一种提高中华鳖免疫力的饲料添加剂

1.本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种提高中华鳖免疫力的饲料添加剂。


背景技术：

2.目前我国中华鳖的养殖已走向工业化养殖道路，养殖集约化程度不断提升，且养殖规模不断扩大，养殖密度也不断增加。随着养殖规模的扩大，中华鳖养殖期间的病害也频繁发生。已知中华鳖疾病已有30余种，其中腐皮病、出血性肠炎、肋腺炎等为发病率较高的疾病，中华鳖免疫力下降导致各种疾病突发，其原因主要是免疫力下降导致机体防御机制减弱，细菌和病毒更容易侵害进入机体，从而引发一系列疾病。其中温室养殖的发病率较高，据统计温室养殖中华鳖的发病面积约为30～50％，死亡率约为20～50％。因此病害使养鳖业年经济损失达数亿元，已严重威胁着我国养鳖业的健康发展。
3.而水产药物抗生素和化学药品在水产动物病害防治中占有重要地位，因其疗效显著、生产使用简便、成本低廉等特点，成为水产动物疾病防治的重要手段之一。但抗生素和化学药品的大量使用不仅会造成水产品药物残留，危害人类健康，同时也产生微生物耐药及水环境污染等问题。
4.而中草药作为天然药物在防治水产动物疾病方面，因其毒副作用小、残留少、抗药性不明显等优点，在防治疾病中除了兼有药性，还可以通过对水产动物的营养作用，免疫增强作用，激素样作用等发挥预防治疗的目的。目前有关中草药对中华鳖免疫力提高效果的研究仍比较欠缺,如果直接采用其它动物使用的中草药，对于中华鳖来说，或是对于病害的治疗效果不好，或是虽然有治疗效果，但会严重影响中华鳖的生长。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种提高中华鳖免疫力的饲料添加剂，可增强中华鳖的免疫力和抗病能力，同时解决现有抗生素、化学品等药物饲料添加剂的大肆滥用的问题，导致致病原体的抗药性增强和抗生素在动物体内残留的问题。
6.本发明首先提供一种中草药混合物，包含有如下质量份的原料组分：黄芪10份、鱼腥草10份、五倍子10份、金银花10份、白头翁10份、石榴皮10份、黄连5份、山楂15份、艾叶10份、羊栖菜多糖10份。
7.本发明所提供的中草药混合物用于制备饲料添加剂；
8.所述的饲料添加剂为龟鳖类饲料添加剂；
9.本发明再一个方面提供一种鳖类饲料，所述的饲料中添加有上述的中草药原料制备的饲料添加剂；
10.作为优选，其中饲料添加剂在饲料中的添加量为1
‑
2％。
11.本发明所提供的饲料添加剂具有调节肠道菌群结构，止血诱食作用；该免疫增强剂配伍科学，材料易得，成本低廉，并且制备方法简单，可长期使用，可替代抗生素，具有预
防细菌性疾病的效果以及免疫增强作用。
附图说明
12.图1是本发明肠道各样品高通量测序结果的稀释性曲线图；
13.图2是本发明肠道各样品间的多样性比较图；
14.图3是本发明肠道各样品中细菌多样性的相关性分析图(图中数字为各样本中的otu数量)；
15.图4是样品丰度直观比较图；
16.图5是多个样品在各分类水平上组成的相似性和差异性图。
具体实施方式
17.在本发明中，通过科学配伍，将多种中草药组成复方作为中草药饲料添加剂比添加于常规鳖用粉料，连续投喂试验结果表明，添加中草药的试验组中华鳖各免疫酶活性增强，在试验期间的死亡率显著低于对照组，实验组体重略高于对照组，进一步对比分析两组中华鳖血清内免疫酶差异变化，显示添加中草药组中华鳖免疫力得到明显提高。
18.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
19.实施例1：中华鳖饲料添加剂制备
20.将干燥后的黄芪10份、鱼腥草10份、五倍子10份、金银花10份、白头翁10份、石榴皮10份、黄连5份、山楂15份、艾叶10份、羊栖菜多糖10份混合后，先用普通粉碎机制备成粗粉，再利用超微粉碎机进行微粉加工，粉碎粒度为80％通过200目筛，将加工好的中草药复方粉剂于阴凉干燥处保存备用，作为饲料添加剂。
21.实施例2：中草药添加剂水提液体外抑菌实验
22.(1)中草药水提液的制备：
