一种苹果酵素及其制备方法与流程

本发明涉及发酵
技术领域：
，具体涉及一种苹果酵素及其制备方法。
背景技术：
：根据中国生物发酵产业协会的定义，酵素是指以果蔬或其他动、植物等为原料，采用自然或人工接种微生物发酵工艺，后经提取所制得的具有某些特定功能的发酵制品。酵素不仅保存了发酵原料中原有的营养物质，如多酚类、黄酮类、花青素等，而且通过有益菌的发酵代谢产生了一些新的生物活性成分，如有机酸，氨基酸等。与发酵前相比，微生物的转化使得这些小分子物质更易于人体吸收。近十年，微生物酵素功能性制品产业在全球开始大规模兴起，产业规模不断扩大。纯种发酵是在成分单一的发酵基质中，仅接入一种或几种微生物，通过对该微生物的培养，得到纯度较高的单一性产物。不同于自然发酵，其发酵时间短，易控制，十分适合酵素的产业化生产。但是为使发酵顺利进行，要求人工扩大的菌种不得被污染。因而对发酵设备和环境要求较高，要有严格的灭菌措施和空气净化系统。发酵用菌种也必须是经严格研究后筛选出的最适合生产的菌种。苹果酵素不仅保持了苹果原初营养和风味，还将赋予其益生菌所产生的抗氧化活性，为消费者提供新的功能性产品。但目前的水果酵素制作主要存在：发酵时间长，影响水果原料稳定性；发酵菌种性能和稳定性差，影响酵素中天然的活性物质等问题；发酵菌种酒精产量较高，不适合应用于饮料和化妆品领域。技术实现要素：本发明的目的在于提出一种苹果酵素及其制备方法，具有很好的抗氧化、抗菌、消炎、抗敏感、促消化的活性，与自然发酵所得的苹果酵素相比，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金色葡萄球菌及痤疮病原菌都有抑制作用，能显著增进白血球作用，清除入侵病菌与化脓物，且其抗氧化活性显著提高，还起到了较好的改善肠道菌群，提高免疫力，增强体质的作用，可以广泛应用于食品、化妆品原料中。本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供一种苹果酵素的制备方法，将含有发酵液和苹果料的发酵罐中接种发酵乳杆菌和小片球菌混合菌悬液，得到发酵体系，同时加入纤维素酶和果胶酶以及苏氨酸，调节ph值，在30-35℃下发酵3-5h，加入维生素料和微量元素料，升温至35-40℃，继续发酵6-8h，加入天冬氨酸和半胱氨酸，继续发酵35-37h，离心，浓缩，得到苹果酵素。作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：s1.培养基的配置：将蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、柠檬酸、吐温、硫酸镁、琼脂、碳酸钙、氯化锰、维生素c、蒸馏水混合均匀后，灭菌；s2.混合菌悬液的配置：将发酵乳杆菌和小片球菌分别37℃活化增殖培养24h后，接种至步骤s1所述的培养基中，于35-40℃恒温培养24-48h，直至菌浓度达到2×109cfu/ml；s3.苹果的前处理：将新鲜苹果洗净、去皮后，切碎，冷冻干燥，粉碎至100目-200目，15-20℃下干燥保存，得到苹果粉；s4.苹果酵素的制备：将步骤s3中的苹果粉加入发酵罐，按照固液比1g：(3-7)ml加入发酵液，并将步骤s2中的混合菌悬液接种于发酵罐内，得到发酵体系，同时加入纤维素酶和果胶酶，并加入苏氨酸，用氨水调节ph值，在30-35℃下发酵3-5h后，加入维生素料和微量元素料，混合均匀后，升温至35-40℃，继续发酵6-8h，加入天冬氨酸和半胱氨酸，混合均匀后，继续发酵35-37h，发酵过程中通过氨水调节ph值，发酵结束后，灭菌，离心，弃除固体，液体通过超滤膜浓缩后，冷冻干燥，得到苹果酵素。