酶激活)，95℃下10分钟，和40个循环的95℃下15秒和60℃下1分钟。最初，对于每个引物/探针组进行标准曲线和验证实验。使用ifn-γ、il-2或il-10cdna的六个系列稀释(20至0.1ng/μl)作为关于每个引物/探针组的模板。通过将循环阈值(ct)针对输入cdna的量的log进行作图来生成标准曲线。ct值为在首次检测到在基线水平以上的报道基因荧光的增加时所处于的pcr循环。通过使用内源参考基因(gapdh基因)来使关于靶基因的平均值标准化。使用健康的十二指肠活组织检查样本来校准所有实验。按照制造商的建议，在96-孔圆底平板(tema ricerca,milan,italy)中通过elisa来定量分泌到上清液中的ifn-γ、il-2和il-10蛋白的水平。
[0243]
如所预期的，与正对照一起进行温育的十二指肠活组织检查样本产生比负对照(rpmi 1640+胃液和肠液)显著(p《0.05)更高的白介素2(il-2)、白介素10(il-10)(b)和γ-干扰素(ifn-γ)mrna的表达(图5)。相比于负对照而言，用混合物4和16进行消化的样品显示出相同的il-2、il-10和ifn-γ水平(p＞0.05)。混合物7的特征为：比正对照更低的il-2合成，但是相比于负对照以及混合物4和16而言更高的il-2合成。对于il-10和ifn-γ也发现了相似的趋势。这些结果与分别通过混合物4和7的免疫原性肽的完全和部分清除(如在图4a-c中所显示的)很好地相关联。
[0244]
图5a显示了在来自具有cd的患者的十二指肠活组织检查样本中白介素2(il-2)的浓度(ng/μl)。对照：没有添加细菌细胞和微生物酶进行消化的小麦面包；rpmi+胃液和肠液：负对照；微生物聚生体4：添加有植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363和dsm 33364、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373、枯草芽孢杆菌dsm 33298和短小芽孢杆菌dsm 33301的活的和经裂解的细胞以及e1、e2、veron ps、veron hpp商业酶进行消化的小麦面包；微生物聚生体7：添加有植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33362、dsm 33366和dsm 33370、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374、巨大芽孢杆菌dsm 33356和枯草芽孢杆
菌dsm 33353的活的和经裂解的细胞以及e1、e2、veron ps、veron hpp商业酶进行消化的小麦面包；和微生物聚生体16：添加有植物乳杆菌(植物乳植物杆菌)dsm 33363、dsm 33364、类干酪乳杆菌(类干酪乳干酪杆菌)dsm 33373、路氏乳杆菌(路氏粘糊状乳杆菌)dsm 33374、巨大芽孢杆菌dsm 33330、短小芽孢杆菌dsm 33297、dsm 33355的活的和经裂解的细胞进行消化的小麦面包。cd1至cd10，来自乳糜泻患者的十二指肠活组织检查样本。
[0245]
图5b显示了在来自具有cd的患者的十二指肠活组织检查样本中白介素10(il-10)的浓度(ng/μl)。样品和微生物聚生体与图5a等同。
[0246]
图5c显示了在来自具有cd的患者的十二指肠活组织检查样本中γ-干扰素(ifn-γ)的浓度(ng/μl)。样品和微生物聚生体与图5a等同。
[0247]
本发明的发现提供了证据表明：所选择的益生细菌菌株组合具有改善在麸质敏感患者中的麸质消化和在胃肠消化期间水解免疫原性肽的潜力，这降低了一般而言对于麸质敏感患者，和特别是对于cd患者的麸质毒性。
[0248]
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