23.将中草药复方及配方中10种抗菌中草药单方(艾叶、白头翁、黄连、黄芪、金银花、石榴皮、山楂、五倍子、鱼腥草、羊栖菜多糖)，分别置于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重，研磨成粉。称取中草药单方及复方粉各10g，分别按1∶10比例加入蒸馏水浸泡30min。置于电磁炉上煎煮至沸腾，煮沸后用文火煎煮30min，然后用4层纱布过滤，收集滤液。将过滤后的中草药继续添水煎煮，重复过滤2次。将滤液合并继续煎煮浓缩至10ml，使药液中生药含量为1g/ml。将水提液倒入50ml离心管中，高压灭菌后4℃保存备用。
24.(1)中草药水提液体外抑菌试验：
25.1.菌种的纯化与扩增:
26.用于体外抑菌试验的供试菌株包括：嗜水气假单胞菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、金黄杆菌属。将待测5种细菌分别接种于10mllb肉汤中增菌，按照其最适温度培养12h。
27.2.菌浓度的稀释：
28.取适量lb液于锥形瓶中按照1:100的比例加入菌液，摇菌3
‑
4h，用紫外分光光度计测定其od值。按照对应菌种的标准曲线，将菌浓度的稀释至1.5x108个/ml左右，倒入50ml离
心管备用。
29.3.涂布放置牛津杯：
30.取稀释后菌液涂于lb肉汤培养基上，每板100μl菌液。每个平板中放置3个灭菌后的牛津杯，牛津杯内加入中草药水提液100μl。按照各菌最适温度恒温培养24h后，测量平板上抑菌圈大小，每种中草药做3次平行重复实验。计算抑菌圈直径的平均值及样本数据的标准差，作为不同种类中草药对不同菌种抑菌能力的衡量标准。
31.(3)抑菌实验结果分析：
32.利用牛津杯法测定了中草药复方及配方中10种单方对5种水产常见致病菌的体外抑菌效果。结果显示不同菌株对不同中草药的敏感性存在一定差异，整体来看，石榴皮、山楂、五倍子以及黄连4种中药对5种测试菌的抑菌效果最明显，这四种药对5种菌平均抑菌直径均大于18mm；其次为鱼腥草、艾叶以及复方制剂的抑菌作用，这三种中药具有一定的抑菌效果，其对5种菌的平均抑菌直径为14mm左右；以及还有部分中草药的抑菌效果较弱，例如金银花、羊栖菜多糖，其对5种菌的平均抑菌直径在10mm左右。此外特殊的是，黄芪对5种菌均无明显抑菌效果；白头翁对金黄色葡萄球菌和嗜水气假单胞菌均无抑菌效果，但对苏云金芽孢杆菌、肺炎球菌以及金黄杆菌属具有较弱的抑菌效果(见表1)。
33.表1：中草药水提液对常见致病菌的抑菌圈(直径mm)
[0034][0035][0036]
牛津杯法抑菌圈直径与抑菌能力的关系如下：(抑菌圈直径d)
[0037]
d<10mm,无抑菌作用
[0038]
10mm<d<15mm,有轻度抑菌作用
[0039]
15mm<d<20mm，有中度抑菌作用
[0040]
d>20mm，有高度抑菌作用
[0041]
对于这5种致病菌而言，石榴皮、山楂、五倍子以及黄连具有较强的抑菌能力，其次为鱼腥草、艾叶以及复方制剂，金银花和羊栖菜多糖的抑菌能力较弱，黄芪无抑菌作用，白
头翁对菌种具有一定的针对性。而本发明的复方中草药剂对这几种常见致病菌种大都具有明显的抑菌作用。
[0042]
实施例3：中草药饲料添加剂对中华鳖肠道菌群影响的检测
[0043]
(1)实验动物分组与处理：从湖州某养殖场购入三个月大中华103只，平均体重在45.53g，体态良好，精神活力较佳，选取100只，随机分为十组，每组十只，为防止个体之间打架斗殴致死，每组体重差异在10g以内。前1
‑
5组为实验组，后6
‑
7组为对照组，处理组平均体重在48.46g，对照组体重在41.88g。本试验的中华鳖在相同环境的水箱内养殖，水温维持在28
±
2℃，每2
‑
3天换一次水。其中，实验组拌饲投喂中草药添加剂，每kg配合饲料粉添加中草药复方制剂20g(2％)，对照组仅投喂配合饲料粉，每天投喂1次，连续投喂37天。
[0044]
(2)取样和高通量测序分析：在实验投喂结束后，分别从投喂中草药复方微粉的实验组和对照组随机各取10只中华鳖，置于解剖盘中，体表用75％酒精棉球擦拭，然后用灭菌的剪刀镊子将鳖体解剖并剥离出肠道，用剪刀剪取中肠组织，挤出内容物至无菌离心管中，共有20个样品，分别为投喂中草药复复方剂鳖体肠道样品(cpg1
‑
10),及饲喂普通饲料对照组鳖体肠道样品(cg1
‑
10)。利用qia amp dna stool mini kic(qiagen)提取样品中的细菌总dna。以引物5'
‑
cctacgggnggcwgcag
‑
3'和5'
‑
gactachvgggtatctaatcc