作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述培养基由以下原料按重量份制备而成：蛋白胨5-15份、酵母粉2-7份、葡萄糖2-7份、柠檬酸1-3份、吐温-800.5-1.5份、硫酸镁0.1-0.3份、琼脂10-20份、碳酸钙5-10份、氯化锰0.1-0.2份、维生素c1-3份、蒸馏水800-1200份。作为本发明的进一步改进，步骤s1和步骤s4中所述灭菌条件为在120-125℃保持10-20min。作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述发酵乳杆菌和小片球菌的质量比为(2-5)：(1-3)。作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述冷冻干燥条件为-10℃保持10-20min后，-20℃保持10-20h。作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述混合菌悬液的接种量为2-4％(v/v)；所述纤维素酶和果胶酶的质量比为1：(0.5-2)，酶活力分别为50-100u/g和20-50u/g，添加量为体系总质量的2-5％；所述苏氨酸的添加量为体系总质量的0.5-1％；所述维生素料的添加量为体系总质量的1-2％；所述微量元素料的添加量为体系总质量的0.2-0.5％；所述天冬氨酸的添加量为体系总质量的0.7-1.2％；所述半胱氨酸的添加量为体系总质量的0.5-1％；所述ph值调节在7.5-8.5内。作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述维生素料为维生素b12和维生素k，质量比为1：(2-3)；所述微量元素料为氯化钙和硫酸亚铁，质量比(1-3)：1。作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述发酵液由以下原料按重量份混合而成：蛋白胨5-10份、氯化铵1-3份、磷酸氢二钾2-4份、尿素2-5份、氯化钠1-2份、七水合硫酸锌0.2-0.5份、氯化锰0.1-0.3份、去离子水200-500份。本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的苹果酵素。本发明具有如下有益效果：本发明的一种苹果酵素，由于制备采用的原料苹果是纯天然的，利用混合菌液(发酵乳杆菌和小片球菌)发酵，其中，发酵乳杆菌能发酵多种糖，产乳酸能力强，能使菌斑ph降至5.5以下，而且有很高的耐酸力，它能发酵核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、l-阿拉伯糖及甘露醇，另外，小片球菌进一步能加快发酵速率，并将蛋白质转化为短肽、活性肽等物质，通过控制发酵过程中的营养供给，有效的降低了苹果酵素营养成分的损失，将苹果中的多糖、蛋白类营养物质转化为易吸收的小分子类物质，最大限度保留了苹果酵素活性。本发明的一种苹果酵素，由于制备过程所用的发酵时间控制在50h以内，从而避免了苹果本身含有的风味物质和酵素物质的损失。本发明的一种苹果酵素的制备方法中，在酵素制备过程中，在发酵起始时添加适量纤维素酶和果胶酶以及苏氨酸，并在对数生长期晚期分别添加天冬氨酸和半胱氨酸可使营养成分产量显著提高；维生素和微量元素为是许多发酵微生物的重要营养物质，在本发明发酵液中，在微生物生长的对数期初期加入特定的维生素料和微量元素料，维生素料的添加起到延长发酵稳定期的作用，微量元素料的添加起到提高微生物抗性的作用，从而能够有效提高发酵速率，提高营养物质的产量，通过本发明试验发现，本发明添加合适量的维生素b12、维生素k的添加，以及氯化钙和硫酸亚铁的添加具有协同增效的作用；本发明制得的苹果酵素具有很好的抗氧化、抗菌、消炎、抗敏感、促消化的活性，与自然发酵所得的苹果酵素相比，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金色葡萄球菌及痤疮病原菌都有抑制作用，能显著增进白血球作用，清除入侵病菌与化脓物，且其抗氧化活性显著提高，还起到了较好的改善肠道菌群，提高免疫力，增强体质的作用，可以广泛应用于食品、化妆品原料中。