高活性甜高粱多酚及其制备方法与应用

本发明涉及高活性甜高粱多酚及其制备方法与应用，属于食品添加剂研究领域。
背景技术：
：目前，在食品中广泛应用的多为人工合成抗氧化剂及防腐剂，如丁基羟基茴香醚(bha)、二丁基羟基甲苯(bht)以及叔丁基对苯二酚(tbhq)等。这类人工合成抗氧化剂因易诱发中毒、炎症甚至肿瘤，对人体有害，故不能多用或尽量不用。天然来源的植物多酚类物质因具有显著的抗氧化作用，常被作为抗氧化剂、抑菌剂、防腐剂等，广泛应用于食品、药品、营养保健等众多领域。近年来，国内外对各种植物多酚类物质进行了大量研究，然而天然植物抗氧化剂的市场远未饱和，仍有较大的提升空间，但是植物多酚的工业化提取一直面临提取效率低和抗氧化活性差的问题，进而影响其进一步工业应用。作物是植物活性物质的良好来源，如单宁、花青素、酚酸和植物甾醇等，也是抗氧化剂酚类和降胆固醇等营养物质的潜在来源。甜高粱属于c4能源性作物，具备耐盐碱、耐干旱、高糖浓度以及高的生物量积累等特性，可种植于盐碱地、沙滩地等边际性土地，其主要组分为蔗糖、葡萄糖、果糖、纤维素、半纤维素、木质素、蛋白、淀粉和果胶等物质。目前对于甜高粱茎秆的利用主要集中在一些大宗产品开发，如发酵生产生物化学品、制备果葡糖浆、生产畜禽饲料和堆肥等，然而这类研究报道多聚焦甜高粱中的高糖组分以及纤维素组分的利用，但没有甜高粱茎秆中丰富多酚类化合物的综合利用的报道，因此如何实现甜高粱茎秆中多酚类化合物的高效提取，以显著提升甜高粱的综合利用率，从而延伸了甜高粱产业链是亟待解决的问题。当前，不同植物来源的多酚具有不同的提取方法，如己烷提取、甲醇提取以及水提等。为进一步提升多酚提取率，一些物理辅助提取方法也被广泛应用于植物多酚提取过程中，如高压辅助提取、微波辅助提取、超声波辅助提取、酶法辅助提取以及超临界二氧化碳萃取等。对于高糖作物来说，超声波辅助酸性乙醇提取则是获得多酚的主要方式。考虑到甜高粱中含有高的糖浓度以及丰富的其他组成成份(如色素、蛋白、脂肪以及蜡状物)，在提取的过程中，这些组分可能会混入甜高粱多酚中，进而影响提取多酚的质量。因此需要联合其他的技术进一步提纯超声波辅助酸性乙醇提取的甜高粱多酚。技术实现要素：本发明的目的是提供高活性甜高粱多酚及其制备方法与应用。本发明以甜高粱茎秆为原料提取多酚类化合物，将制备的高活性甜高粱多酚应用于抗食源性微生物研究中。本发明提供的高活性甜高粱多酚的制备方法，包括以下步骤：1)将甜高粱茎秆洗净、榨汁，将汁液和残渣混合，然后加入酸性乙醇溶液混合，调节体系ph后进行浸提，所述浸提结束后抽滤，得到多酚粗提液；2)将所述多酚粗提液与alcl3+zncl2复合沉淀剂混合，调节ph后静置进行沉淀，沉淀完全后分离，得到多酚和沉淀剂的络合物；3)取所述络合物采用所述酸性乙醇进行洗涤，将得到的洗涤液离心后弃去上清液，取洗涤后的沉淀与hcl溶液混合，乙酸乙酯萃取，收集有机层的萃取液；4)将所述萃取液浓缩室温放置干燥，然后加水溶解，得到多酚纯化浓缩液；5)将所述多酚纯化浓缩液进行冷冻干燥，即得到粉末状的甜高粱茎秆多酚。上述的方法中，所述酸性乙醇可为1.6mol/lhcl和无水乙醇加入去离子水配置，其中1.6mol/lhcl的体积百分含量可为2％，无水乙醇的体积百分含量可为60％；所述汁液和残渣混合物与所述酸性乙醇的质量体积比为1g:5ml，即固液比；步骤1)中采用盐酸缓冲溶液进行调节体系ph至5.0～6.0；步骤1)中所述浸提的条件如下：温度为30℃水浴加热；在超声下进行，超声波功率可为600w；浸提时间可为4h；所述浸提在高剪切乳化机中进行。本发明中，所述超声采用的超声波仪为陕西凯得力公司kdl-60022r；所述乳化机高剪切乳化机为安徽聚铬机械sg-101，使用长孔工作头，转速为500rpm。