一种自组装多层次动物源蛋白水凝胶及其制备方法和应用

本发明涉及蛋白水凝胶技术领域，尤其涉及一种自组装多层次动物源蛋白水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

天然蛋白水凝胶无毒、可降解、具有三维网状结构，可作为生物活性成分载体和保护体等功能材料，因此具有很强的吸引力，可通过静电相互作用和热凝胶作用进行制备。肌球蛋白是一种主要的肉类蛋白，在保水、乳化和凝胶特性中起着重要作用。肌球蛋白具有双头结构的y形特征，具有柔韧的颈部区域，包含肌球蛋白轻链和较长的盘卷尾域，由两条约220kda的重链和四条约16～25kda的轻链组成。在乳化肉制品中，肌球蛋白发生凝胶化，形成三维网络，凝胶网络由于肌球蛋白的聚集行为而具有特殊的结构，并且通过化学键的相互作用而受到肌球蛋白聚集体形态的严重影响。蛋白质聚合的过程是由于自组装行为主要取决于内部相互作用的综合效应，包括静电相互作用、疏水相互作用、氢键、范德华力和外部环境因素，如变性温度、离子强度和ph。其中，ph和离子强度对热聚集行为具有显著影响。已有研究表明：在低温(4℃)条件下，nacl浓度对自组装肌球蛋白团聚体的微观结构和尺寸分布有明显影响。水凝胶是ph与热诱导聚集行为的最终产物，其形成也受特征形貌的影响。

自组装蛋白的来源包括动物蛋白、植物蛋白和微生物蛋白，其中动物蛋白包括牛奶中酪蛋白和乳清蛋白、鸡蛋蛋清蛋白、胶原和明胶以及肉蛋白中肌球蛋白。在动物蛋白中，乳蛋白是研究最多的自组装结构之一，例如：自组装的乳清分离蛋白水凝胶在ph值为5.8的水溶液中加热时可以形成球形颗粒聚集体。这些粒子直径在100nm～1μm，形成高度稳定的微凝胶。此外，nacl和cacl2浓度增加了乳清分离蛋白的自组装，提高了水凝胶的硬度，这种行为与蛋白质的净负电荷减少有关。并且自组装的乳清分离蛋白水凝胶可以抵抗胃消化，因此可以作为游离脂肪酸的载体，以改善食物消化。

目前，肌肉中肌球蛋白自组装的研究主要集中在离子强度和ph对其形态、表面电荷以及结构的影响，而对递送活性成分、脂类物质的研究较少。因此，开发高营养多层次肌球蛋白水凝胶传递体系，提高肌球蛋白的应用价值，拓展肌球蛋白在食品材料方面的研究领域，具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种自组装多层次动物源蛋白水凝胶及其制备方法和应用，所制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶具有高黏弹特性，能够较好的吸附油脂并递送活性成分。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种自组装多层次动物源蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

将肌球蛋白分散于磷酸盐缓冲液中，得到肌球蛋白分散体，调节ph值至5.0～9.0，加热后，得到自组装多层次动物源蛋白水凝胶；

所述加热的温度为75～95℃，时间为30～45min。

优选的，所述肌球蛋白来源于猪。

优选的，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7.0，浓度为20mmol，所述磷酸盐缓冲液的成分包括氯化钠，所述氯化钠的浓度为0.2～0.6mol/l。

优选的，所述肌球蛋白分散体的浓度为10～40mg/ml。

优选的，调节ph值至5.0～9.0前，将所述肌球蛋白分散体进行搅拌。

优选的，所述搅拌的温度为10℃。

优选的，调节ph值所用试剂为盐酸或氢氧化钠。

本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的自组装多层次动物源蛋白水凝胶。

优选的，所述自组装多层次动物源蛋白水凝胶由肌球蛋白聚集体组成，所述自组装多层次动物源蛋白水凝胶的电位为-2～-9mv，平均粒径为180～1230nm，α-螺旋含量为29～40％，β-折叠为31～40％。