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明测试例3中各组清除dpph自由基能力的对比图；图2为本发明测试例4中各组清除abts自由基能力的对比图。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1制备方法：s1.培养基的配置：将蛋白胨5g、酵母粉2g、葡萄糖2g、柠檬酸1g、吐温-800.5g、硫酸镁0.1g、琼脂10g、碳酸钙5g、氯化锰0.1g、维生素c1g、蒸馏水800g混合均匀后，灭菌，灭菌条件为在120℃保持10min；s2.混合菌悬液的配置：将2g发酵乳杆菌和1g小片球菌分别37℃活化增殖培养24h后，接种至步骤s1所述的培养基中，于35℃恒温培养24h，直至菌浓度达到2×109cfu/ml；s3.苹果的前处理：将新鲜苹果洗净、去皮后，切碎，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持10min后，-20℃保持10h，粉碎至100目，15℃下干燥保存，得到苹果粉；s4.苹果酵素的制备：将步骤s3中的苹果粉加入发酵罐，按照固液比1g：3ml加入发酵液，并将步骤s2中的混合菌悬液接种于发酵罐内，混合菌悬液的接种量为2％(v/v)，得到发酵体系，同时加入纤维素酶和果胶酶，纤维素酶和果胶酶的质量比为1：0.5，添加总量为体系总质量的2％，并加入苏氨酸，添加量为体系总质量的0.5％，用氨水调节ph值为7.5，在30℃下发酵3-5h后，加入维生素料和微量元素料，添加量分别为体系总质量的1％和0.2％，混合均匀后，升温至35℃，继续发酵6h，加入天冬氨酸和半胱氨酸，添加量分别为体系总质量的0.7％和0.5％，混合均匀后，继续发酵35h，发酵过程中通过氨水调节ph值为7.5，发酵结束后，灭菌，灭菌条件为在120℃保持10min，3000r/min离心10min，弃除固体，液体通过超滤膜浓缩后，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持10min后，-20℃保持10h，得到苹果酵素；维生素料为维生素b12和维生素k，质量比为1：2；微量元素料为氯化钙和硫酸亚铁，质量比1：1；发酵液由以下原料按重量份混合而成：蛋白胨5份、氯化铵1份、磷酸氢二钾2份、尿素2份、氯化钠1份、七水合硫酸锌0.2份、氯化锰0.1份、去离子水200份。实施例2制备方法：s1.培养基的配置：将蛋白胨15g、酵母粉7g、葡萄糖7g、柠檬酸3g、吐温-801.5g、硫酸镁0.3g、琼脂20g、碳酸钙10g、氯化锰0.2g、维生素c3g、蒸馏水1200g混合均匀后，灭菌，灭菌条件为在125℃保持20min；s2.混合菌悬液的配置：将5g发酵乳杆菌和3g小片球菌分别37℃活化增殖培养24h后，接种至步骤s1所述的培养基中，于40℃恒温培养48h，直至菌浓度达到2×109cfu/ml；s3.苹果的前处理：将新鲜苹果洗净、去皮后，切碎，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持20min后，-20℃保持20h，粉碎至200目，20℃下干燥保存，得到苹果粉；s4.