上述的方法中，步骤1)中还包括如下步骤，所述滤渣重复进行3次如下过程：所述滤渣加入酸性乙醇溶液混合，调节体系ph后进行浸提，所述浸提结束后抽滤，得到滤渣和多酚粗提稀释液；然后将所述多酚粗提稀释液与所述多酚粗提液合并进行下一步操作。上述的方法中，所述alcl3+zncl2复合沉淀剂与所述甜高粱茎秆多酚粗提液的质量体积比可为1:20；所述alcl3+zncl2复合沉淀剂中alcl3与zncl2的质量比可为1:2。上述的方法中，步骤2)中，调节ph至6.0；采用1mol/lnahco3溶液调节ph；所述静置时间可为15～30min；所述离心的离心速率可为6000r/min，温度可为20℃，离心时间可为15min。本发明中，采用的离心机具体可为湖南凯达dl7m-12l离心机。上述的方法中，步骤3)中所述多酚和沉淀剂的络合物与所述酸性乙醇的质量体积比可为1g:5ml；所述离心的速率可为6000r/min，温度可为20℃，所述离心采用的离心机具体可为湖南凯达dl7m-12l离心机；所述洗涤后的沉淀与所述hcl溶液的质量体积比可为1g:5ml；所述hcl溶液的浓度可为1mol/l；所述萃取的次数可为3次。上述的方法中，步骤4)中所述浓缩采用减压蒸馏；所述减压蒸馏的温度可为40℃；所述干燥的温度可为40℃，时间可为6h。本发明中，所述减压蒸馏采用的旋转蒸发仪具体为青岛聚创jc-zf-re5000，转速设置可可为50r/min；所述干燥采用的电热鼓风干燥箱具体为上海甘易dhg-9203a，设定温度可为40℃。上述的方法中，步骤5)中，所述冷冻干燥的过程如下：-80℃预冻18h，在真空度可为2pa、-60℃下冷冻干燥36h。本发明中，所述冷冻干燥采用的真空干燥机具体为上海禹熠yy-2000fda。本发明还提供了上述的方法制备得到的甜高粱茎秆多酚。本发明中，所述甜高粱茎秆多酚按照非靶标代谢组检测出来的前20％物质进行分析，所述甜高粱茎秆多酚中酚酸包括没食子酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸、绿原酸和邻香豆酸。本发明所述甜高粱茎秆多酚具有高的抗氧化活性。本发明所述甜高粱茎秆多酚可应用于抗食源性微生物研究领域中。具体可为在显著杀伤食源性微生物(大肠杆菌cmcc44102以及金黄色葡萄球菌cmcc26003)，使得食源性微生物细胞膜损伤，导致蛋白和核酸泄露。本发明具有以下优点：1)以甜高粱茎秆为原料提取多酚类化合物，将甜高粱茎秆中副产物变废为宝，提升了甜高粱的综合利用率，延伸了甜高粱产业链，显著增加了甜高粱产品的附加价值。2)本发明中酸性乙醇在超声波和乳化仪的作用下可温和并有效地提取甜高粱茎秆中的多酚类化合物，然后利用廉价易得的复合金属离子作为沉淀剂，使得多酚在酸性或中性条件下与金属离子络合，而且金属离子沉淀可以除去大量多糖等杂质，极大地减弱了杂质对多酚物质地降解作用，解决了提取过程中提取效率低和抗氧化活性差等问题，产量显著增加，同时保证了多酚类化合物具有较强的抗氧化活性。3)使用复合离子沉淀剂对甜高粱茎秆多酚进行纯化，此方法设备简单，操作方便，分离迅速、对环境无污染，得到的多酚类化合物保持了原则的结构和生物学活性。4)本发明生产的甜高粱茎秆多酚具备安全性好、产量高、产品品质好以及成本低特点，具有高的抗氧化活性，应用于抗食源性微生物研究领域中，能显著杀伤食源性微生物(大肠杆菌cmcc44102以及金黄色葡萄球菌cmcc26003)，使得食源性微生物细胞膜损伤，导致蛋白和核酸泄露。附图说明图1为本发明实施例1中制备得到的甜高粱茎秆多酚按照非靶标代谢组检测的图谱图，其中图1(a)为负离子检测模式，图1(b)为正离子检测模式。图2为本发明实施例1、对比例1-2得到的甜高粱多酚的总抗氧化能力测定结果，其中酸性乙醇联合复合离子提取的柱形图为实施例1的结果，酸性乙醇联合单离子提取的柱形图为对比例1的结果，酸性乙醇提取的柱形图为对比例2的结果。