本发明提供了上述技术方案所述自组装多层次动物源蛋白水凝胶作为载体在食品中递送活性成分和吸附脂类物质的应用。

本发明提供了一种自组装多层次动物源蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将肌球蛋白分散于磷酸盐缓冲液中，得到肌球蛋白分散体，调节ph值至5.0～9.0，加热后，得到自组装多层次动物源蛋白水凝胶；所述加热的温度为75～95℃，时间为30～45min。本发明通过控制ph值，改变静电斥力，使肌球蛋白发生不同程度的聚集，形成肌球蛋白聚集体，然后在加热过程中肌球蛋白聚集体进行自组装，从而肌球蛋白聚集体的形态、粒径和电位均发生变化，蛋白质二级结构发生转变(α-螺旋转变为β-折叠)，最终形成多层次(包括二维和三维网状结构)水凝胶，该水凝胶的平均粒径较小(纳米水平)，在静电斥力作用下导致水凝胶具有较高的稳定性；且水凝胶的α-螺旋含量较高，β-折叠含量较低，α-螺旋转换到β-折叠程度较低，在此二级结构下，水凝胶形成一定规则排布的特征形态，并能使体系形成稳定的乳化凝胶体系，增加体系黏弹特性，进而能够较好的吸附油脂以及递送活性成分。

本发明制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶的电位为-2～-9mv，平均粒径为180～1230nm，α-螺旋含量为29～40％，β-折叠为31～40％。

本发明制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶可在油水界面形成稳定的界面蛋白膜，吸附油脂，并递送活性物质，形成多层次网状载体，拓宽水凝胶在食品中的应用领域。

附图说明

图1为实施例1在ph5.0制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶的afm结构图；

图2为采用实施例1制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶形成的乳化凝胶的sem结构图；

图3为实施例2在ph7.0制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶的afm结构图；

图4为采用实施例2制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶形成的乳化凝胶的sem结构图；

图5为实施例3在ph9.0制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶的afm结构图；

图6为采用实施例3制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶形成的乳化凝胶的sem结构图；

图7为对比例1在ph3.0制备的自组装多层次动物源蛋白聚集体的afm结构图；

图8为采用对比例1制备的自组装聚集体形成的乳化液的sem结构图。

具体实施方式

本发明提供了一种自组装多层次动物源蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

将肌球蛋白分散于磷酸盐缓冲液中，得到肌球蛋白分散体，调节ph值至5.0～9.0，加热后，得到自组装多层次动物源蛋白水凝胶；

所述加热的温度为75～95℃，时间为30～45min。

在本发明中，若无特殊说明，所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。

本发明将肌球蛋白分散于磷酸盐缓冲液中，得到肌球蛋白分散体。在本发明中，所述肌球蛋白优选来源于猪；本发明对所述肌球蛋白的提取方法没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行提取和纯化，能够使得所述肌球蛋白的纯度≥90％即可。

在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为7.0，浓度优选为20mmol，所述磷酸盐缓冲液的成分优选包括氯化钠，所述氯化钠的浓度优选为0.2～0.6mol/l，更优选为0.3～0.5mol/l。

本发明对所述分散的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。在本发明中，所述肌球蛋白分散体的浓度优选为10～40mg/ml，更优选为20～30mg/ml。

得到肌球蛋白分散体后，本发明调节ph值至5.0～9.0，加热后，得到自组装多层次动物源蛋白水凝胶。在本发明中，调节ph值至5.0～9.0前，优选将所述肌球蛋白分散体进行搅拌；所述搅拌的温度优选为10℃；本发明优选进行搅拌直至所述肌球蛋白分散体充分水合即可。本发明在上述温度条件进行搅拌能够保证肌球蛋白不发生变性或沉淀，避免外界因素对肌球蛋白温度的影响而造成其溶解性下降或者变性。

在本发明中，调节ph值所用试剂优选为盐酸或氢氧化钠；所述盐酸或氢氧化钠优选以水溶液的形式使用，所述盐酸的溶液或氢氧化钠的溶液的浓度优选为1mol/l。本发明对所述调节ph值的具体过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程能够达到上述ph条件即可。本发明调节ph值改变肌球蛋白分散体的静电斥力，使肌球蛋白发生不同程度的聚集，形成一定的空间结构。