苹果酵素的制备：将步骤s3中的苹果粉加入发酵罐，按照固液比1g：7ml加入发酵液，并将步骤s2中的混合菌悬液接种于发酵罐内，混合菌悬液的接种量为4％(v/v)，得到发酵体系，同时加入纤维素酶和果胶酶，纤维素酶和果胶酶的质量比为1：2，添加总量为体系总质量的5％，并加入苏氨酸，添加量为体系总质量的1％，用氨水调节ph值为8.5，在35℃下发酵5h后，加入维生素料和微量元素料，添加量分别为体系总质量的2％和0.5％，混合均匀后，升温至40℃，继续发酵8h，加入天冬氨酸和半胱氨酸，添加量分别为体系总质量的1.2％和1％，混合均匀后，继续发酵37h，发酵过程中通过氨水调节ph值为8.5，发酵结束后，灭菌，灭菌条件为在125℃保持20min，3000r/min离心10min，弃除固体，液体通过超滤膜浓缩后，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持20min后，-20℃保持20h，得到苹果酵素；维生素料为维生素b12和维生素k，质量比为1：3；微量元素料为氯化钙和硫酸亚铁，质量比3：1；发酵液由以下原料按重量份混合而成：蛋白胨10份、氯化铵3份、磷酸氢二钾4份、尿素5份、氯化钠2份、七水合硫酸锌0.5份、氯化锰0.3份、去离子水500份。实施例3制备方法：s1.培养基的配置：将蛋白胨10g、酵母粉5g、葡萄糖5g、柠檬酸2g、吐温-801g、硫酸镁0.2g、琼脂15g、碳酸钙7g、氯化锰0.15g、维生素c2g、蒸馏水1000g混合均匀后，灭菌，灭菌条件为在122℃保持15min；s2.混合菌悬液的配置：将3.5g发酵乳杆菌和2g小片球菌分别37℃活化增殖培养24h后，接种至步骤s1所述的培养基中，于37℃恒温培养36h，直至菌浓度达到2×109cfu/ml；s3.苹果的前处理：将新鲜苹果洗净、去皮后，切碎，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持15min后，-20℃保持15h，粉碎至200目，17℃下干燥保存，得到苹果粉；s4.苹果酵素的制备：将步骤s3中的苹果粉加入发酵罐，按照固液比1g：5ml加入发酵液，并将步骤s2中的混合菌悬液接种于发酵罐内，混合菌悬液的接种量为3％(v/v)，得到发酵体系，同时加入纤维素酶和果胶酶，纤维素酶和果胶酶的质量比为1：1，添加总量为体系总质量的3.5％，并加入苏氨酸，添加量为体系总质量的0.7％，用氨水调节ph值为8，在32℃下发酵4h后，加入维生素料和微量元素料，添加量分别为体系总质量的1.5％和0.35％，混合均匀后，升温至37℃，继续发酵7h，加入天冬氨酸和半胱氨酸，添加量分别为体系总质量的1％和0.7％，混合均匀后，37℃继续发酵36h，发酵过程中通过氨水调节ph值为8，发酵结束后，灭菌，灭菌条件为在122℃保持15min，3000r/min离心10min，弃除固体，液体通过超滤膜浓缩后，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持15min后，-20℃保持15h，得到苹果酵素；维生素料为维生素b12和维生素k，质量比为1：2.5；微量元素料为氯化钙和硫酸亚铁，质量比2：1；发酵液由以下原料按重量份混合而成：蛋白胨7份、氯化铵2份、磷酸氢二钾3份、尿素3.5份、氯化钠1.5份、七水合硫酸锌0.35份、氯化锰0.2份、去离子水350份。实施例4与实施例3相比，维生素料全部为维生素b12，其他条件均不改变。实施例5与实施例3相比，维生素料全部为维生素k，其他条件均不改变。实施例6与实施例3相比，微量元素料全部为氯化钙，其他条件均不改变。实施例7与实施例3相比，微量元素料全部为硫酸亚铁，其他条件均不改变。对比例1与实施例3相比，未添加发酵乳杆菌，其他条件均不改变。s2.混合菌悬液的配置：将5.5g小片球菌活化增殖培养后，接种至步骤s1所述的培养基中，于37℃恒温培养36h，直至菌浓度达到2×109cfu/ml。对比例2与实施例3相比，未添加小片球菌，其他条件均不改变。s2.