图3为本发明实施例1得到的甜高粱多酚对食源性微生物的致死作用，图3中(a)为不同浓度甜高粱多酚时食源性微生物存活率的曲线，(b)为不同浓度甜高粱多酚时食源性微生物存活率的计数。图4为本发明实施例1得到的甜高粱多酚对食源性微生物蛋白和核酸泄露，图4中(a)为蛋白泄露结果，(b)为核酸泄露结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、1、从甜高粱种植基地收集刚收割的甜高粱茎秆，榨汁粉碎，取500g甜高粱茎秆混合物，加入2.5l的体积百分含量60％酸性乙醇(其中含体积百分含量2％的1.6mol/lhcl)溶液，用缓冲液调节ph至5.0～6.0。然后置于30℃水浴加热，600w超声波下搅拌浸提4h。浸提完毕后，趁热抽滤，滤渣用酸性乙醇洗涤2次。2、多酚粗提液稀溶液取1l在室温下加入50galcl3+zncl2复合沉淀剂(质量比alcl3:zncl2＝1:2)(即沉淀剂：甜高粱茎秆的质量体积比＝1:20)对多酚进行沉淀，用1mol/lnahco3调ph至6.0，静置30min，沉淀完全后立即于6000r/min条件下离心15min，弃去上清液，得到多酚和沉淀剂的络合物。3、取100g多酚和沉淀剂的络合物，加入500ml60％酸性乙醇进行洗涤，洗涤液充分混合后立即于6000r/min条件下离心15min，弃去上清液，反复洗涤3次；向洗涤后的沉淀中加入500ml1mol/lhcl溶液，使其完全溶解。再向溶解液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，萃取3次。4、取500ml萃取液，于40℃条件下旋转蒸发，得到多酚浓缩液，并回收乙酸乙酯；将多酚浓缩液倒入铝盒中，室温放置干燥，后加少量去离子水复溶，得到多酚纯化浓缩液。5、取得到的甜高粱茎秆多酚纯化浓缩液置于玻璃皿中冷冻干燥，使用-80℃预冻18h，在-60℃下冷冻干燥36h，得到甜高粱茎秆多酚。如图1所示，上述甜高粱茎秆多酚按照非靶标代谢组检测出来的前20％物质进行分析，甜高粱茎秆多酚中酚酸具体包括没食子酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸、绿原酸和邻香豆酸。对比例1、1、从甜高粱种植基地收集刚收割的甜高粱茎秆，榨汁粉碎，取1000g甜高粱茎秆混合物，加入5l的60％酸性乙醇溶液，用缓冲液调节ph至5.0-6.0。然后置于30℃水浴加热，600w超声波下搅拌浸提4h。浸提完毕后，趁热抽滤，滤渣用同样方式洗涤2次。2、多酚粗提液稀溶液取2.5l在室温下加入125galcl3沉淀剂(沉淀剂：甜高粱茎秆的质量体积比＝1:20)对多酚进行沉淀，用1mol/lnahco3调ph至6.0，静置30min，沉淀完全后立即于6000r/min条件下离心15min，弃去上清液，得到多酚和沉淀剂的络合物。3、取100g多酚和沉淀剂的络合物，加入500ml60％酸性乙醇进行洗涤，洗涤液充分混合后立即于6000r/min条件下离心15min，弃去上清液，反复洗涤3次；向洗涤后的沉淀中加入500ml1mol/lhcl溶液，使其完全溶解。再向溶解液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，萃取3次。4、取1l萃取液，于40℃条件下旋转蒸发，得到多酚浓缩液，并回收乙酸乙酯；将多酚浓缩液倒入玻璃皿中，室温放置干燥，后加少量去离子水复溶，得到多酚纯化浓缩液。5、取得到的甜高粱茎秆多酚纯化浓缩液置于玻璃皿中冷冻干燥，使用-80℃预冻18h，在-60℃下冷冻干燥36h，得到甜高粱茎秆多酚纯化物。