‑
3'pcr扩增样品中细菌16s rdna v3
‑
v4区序列。pcr的反应体系总体积25μl，包含hot start flex 2x master mixart version12.5μl，forward primer(1μm)2.5μl，reverse primer(1μm)2.5μl，template dna 50ng,再加入无菌去离子水至25μl。pcr反应条件：98℃下预变性30s，98℃下变性10s，54℃下退火30s，72℃下延伸45s，共进行35个循环；最后在72℃延伸10min。扩增好的dna序列，pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳确证。在整个dna提取过程中，使用的是超纯水，而不是样品溶液，以排除假阳性pcr结果作为阴性对照的可能性，pcr产物由ampure xt bead(beckmancoulter genomics,danvers,ma,usa)纯化，qubit(invitrogen,usa)定量。扩增子池用于测序，扩增子文库的大小和数量分别在agilent2100生物分析仪(agilent，美国)illumina(kapabiosciences,woburn,ma，美国)的文库定量试剂盒上进行评估。在novaseqpe250平台上对库进行排序。
[0045]
(3)数据分析流程：样品在illumina novaseq平台上按照制造商的建议进行测序，由lc
‑
bio提供。根据样品独特的条形码，将配对端序列分配给样品，并将建库引入的barcode和引物序列去除。使用flash合并匹配端读取。根据fqtrim(v0.94)，在特定的过滤条件下对原始读数据进行质量过滤，以获得高质量的clean标签。使vsearch软件对嵌合序列进行过滤(v2.3.4)。利用dada2进行解调，得到特征表和特征序列。多样性和多样性通过归一化到相同的随机序列来计算。然后根据silva(release 132)分类器，利用每个样本的相对丰度对特征丰度进行归一化。alpha多样性用于分析样本物种多样性的复杂性，通过5个指标，包括chao1、observed、species、goods coverage、shannon、simpson，我们的样本中所有这些指标都是用qiime2计算出来的。beta多样性由qiime2计算，r包绘制。采用blast进行序列比对，每个代表性序列用silva数据库对特征序列进行注释。
[0046]
(4)测序结果的质量分析：对4个样品的高通量测序数据进行统计(见表二)。结果显示各样品获得的高质量序列数量都在4万条以上，保持在一个相当的水平，有效数据比值也均在90％以上，有效数据中数据质量≥q20的数据比例在95％以上，有效数据中数据质量≥q30的数据比例在90％以上，有效数据中数据gc含量也维持在50％以上。说明本次取样深
度可信。
[0047]
alpha多样性是指一个特定环境或生态系统内的多样性，主要用来反映物种丰富度和均匀度以及测序深度(见表3)。alpha多样性主要通过chao1、observed species、goods_coverage、shannon、simpson等指数来反映丰富度和均匀性。chao1,observed species指数主要反映样本的物种丰富度信息；说明实验组物种丰富度略高于对照组，。其中chao1和observed_species(见图1
‑
3、1
‑
4)主要是估计群落中包含物种的数目，goods coverage(见图1
‑
1)是指微生物覆盖率，其数值越高，则样本中新物种没有被测出的概率越低，该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况；shannon指数(见图1
‑
2)来源于信息熵，shannon指数越大，表示不确定性大。不确定性越大，表示这个群落中未知的因素越多，也就是多样性高；simpson(见图1
‑
5)数值范围在0
‑