混合菌悬液的配置：将5.5g发酵乳杆菌活化增殖培养后，接种至步骤s1所述的培养基中，于37℃恒温培养36h，直至菌浓度达到2×109cfu/ml。对比例3与实施例3相比，未添加维生素料，其他条件均不改变。s4.苹果酵素的制备：将步骤s3中的苹果粉加入发酵罐，按照固液比1g：5ml加入发酵液，并将步骤s2中的混合菌悬液接种于发酵罐内，混合菌悬液的接种量为3％(v/v)，得到发酵体系，同时加入纤维素酶和果胶酶，添加量为体系总质量的3.5％，并加入苏氨酸，添加量为体系总质量的0.7％，用氨水调节ph值为8，在32℃下发酵4h后，加入微量元素料，添加量为体系总质量的1.85％，混合均匀后，升温至37℃，继续发酵7h，加入天冬氨酸和半胱氨酸，添加量分别为体系总质量的1％和0.7％，混合均匀后，继续发酵36h，发酵过程中通过氨水调节ph值为8，发酵结束后，灭菌，灭菌条件为在122℃保持15min，3000r/min离心10min，弃除固体，液体通过超滤膜浓缩后，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持15min后，-20℃保持15h，得到苹果酵素。对比例4与实施例3相比，未添加微量元素料，其他条件均不改变。s4.苹果酵素的制备：将步骤s3中的苹果粉加入发酵罐，按照固液比1g：5ml加入发酵液，并将步骤s2中的混合菌悬液接种于发酵罐内，混合菌悬液的接种量为3％(v/v)，得到发酵体系，同时加入纤维素酶和果胶酶，添加量为体系总质量的3.5％，并加入苏氨酸，添加量为体系总质量的0.7％，用氨水调节ph值为8，在32℃下发酵4h后，加入微量元素料，添加量为体系总质量的1.85％，混合均匀后，升温至37℃，继续发酵7h，加入天冬氨酸和半胱氨酸，添加量分别为体系总质量的1％和0.7％，混合均匀后，继续发酵36h，发酵过程中通过氨水调节ph值为8，发酵结束后，灭菌，灭菌条件为在122℃保持15min，3000r/min离心10min，弃除固体，液体通过超滤膜浓缩后，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持15min后，-20℃保持15h，得到苹果酵素。对比例5与实施例3相比，未添加天冬氨酸，其他条件均不改变。s4.苹果酵素的制备：将步骤s3中的苹果粉加入发酵罐，按照固液比1g：5ml加入发酵液，并将步骤s2中的混合菌悬液接种于发酵罐内，混合菌悬液的接种量为3％(v/v)，得到发酵体系，同时加入纤维素酶和果胶酶，添加量为体系总质量的3.5％，并加入苏氨酸，添加量为体系总质量的0.7％，用氨水调节ph值为8，在32℃下发酵4h后，加入微量元素料，添加量为体系总质量的1.85％，混合均匀后，升温至37℃，继续发酵7h，加入半胱氨酸，添加量为体系总质量的1.7％，混合均匀后，继续发酵36h，发酵过程中通过氨水调节ph值为8，发酵结束后，灭菌，灭菌条件为在122℃保持15min，3000r/min离心10min，弃除固体，液体通过超滤膜浓缩后，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持15min后，-20℃保持15h，得到苹果酵素。对比例6与实施例3相比，未添加半胱氨酸，其他条件均不改变。s4.苹果酵素的制备：将步骤s3中的苹果粉加入发酵罐，按照固液比1g：5ml加入发酵液，并将步骤s2中的混合菌悬液接种于发酵罐内，混合菌悬液的接种量为3％(v/v)，得到发酵体系，同时加入纤维素酶和果胶酶，添加量为体系总质量的3.5％，并加入苏氨酸，添加量为体系总质量的0.7％，用氨水调节ph值为8，在32℃下发酵4h后，加入微量元素料，添加量为体系总质量的1.85％，混合均匀后，升温至37℃，继续发酵7h，加入半胱氨酸，添加量为体系总质量的1.7％，混合均匀后，继续发酵36h，发酵过程中通过氨水调节ph值，发酵结束后，灭菌，灭菌条件为在122℃保持15min，3000r/min离心10min，弃除固体，液体通过超滤膜浓缩后，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持15min后，-20℃保持15h，得到苹果酵素。