对比例2、1、从甜高粱种植基地收集刚收割的甜高粱茎秆，榨汁粉碎，取750g甜高粱茎秆混合物，加入3.75l的60％酸性乙醇溶液，用缓冲液调节ph至5.0-6.0。然后置于30℃水浴加热，600w超声波下搅拌浸提4h。浸提完毕后，趁热抽滤，滤渣用同样方式洗涤2次。2、取1l粗提液，于60℃条件下减压旋转蒸发，得到多酚浓缩液，并回收乙醇。3、取得到的甜高粱茎秆多酚浓缩液，置于玻璃皿中冷冻干燥，使用-80℃预冻18h，在-60℃下冷冻干燥36h，得到甜高粱茎秆多酚纯化物。上述各个例子所得甜高粱茎秆多酚的生理生化指标测定：1)多酚含量的测定多酚含量测定参照北京索莱宝生物科技有限公司植物总多酚检测试剂盒方法。结果以每1g提取物中所含的没食子酸当量(mggae/g)表示。表1不同实施例中甜高粱茎秆多酚含量甜高粱茎秆纯化物多酚含量mggae/g提取物实施例1276.8±17.31对比例1225.5±7.84对比例2152.3±12.42本发明实施例1采用复合离子沉淀法所得到的甜高粱茎秆多酚纯化物为276.8mggae/g提取物，比对比例1中单一离子沉淀法中得到的甜高粱茎秆多酚增加了51.3mggae/g提取物，相比对比例2中传统方法本发明中得到甜高粱茎秆多酚的含量增加了124.5mggae/g提取物，效果显著。目前，现有技术提取植物多酚多采用将原料破碎烘干后再加溶剂浸提，使得生产成本增加，而且高温对多酚物质有一定的破坏，由此得到的甜高粱茎秆多酚含量不具有实际应用价值。本发明则以鲜甜高粱茎秆未烘干直接破碎浸提，采用超声波辅助乙醇浸提破坏甜高粱茎秆的组织结构，使其多酚类物质尽可能多的释放出来，然后利用廉价易得的复合金属离子作为沉淀剂，使得多酚在酸性或中性条件下与金属离子络合，而且金属离子沉淀可以除去大量多糖等杂质，极大地减弱了杂质对多酚物质地降解作用。此法生产的甜高粱茎秆多酚具备安全性好、产量高、产品品质好以及成本低等特点；而且该方法具有节能、省工、省时、对环境无污染等优点，是一种可大力提倡的应用技术，可创造出较高的经济效益。2)甜高粱茎秆多酚dpph自由基清除力测定取本发明实施例1、对比例1-2中的提取物分别稀释到50μg/ml的样品溶液，每组试验重复3次进行，参照北京索莱宝生物科技有限公司dpph检测试剂盒方法进行检测。如图2所示，本发明甜高粱茎秆多酚的dpph·自由基清除率以计量依赖性方式显著增加，在50μg/ml时，本发明超声波离子沉淀复合法提取得到的甜高粱茎秆多酚对dpph自由基的清除率达到了82.08％，而对比例1中单一离子沉淀法为59.87％，对比例2中传统酸性乙醇浸提方法仅为46.28％。3)甜高粱茎秆多酚羟自由基清除力测定取上述实施例1、对比例1-2中的提取物分别稀释到50μg/ml的样品溶液，每组试验重复3次进行，参照北京索莱宝生物科技有限公司羟自由基清除能力检测试剂盒方法进行检测。如图2所示，本发明甜高粱茎秆多酚的羟自由基清除率以计量依赖性方式显著增加，在50μg/ml时，本发明超声波离子沉淀复合法提取得到的甜高粱茎秆多酚对羟基自由基的清除率达到了61.46％，而对比例1中单一离子沉淀法为49.87％，对比例2中传统酸性浸提方法仅为41.45％。4)甜高粱茎秆多酚总抗氧化能力测定取上述实施例1、对比例1-2中的提取物分别稀释到50μg/ml的样品溶液。每组试验重复3次进行。具体方法按照苏州科铭生物技术有限公司总抗氧化能力测定试剂盒进行测定。根据标准曲线公式计算出样品相当于多少μmol的trolox标准品，即得出该样品的总抗氧化能力，可计为μmoltrolox/ml。如图2所示，本发明甜高粱茎秆多酚的总抗氧化能力以计量依赖性方式显著增加，在50μg/ml时，本发明超声波离子沉淀复合法提取得到的甜高粱茎秆多酚总抗氧化能力达到了9.36μmoltrolox/ml，而对比例1中单一离子沉淀法相为7.51μmoltrolox/ml，对比例2中传统酸性乙醇浸提方法仅为5.98μmoltrolox/ml。