在本发明中，所述加热的温度为75～95℃，优选为80～90℃，时间为30～45min，优选为35～40min；所述加热的方式优选为水浴加热。本发明通过控制ph值，改变静电斥力，使肌球蛋白发生不同程度的聚集，形成肌球蛋白聚集体，然后在加热过程中肌球蛋白聚集体进行自组装，从而肌球蛋白聚集体的形态、粒径和电位均发生变化，蛋白质二级结构发生转变(α-螺旋转变为β-折叠)，肌球蛋白聚集体的形态同样发生改变，同时疏水基团暴露，二硫键形成，促使聚集体形成不同结构(比如ph5.0呈现海绵状结构、ph7.0呈现海马状结构、ph9.0呈现三维网状结构)，从而得到自组装多层次动物源蛋白水凝胶。

完成所述加热后，本发明优选将所得体系冷却到室温，得到自组装多层次动物源蛋白水凝胶。本发明对所述冷却的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。

本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的自组装多层次动物源蛋白水凝胶。在本发明中，所述自组装多层次动物源蛋白水凝胶有肌球蛋白聚集体组成，所述自组装多层次动物源蛋白水凝胶的电位为-2～-9mv，平均粒径为180～1230nm，α-螺旋含量为29～40％，β-折叠为31～40％。

本发明提供了上述技术方案所述自组装多层次动物源蛋白水凝胶作为载体在食品中递送活性成分和吸附脂类物质的应用。本发明制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶具有多层次结构(包括二维结构和三维结构)，具有高黏弹特性，而且在聚集体形成过程中，疏水氨基酸基团暴露，产生较多结合位点，促使聚集体和油脂以及活性物质结合，形成稳定的复合物，进而可以实现水凝胶吸附油脂和递送活性物质，而且蛋白质二级结构发生转变，有助于蛋白质吸附行为，因此本发明所述自组装多层次动物源蛋白水凝胶可用于食品中递送活性成分和吸附脂类物质。在本发明中，所述应用的方法优选为将所述自组装多层次动物源蛋白水凝胶与油脂类物质混合即可。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

对猪背最长肌依次进行提取和纯化，得到肌球蛋白(纯度90％)；

将0.2g肌球蛋白分散于含nacl(0.6m，ph7.0)的磷酸盐缓冲液(20ml，20mm)中，将上述肌球蛋白分散体(10mg/ml)在10℃下搅拌至充分水合后，采用盐酸水溶液(浓度1mol/l)将ph值调至5.0，然后在75℃水浴条件下加热30min，冷却到室温，得到自组装多层次动物源蛋白水凝胶(即聚集体)；

对实施例1在0.6mnacl浓度下制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶进行电位、粒径、蛋白质二级结构测试，采用bt-9300st激光粒度分布仪测定水凝胶的粒径大小与粒度的分布，检测参数设定为：介质设定为蒸馏水，遮光率设置为1.3，物质的折射率设置为1.5，原始数据经软件分析，最终结果选取d10、d50、d90、体积分数和累积分数进行表示；测定次数为3次，重复3次。

电位：用nanozs-90zeta电位仪测定水凝胶的zeta电位值，温度设置为25℃，每个处理组平行测6次，实验重复3次。

蛋白质二级结构：拉曼光谱的检测用evolution激光显微共聚拉曼光谱仪测量，拉曼光谱的检测条件为：狭缝为200μm，600g·mm^-1光栅，3次扫描，积分时间25s，分辨率为2cm^-1，数据获取速度为120cm^-1/min，获取的拉曼光谱在400～3600cm^-1，每个样品重复检测三次；测试得到的数据通过labspec软件进行处理，得到光谱图；然后依据丙氨酸环在1001cm^-1处的强度对图谱进行归一化处理，得到光谱条带，采用alix方法计算蛋白质二级结构的含量。