对比例7与实施例3相比，未添加天冬氨酸和半胱氨酸，其他条件均不改变。s4.苹果酵素的制备：将步骤s3中的苹果粉加入发酵罐，按照固液比1g：5ml加入发酵液，并将步骤s2中的混合菌悬液接种于发酵罐内，混合菌悬液的接种量为3％(v/v)，得到发酵体系，同时加入纤维素酶和果胶酶，添加量为体系总质量的3.5％，并加入苏氨酸，添加量为体系总质量的0.7％，用氨水调节ph值为8，在32℃下发酵4h后，加入微量元素料，添加量为体系总质量的1.85％，混合均匀后，升温至37℃，继续发酵43h，发酵过程中通过氨水调节ph值为8，发酵结束后，灭菌，灭菌条件为在122℃保持15min，3000r/min离心10min，弃除固体，液体通过超滤膜浓缩后，冷冻干燥，冷冻干燥条件为-10℃保持15min后，-20℃保持15h，得到苹果酵素。测试例1对青春痘主要致病菌的体外抑菌作用研究(1)培养基配制：按常规方法配制痤疮丙酸杆菌固体培养基(1升蒸馏水中加入：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖5.0g、氯化钠5.0g、酵母膏3.0g、乙酸钠3.0g、可溶性淀粉1.0g、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂15.0g)，将培养基加入三角瓶中用纱布封口，经121℃灭菌20min后倒入培养皿中冷却后备用；按常规方法配制痤疮丙酸杆菌液体培养基(1升蒸馏水中加入：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖5.0g、氯化钠5.0g、酵母膏3.0g、乙酸钠3.0g、可溶性淀粉1.0g、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g)，将培养基加入三角瓶中用纱布封口，经121℃灭菌20min后备用；(2)痤疮丙酸杆菌活化：用接种环挑去痤疮丙酸杆菌甘油冻存管保藏菌种一环在痤疮丙酸杆菌固体培养基划线，然后置于35℃培养箱中厌氧培养24h，得到培养皿上活化过的痤疮丙酸杆菌；(3)菌液制备：取步骤(2)所得的培养皿上活化过的痤疮丙酸杆菌一环接种到痤疮丙酸杆菌液体培养基，35℃厌氧培养24h，得到痤疮丙酸杆菌菌液；(4)抑菌试验：以无菌操作将0.1ml步骤(3)痤疮丙酸杆菌菌液加入到步骤(1)所得的痤疮丙酸杆菌固体培养基上中央，用涂布棒涂布均匀，直到几乎完全涂干，然后在痤疮丙酸杆菌固体培养基表面直接垂直放上3个牛津杯(所述牛津杯为内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑)，轻轻加压，使其与痤疮丙酸杆菌培养基接触无空隙；然后在4个牛津杯中分别加入240μl上述实施例1-7和对比例1-7所得的苹果酵素以及市售苹果酵素，勿使苹果酵素外溢，加完后置35℃厌氧培养24h，测量抑菌圈的大小，结果见表1。表1不同组酵素的抑菌圈大小组别抑菌圈直径(mm)实施例116.2实施例216.6实施例317.5实施例412.1实施例511.9实施例613.2实施例713.8对比例17.5对比例27.0对比例38.9对比例49.5对比例510.2对比例610.6对比例78.3市售4.5由表1可知，本发明实施例1-3制得的苹果酵素抑菌圈直径在16.2-17.5mm，与市售同类产品相比，具有更好的抑菌效果，能够显著抑制痤疮丙酸杆菌的活性。