上述实施例1所得高活性甜高粱茎秆多酚用于抗食源性微生物研究领域：1)甜高粱多酚对食源性微生物的杀伤作用取100μl大肠杆菌、金黄色葡萄球菌冻存菌液接入固体培养基中，涂匀，37℃培养箱培养16小时备用。吸取2ml液体培养基置于平板上，用接种环均匀洗下菌体，接入液体培养基中，37℃，摇床200rpm培养8小时。调整菌液浓度od600值约等于1。取100μl菌液加入到灭菌过的1.5ml离心管中，室温，14000r/min，离心15min。吸去上清液，保留菌体，然后向其中加入0、5、10、20、50g/l的本发明实施例1中甜高粱多酚提取物。涡旋均匀，静置10min。向离心管中加入900μl灭菌去离子水，涡旋均匀。按照比例10-8～10-9稀释后，取100μl菌液均匀涂布在平板上，37℃培养箱培养14小时进行计数，如图3所示。由图3可知，本发明甜高粱多酚能显著杀伤食源性微生物，当甜高粱多酚浓度为20g/l，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的存活率分别为26.58％和17.36％。2)甜高粱多酚引起食源性微生物的蛋白和核酸泄露2.1蛋白泄露取100μl大肠杆菌、金黄色葡萄球菌冻存菌液接入固体培养基中，涂匀，37℃培养箱培养16小时备用。吸取2ml液体培养基置于平板上，用接种环均匀洗下菌体，接入液体培养基中，37℃，摇床200rpm培养8小时。调整菌液浓度od600值约等于1。取100μl菌液加入到灭菌过的1.5ml离心管中，室温，14000r/min，离心15min。吸去上清液，保留菌体，向其中加入0、5、10、20、50g/l的甜高粱多酚提取物。涡旋均匀，静置10min后，室温，14000r/min，离心15min，留上清。取20μl上清液加入到96孔板中，并加入200μl考马斯亮蓝g-250室温孵育5min，酶标仪于595nm处测定吸光度。带入bsa标准曲线进行蛋白含量计算。y＝0.0021x+0.5431，r2＝0.9936(如图4(a)所示)。由图4(a)可知，本发明甜高粱多酚能显著诱导食源性微生物的蛋白泄露，当甜高粱多酚浓度为20g/l，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的蛋白泄露分别为15.87和18.52μg/ml。2.2核酸泄露取100μl大肠杆菌、金黄色葡萄球菌冻存菌液接入固体培养基中，涂匀，37℃培养箱培养16小时备用。吸取2ml液体培养基置于平板上，用接种环均匀洗下菌体，接入液体培养基中，37℃，摇床200rpm培养8小时。调整菌液浓度od600值约等于1。取100μl菌液加入到灭菌过的1.5ml离心管中，室温，14000r/min，离心15min。吸去上清液，保留菌体，向其中加入0、5、10、20、50g/l的甜高粱多酚提取物。涡旋均匀，静置10min后，室温，14000r/min，离心15min，留上清。上清液使用0.22μm滤器进行过滤，并稀释100倍。取200μl液体置于紫外荧光96孔板中，酶标仪于260nm处测定吸光度。吸光度值便为核酸泄露量(如图4所示)。由图4(b)可知，本发明甜高粱多酚能显著诱导食源性微生物的核酸泄露，当甜高粱多酚浓度为20g/l，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的核酸泄露都达到od260＝0.25。从上述结果可以看出，本发明得到高活性甜高粱多酚提取物在抗食源性微生物研究中可以显著杀伤食源性微生物，使得食源性微生物细胞膜损伤，导致蛋白和核酸泄露。当前第1页12