结果表明，在ph值为5.0时，肌球蛋白水凝胶的电位为-2.68mv，平均粒径为1226.00nm，α-螺旋含量为29.54％，β-折叠为39.13％。

实施例2

本实施例与实施例1的区别仅在于：无需调节ph值，即ph值为7.0，其他同实施例1。

按照实施例1的方法对0.6mnacl浓度下制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶进行测试，结果表明，在ph值为7.0时，肌球蛋白水凝胶(0.6mnacl)的电位为-5.00mv，平均粒径为540.97nm，α-螺旋含量为31.51％，β-折叠为37.63％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别仅在于：采用氢氧化钠水溶液(浓度1mol/l)调节ph值至9.0，其他同实施例1。

按照实施例1的方法对0.6mnacl浓度下制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶进行测试，结果表明，在ph值为9.0时，肌球蛋白水凝胶(0.6mnacl)的电位为-8.45mv，平均粒径为183.37nm，α-螺旋含量为39.37％，β-折叠为31.60％。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于：采用盐酸溶液(浓度1mol/l)调节ph值至3.0，其他同实施例1。

按照实施例1的方法对0.6mnacl浓度下制备的自组装多层次动物源蛋白聚集体进行测试，结果表明，在ph值为3.0时，肌球蛋白聚集体(0.6mnacl)的电位为6.02mv，平均粒径为1133.00nm，α-螺旋含量为24.54％，β-折叠为42.97％。

应用例

分别将实施例1～3制备的肌球蛋白水凝胶与非转基因大豆油按照4:1(v/v)在均质机中混合，将所得乳液在4℃进行均质，转速为14000rpm，时间为90s，在4℃保藏，得到乳化凝胶；

将对比例1制备的肌球蛋白聚集体与非转基因大豆油按照4:1(v/v)在均质机中混合，将所得乳液在4℃进行均质，转速为14000rpm，时间为90s，在4℃保藏，得到乳状液。

性能测试

1)对实施例1在ph5.0制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶进行微观结构afm测试，结果见图1；对采用实施例1制备的水凝胶与大豆油所制成的乳化凝胶进行sem测试，结果见图2。

由图1可知，在ph5.0时，肌球蛋白聚集体发生自组装行为形成海绵状纤维结构的水凝胶，并含有部分棒状结构。而图2中的乳化凝胶与水凝胶的结构相同，呈现纤维网状结构。

2)对实施例2在ph7.0制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶进行微观结构afm测试，结果见图3，对采用实施例2制备的水凝胶与大豆油所制成的乳化凝胶进行sem测试，结果见图4。

由图3可知，在ph7.0时，肌球蛋白聚集体发生自组装行为形成弯曲的海马状结构的水凝胶，即弯曲棒状结构。而图4中的乳化凝胶与水凝胶的结构相同，也呈现弯曲棒状结构。

3)对实施例3在ph9.0制备的自组装多层次动物源蛋白水凝胶进行afm测试，结果见图5，对采用实施例3制备的水凝胶与大豆油所制成的乳化凝胶进行sem测试，结果见图6。

由图5可知，在ph9.0时，肌球蛋白聚集体发生自组装行为形成三维凝胶网络结构，即形成水凝胶状态，网状结构较大；说明碱热处理(ph9.0，碱性条件)可以产生尺寸较小的聚集体，形成三维网状结构，有利于水凝胶的形成，较低的β-折叠状结构有助于形成多层凝胶网络结构。由图6可知，水凝胶结构的聚集体与大豆油脂乳化后呈现出聚集体三维网状结构，能够提高乳化凝胶的黏弹特性。

4)对对比例1在ph3.0制备的自组装多层次动物源蛋白聚集体进行afm测试，结果见图7，对采用对比例1制备的聚集体与大豆油所制成的乳化液进行sem测试，结果见图8。

由图7可知，在ph3.0时，肌球蛋白聚集物呈“纤维链”状，出现大量晶核并与纤维丝相连接，其形状为串珠状聚集体。酸热诱导(ph为3.0，酸性条件)的聚合物具有纤维状的形状，这使得更多的连接位点包裹油滴，而且，通过静电作用、疏水基团和二硫键，形成较高的折叠结构，导致肌球蛋白大量聚集形成丝状体。由图8可知，纤维结构聚集体与大豆油脂乳化后具有丝状体结构，乳状液具有相同的结构，纤维枝状结构紧紧包裹聚集体，未能形成三维水凝胶结构。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。