测试例2酒精度测定采用酒精计法分别对实施例1-7和对比例1-7以及市售苹果酵素中的酒精度进行检测，其步骤如下：分别取100ml实施例1-7和对比例1-7以及市售苹果酵素于200ml蒸馏瓶中，再加几颗洁净玻璃珠，连接冷凝器，以100ml容量瓶作接收器(外加冰浴)，开启冷凝水，缓慢加热蒸馏，收集馏出液接近刻度，于20℃水浴中保温30min，补加水至刻度，混匀，倒入洁净、干燥的100ml量筒中，静止数分钟，待其中气泡消失后，放入洗净、干燥的酒精计(uoe，武强县精诚仪表厂)，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡5min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度，根据测得的酒精计示值和温度，查酒精计温度浓度换算表，换算成20℃时酒精度。每个样品平行测定3次，所得结果表示至两位小数。结果见表2。表2不同组酒精度值由表2可知，本发明实施例1-3制得的苹果酵素酒精度在0.24-0.31％，与市售同类产品相比，酒精度显著降低。测试例3清除dpph自由基能力的测定(1)dpph工作液的配制：精密称取19.7mgdpph，用甲醇溶解，定容到50ml，于4℃下避光保存，即得dpph储备液。实验前移10mldpph储备液，用甲醇定容到100ml，制成浓度为0.1mmol·l-1的工作液。(2)维生素c标准液的配制：准确称取10.00mg维生素c，用蒸馏水溶解，定容到10ml，即得维生素c标准液。测定前，分别移取50、100、150、200、250μl标准液，分别稀释到10ml，测定吸光度。(3)苹果酵素工作液的配制：精密吸取100μl苹果酵素原液(分别为实施例1-7和对比例1-7以及市售苹果酵素)，用蒸馏水稀释到10ml，再移取1000μl工作液，分别稀释到10ml，即得苹果酵素工作液。(4)苹果酵素清除dpph自由基能力的测定：在试管中加入3.2ml0.10mmol·l-1的dpph溶液，再加0.8ml苹果酵素工作液，将其混匀后，25℃避光反应30min，于517nm波长下测定吸光度，维生素c作为阳性对照。测吸光度，按式(1)计算dpph自由基的清除率(％)。清除率＝(a0-aj)/a0×100％(1)式中：a0为dpph溶液和蒸馏水混合液的吸光度；aj为苹果酵素工作液和dpph混合液的吸光度。结果见图1。测试例4清除abts自由基能力测定(1)abts自由基工作液的配制：精密称定38.40mgabts和6.60mgk2s2o8于烧杯中，并用蒸馏水定容至100ml，使得abts的终浓度为7mmol·l-1，过硫酸钾的终浓度为2.45mmol·l-1。将混合液在常温下暗处放置12-16h，实验前用甲醇稀释，使其在734nm波长下吸光度为0.7±0.02左右，即得abts工作液。(2)维生素c标准液的配制：准确称取10.00mg维生素c，用蒸馏水溶解，定容到10ml，即得维生素c标准液。测定前，分别移取50、100、150、200、250μl标准液，分别稀释到10ml，测定吸光度。(3)苹果酵素工作液的配制：精密吸取200μl苹果酵素原液(分别为实施例1-7和对比例1-7以及市售苹果酵素)，用蒸馏水稀释到20ml，再分别移取2.5ml工作液，分别稀释到10ml，即得苹果酵素工作液。(4)苹果清除abts自由基能力的测定：以维生素c为阳性对照，向试管中加入3mlabts工作液，再加入0.3ml苹果酵素工作液，将其混匀后，25℃避光反应10min，在732nm波长处测定样品的吸光度。按式(2)计算abts自由基的清除率(％)。清除率＝(a01-aj1)/a01×100％(2)式中：a01为abts溶液和蒸馏水混合液的吸光度；aj1为苹果酵素工作液和abts混合液的吸光度。结果见图2。清除率越大表明对自由基的清除能力越强，由此表明其抗氧化能力越强。