1之间，当群里只有一种物种的时候，此时simpson值最小为0，同时也是我们直观理解的多样性最小。当物种种类无限多(丰富度最高)，并且每个物种数目都一致(均匀度最高)的时候，simpson值为最大为1。说明实验组肠道内容物中微生物群落的多样指数值略高于对照组的群落多样性，利用qiime软件对otu丰度矩阵中每个样本的序列总数在不同深度下随机抽样，以每个深度下抽取到的序列数及其对应的otu数绘制稀疏曲线(见图1)，随着随机抽取的序列数进一步增加，各样品曲线逐渐趋于平缓,表明有效测序数量已经能够较好地覆盖菌种的多样性，本次取样深度可信，测序结果能够真实地反映样品中优势细菌的数量关系。
[0048]
表2：有效数据统计表
[0049]
[0050][0051]
表3：alpha多样性分析表
[0052]
[0053][0054]
[0055]
(5)各样品中细菌多样性及优势otu种类的丰度分析：利用r语言工具统计和作图软件制作rank
‑
abundance曲线图(见图2)，每条折线代表一个样本的otu丰度分布，折线在横轴上的长度反映了该样本中otu数的多少，代表了群落的丰富度，折线越长表示样本中的otu数越多；折线的平缓程度则反映了群落组成的均匀度，折线越平缓，群落组成的均匀度越高，折线越陡峭，则群落中各otu间的丰度差异越大，均匀度越低。
[0056]
结果显示投喂中草药后肠道内容物(cpg)样品中的菌落丰富度显著高于对照组肠道内容物(cg)投喂前样品，且其菌落组成的均匀度也高于投喂前。对各个样品细菌多样性的相互关系进行分析，并构建venn图(见图3)。在中草药投喂后中华鳖肠道内容物中有324个共有otu。投喂中草药组中华鳖群落丰富度高于对照组中华鳖，中草药投喂后共有403个差异out。
[0057]
进一步对不同样品中的细菌门类及相对丰度进行统计，根据物种丰度表和物种注释表，默认选取丰度最高的30个物种分类，将每个样本/分组的相对丰度进行不同形式的展示。做柱状图以堆叠柱状图(见图4)形式展现,便于更直观地进行样品丰度的比较。
[0058]
在各个层级中，可以直观的看到优势菌种的表达情况，及在各个不同处理中的变化趋势。如图4
‑
1结果显示变形菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)、柔膜菌门(tenericutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)、放线菌门(actinobacteria)、酸杆菌门(acidobacteria)、蓝藻门(cyanobacteria)与梭杆菌门(fusobacteria)是各样品的优势门类。其中变形菌门与厚壁菌门的细菌类群占到总菌群的75％以上。进一步对各样品中优势细菌目的统计结果显示，如图4
‑
2，优势细菌目主要包括根瘤菌目(rhizobiales)、乳杆菌目(lactobacillales)、芽孢杆菌目(bacillales)、伯克氏菌目(burkholderiales)、枝原体目(mycoplasmatales)、梭菌目(clostridiales)、假单胞菌目(pseudomonadales)、肠杆菌目(enterobacteriales)、其中在实验组肠道内容样品中乳杆菌目与芽孢杆菌目细菌比例比对照组略有提升，而枝原体目细菌的比例有较为明显的下降，其他目的细菌比例没有明显差异变化。
[0059]
根据样品相对丰度表，将各分类水平相对丰度最高30个的群落组成数据根据分类单元的丰度分布或样本间的相似程度加以聚类，根据聚类结果对分类单元和样本分别排序，并通过热图(见图5)加以呈现。通过聚类，可以将高丰度和低丰度的分类单元加以区分，并以颜色梯度及相似程度来反映多个样品在各分类水平上组成的相似性和差异性。图中用蓝色到红色的渐变色反映丰度由低到高的变化，越趋近于蓝色，丰度越低，越趋近于红色，丰度越高。说明投喂中草药实验组丰度高于对照组。
[0060]
高通量测序数据分析结果显示，变形菌门(proteobacteria)和厚壁菌门(firmicutes)在养殖中华鳖肠道中占据优势地位，说明变形菌门和厚壁菌门是鳖类肠道的固有细菌门类，但是它们在不同鳖类肠道中所发挥的作用目前仍不明确。基于优势菌群比例的统计结果显示，投喂中草药的中华鳖肠道内微生物菌群比例变化略大于对照组中华鳖。venn图分析结果也显示实验组与对照组肠道内容物中差异otu数量大于肠壁样品，说明肠道内容物菌群更容易受到外界因素影响，且复方中草药饲料添加剂对中华鳖肠道有一定良好的影响。
[0061]
前期研究表明肠道微生物与宿主共同构建的肠道微生态系统对宿主消化代谢、肠道发育、体内平衡、免疫响应与抵御疾病等过程中发挥着至关重要的作用，因此肠道微生物
也被许多学者称为宿主的外在器官，一个正常平衡的肠道微生物群体会对宿主的肠道免疫调节功能产生积极的影响，而一个比例失调的微生物群体则会造成宿主免疫调节功能紊乱，并且增加疾病发生的机率。随着中草药被越来越多人的认可，它对肠道菌群的影响与作用机理研究也得到一定开展。本发明显示，中草药投喂后肠道内容物样品中的菌落丰富度高于对照组样品，且其菌落组成的均匀度也高于对照组。假单胞菌及枝原体菌群提示其与肠炎疾病存在一定相关性，而在中草药投喂治疗后肠道中的乳杆菌目与芽孢杆菌目细菌比例上升有助于肠道健康。
[0062]
实施例4中草药饲料添加剂对中华鳖免疫效果检测
[0063]
(1)样品处理：血清采集采用颈动脉采血法，具体步骤为，试验37天结束后，停饲24h。随机在实验组和对照组各取18只中华鳖(分为3组，每组6只)腹腔注射107cfu/ml嗜水气单胞菌1ml，分别在12h、24h和72h采血，再分别从对照组和实验组各取6只采血作为0h对照。投喂中草药组107cfu/ml嗜水气单胞菌攻毒组命名为cpg0h、cpg12h、cpg24h、cpg72h、每组6只，对照组107cfu/ml嗜水气单胞菌攻毒组命名为cg0h、cg12h、cg24h、cg72h。
[0064]
(2)样品采集：在试验规定时间点取两组称重，将中华鳖颈部露出，用止血钳固定，用手术刀划破颈动脉，放血，用事先准备好已灭菌的规格为5ml收集管收集，放入离心机8000r/min离心1min，分离血清和血细胞。整个采血过程需迅速，以防止血液凝固。
[0065]
(3)非特异性免疫指标测定：测定sod(超氧化物歧化酶)、lzm(溶菌酶)acp(酸性磷酸酶)agp(碱性磷酸酶)将处理好的血清按照试剂盒说明书进行测定以上各类指标(试剂盒均购于南京建成生物工程研究所)。
[0066]
(4)数据处理：使用spss19.0软件进行单因子方差分析(one
‑
way anova)，多重比较采用duncan’s进行差异显著性检验，结果用平均值
±
标准误差(x
±
se)表示。
[0067]
(5)结果分析：由表4可见，投喂中草药实验组中华鳖血清中免疫酶活性除酸性磷酸酶(acp)外的超氧化物歧化酶(sod)、溶菌酶(lzm)和碱性磷酸酶(agp)均与对照组中华鳖有显著差异。各组内无显著差异，随着107cfu/ml嗜水气单胞菌攻毒时间上升，cpg12h、cpg24h、cpg72h、cg12h、cg24h和cg72h组中华鳖血清内的免疫酶活性也随之而上升，未攻毒实验组与对照组(cpg0h与cg0h)表示试验结束后实验组与对照组体内免疫酶活性，投喂中草药实验组免疫酶活性明显高于实验组。
[0068]
表4：复方中草药对中华鳖免疫酶指标的影响表
[0069][0070][0071]
相邻字母表示差异显著(p<0.05)相间字母表示差异极显著(p<0.01)相同字母表示无显著差异。
[0072]
实施例5复方中草药对中华鳖生长指标检测
[0073]
(1)生长指标：中草药试验37天结束后，停饲24h后，分别对实验组和对照组中华鳖进行称重，记录，计算增重率、死亡率、饲料系数等。计算公式如下：
[0074]
增重率(cr)＝(试验末体质量
‑
试验初体质量)(g)/试验初体质量(g)
[0075]
死亡率＝死亡数/试验初总体数
[0076]
饲料系数(fcr)＝饲料总投喂量(g)/(试验末体质量
‑
试验初体质量)(g)
[0077]
(2)结果与分析：由表5可知，试验结束后，投喂复方中草药实验组生长指标均高于对照组，各组实验中华鳖体重均有所增加，其中，实验组增重较高于对照组，实验组增重率略高于对照组，(本实验周期较短，对于中华鳖此类生长周期较长动物会有生长指标差异不显著的结果)饲料系数实验组明显低于对照组，说明投喂中草药实验组中华鳖对饲料的吸
收利用率高于对照组，死亡率低，因是个体差异造成，并不能说明本次实验结果。
[0078]
表5：复方中草药对中华鳖生长指标的影响
[0079][0080][0081]
总结：本次试验诸多结果表明，投喂中草药实验组肠道菌群丰富度、免疫酶活性、生长指标等均高于对照组。结果表明本发明的复方中草药添加剂对中华鳖的免疫力有重要的影响。
[0082]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。