由图1和图2可知，本发明实施例1-3制得的苹果酵素具有极好的抗氧化效果，明显优于市售同类产品。维生素和微量元素为是许多发酵微生物的重要营养物质，实施例4、5与实施例3相比，分别只添加了单一的维生素b12或维生素k，其抗氧化效果稍有下降，酒精度提高，抑菌效果下降，对比例3与实施例3相比，未添加维生素料，其抗氧化效果显著下降，酒精度提高，且抑菌效果显著下降，在微生物生长的对数期初期加入特定的维生素料，维生素料的添加起到延长发酵稳定期的作用，从而提高了活性物质的产量，减少了厌氧发酵产生的酒精，且维生素b12和维生素k的添加，具有协同增效的作用。实施例6、7与实施例3相比，分别只添加了单一的氯化钙或硫酸亚铁，其抗氧化效果稍有下降，酒精度提高，抑菌效果下降，对比例4与实施例3相比，未添加微量元素料，其抗氧化效果显著下降，酒精度提高，且抑菌效果显著下降，在微生物生长的对数期初期加入特定的微量元素料，微量元素料的添加起到提高微生物抗性的作用，从而能够有效提高发酵速率，提高营养物质的产量，且氯化钙和硫酸亚铁的添加具有协同增效的的作用。对比例1和对比例2中分别只添加了单一的发酵菌，发酵乳杆菌或小片球菌，发酵菌是酵素中营养物质产生的主要因素，其对酵素的营养物质的种类、产量以及分布均有很大影响，单一的发酵菌不仅严重制约了苹果酵素中抑菌成分、抗氧化活性物质的产出，甚至还可能产生副产物酒精，将两种菌一同加入发酵，菌种之间不仅有互相促进作用，还有互相抑制的作用，从而促进抑菌成分、抗氧化成分的产出，而抑制相互的厌氧发酵，从而使酒精产量显著下降。对比例5、6、7中分别只添加了天冬氨酸、半胱氨酸或者两者均未添加，其效果为活性物质产量下降，而副产物(酒精)增多，在对数生长期晚期分别添加天冬氨酸和半胱氨酸可使营养成分产量显著提高，两者的添加具有协同增效的作用。与现有技术相比，本发明的一种苹果酵素，由于制备采用的原料苹果是纯天然的，利用混合菌液(发酵乳杆菌和小片球菌)发酵，其中，发酵乳杆菌能发酵多种糖，产乳酸能力强，能使菌斑ph降至5.5以下，而且有很高的耐酸力，它能发酵核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、l-阿拉伯糖及甘露醇，另外，小片球菌进一步能加快发酵速率，并将蛋白质转化为短肽、活性肽等物质，通过控制发酵过程中的营养供给，有效的降低了苹果酵素营养成分的损失，将苹果中的多糖、蛋白类营养物质转化为易吸收的小分子类物质，最大限度保留了苹果酵素活性。本发明的一种苹果酵素，由于制备过程所用的发酵时间控制在50h以内，从而避免了苹果本身含有的风味物质和酵素物质的损失。本发明的一种苹果酵素的制备方法中，在酵素制备过程中，在发酵起始时添加适量纤维素酶和果胶酶以及苏氨酸，并在对数生长期晚期分别添加天冬氨酸和半胱氨酸可使营养成分产量显著提高；维生素和微量元素为是许多发酵微生物的重要营养物质，在本发明发酵液中，在微生物生长的对数期初期加入特定的维生素料和微量元素料，维生素料的添加起到延长发酵稳定期的作用，微量元素料的添加起到提高微生物抗性的作用，从而能够有效提高发酵速率，提高营养物质的产量，通过本发明试验发现，本发明添加合适量的维生素b12、维生素k的添加，以及氯化钙和硫酸亚铁的添加具有协同增效的作用；本发明制得的苹果酵素具有很好的抗氧化、抗菌、消炎、抗敏感、促消化的活性，与自然发酵所得的苹果酵素相比，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金色葡萄球菌及痤疮病原菌都有抑制作用，能显著增进白血球作用，清除入侵病菌与化脓物，且其抗氧化活性显著提高，还起到了较好的改善肠道菌群，提高免疫力，增强体质的作用，可以广泛应用于食品、化妆品原料中。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12