一种噬菌体凝胶及其制备方法和应用

1.本发明属于生物药物或者饲料添加剂技术领域，具体地涉及一种噬菌体凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着抗生素的广泛应用甚至滥用，耐药菌株(包括多耐药菌株)频现，抗生素治疗效果受到严峻的挑战。而且，2020年7月1日起，我国全面禁止在饲料端添加促生长类抗生素，养殖端“限抗、减抗”，全球的最终目标，“2027年实现畜禽类绝对的无抗养殖”，因此，开发新型抗菌产品成为迫在眉睫的社会需求。噬菌体是一种“吃”细菌的纳米级微生物，在自然界广泛存在，其不仅是耐药菌，甚至是多重耐药菌的克星。与抗生素相比，噬菌体的杀菌速度快、专一性强、不影响动物肠道正常菌群以及其抗菌效果不受细菌耐药性的限制等优势，是最有潜力的抗生素替代品。但是噬菌体作为一种具有生物活性的微生物，在制剂生产、产品保存、使用及运输过程中容易死亡失活且水剂运输不便，而且口服噬菌体在动物体内消化时易被胃酸、蛋白酶破坏，极易随体液和粪便排出体外，难以发挥有效肠道抗菌及调节肠道微生态的功能，因此，保护和稳定噬菌体便成为临床应用亟待解决的问题，而噬菌体凝胶包封则是目前最有希望的解决途径。
3.治疗性噬菌体的凝胶配方通过延长其保质期、提高其易操作性并最终保持其长期效力来改善其“可药物性”是有吸引力的。赋形剂的使用和选择对于稳定固体制剂中的噬菌体和保护其生存能力免受固化过程中遇到的应力以及在固化前的长期储存至关重要使用。解决这些挑战为噬菌体制剂的重新设计和重新构思提供了新的机会，以提高其作为生物医药产品的功效。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种噬菌体凝胶，以多种裂解性噬菌体为主要成分，通过耐高温材料、耐胃酸材料、阴离子多糖及固化剂等将噬菌体有效包裹起来，制备成噬菌体凝胶，维持噬菌体良好的耐热稳定性，减少噬菌体在加工、储存和运输过程中的效价损失，同时保护噬菌体有效抵御动物消化道中的胃酸和消化酶的破坏，保证噬菌体靶向动物肠道，延长作用时间，提高稳定性和裂解活性。
5.本发明还要解决的技术问题在于提出上述噬菌体凝胶的制备方法和应用。
6.为实现上述目的，本发明提出了一种噬菌体凝胶，包括噬菌体颗粒、耐高温材料、耐胃酸材料、阴离子多糖和固化剂，其中，所述耐高温材料为明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、f-68中的任意一种或者几种的组合；所述耐胃酸材料为羧甲基纤维素钠、壳聚糖、碳酸钙中的任意两种或者多种的组合。
7.其中，噬菌体颗粒、耐高温材料、耐胃酸材料、阴离子多糖和固化剂的质量比为：70～90％：2～8％：2～8％：2～8％：1～2％。
8.所述阴离子多糖为海藻酸钠、卡拉胶中的任意一种或者两种的组合。
9.所述固化剂为氯化钙溶液中的钙离子。
10.所述的噬菌体凝胶还包括成膜剂，所述成膜剂为醋酸改性壳聚糖。优选地，所述醋酸改性壳聚糖的浓度为0.2～1.0wt％(wt/vol，g/ml)。
11.所述噬菌体颗粒包含裂解型噬菌体，包括但不限于大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、肺炎克雷伯噬菌体中的任意一种或者多种，其活噬菌体效价为108～10
11
pfu/g。
12.具体地，所述噬菌体颗粒包括产肠毒素性大肠杆菌k88噬菌体，保藏号为ctcc no:m 209243；大肠杆菌噬菌体vb_ecom_c1，保藏号为ctcc no:m2017190；沙门氏菌噬菌体psa-6，保藏号为cctcc no:m 2010226；鸡白痢沙门氏菌噬菌体pspu-4-116，保藏号为cctcc no:m2011042；肠炎沙门氏菌噬菌体jn54kde，保藏号为cctcc no:m2014429；鼠伤寒沙门氏菌噬菌体jx178，保藏号为cctcc no:m2014433；德尔卑沙门氏菌噬菌体jx067-2，保藏号为cctcc no:m2014431；伦敦沙门氏菌噬菌体jsd9，保藏号为cctcc no:m2014432；肺炎克雷伯氏菌vb_kpnm_he1，保藏号为cctcc no:m2015760。上述菌种可以根据具体的致病菌进行选择。
13.本发明进一步提出了上述噬菌体凝胶的制备方法，包括如下步骤：
14.(1)对于每一种噬菌体，经扩增培养后，离心获得粗噬菌体裂解液，然后采用膜分离技术，去除培养基、细菌毒素和碎片，再经水系滤膜过滤，得到精纯噬菌体颗粒，优选地，用100～150kda膜分离去除培养基、细菌毒素和碎片，然后经0.22μm的水系滤膜过滤，得到精纯噬菌体溶液，然后过滤除菌后检测效价并确认无污染后；
15.(2)将步骤(1)制备的噬菌体溶液，与2～8wt％的耐高温材料、2～8wt％的阴离子多糖溶液、2～8wt％的碳酸钙溶液按照体积比为2～4:1～2:1～2:1～2比例混匀，得到混合溶液；
16.(3)将步骤(2)制备的混合液滴入固化剂中，搅拌固化制备成微液滴，形成噬菌体凝胶；优选地，以5～10ml/min的滴速滴入固化剂中，在300～600rpm下搅拌固化15～30min得到噬菌体凝胶；
17.(4)将步骤(3)制备的噬菌体凝胶转移到醋酸改性壳聚糖溶液中15～30min，成膜并保护噬菌体凝胶，优选地，所述醋酸改性壳聚糖溶液浓度为0.2～1.0％(wt/vol，g/ml)，具体地，所述醋酸改性壳聚糖溶液通过如下方法制备得到：首先配制浓度为1％的醋酸100ml，然后，加入0.2～1.0g壳聚糖，磁力搅拌10h～24h，使其完全溶解即得。
18.本发明还提出了上述噬菌体凝胶作为畜禽的饲料添加剂的应用。优选地，所述畜禽为猪、鸡、牛、羊、鸭、鹅。
19.其中，所述噬菌体凝胶提高饲料清除动物肠道病原菌的能力。
20.利用本发明方法制备得到的噬菌体凝胶，噬菌体可以耐受饲料制粒过程中的90℃高温破坏5min，可耐受超低胃酸(ph 1.2)，无破损且噬菌体活性稳定，同时肠道内缓释时间长达5天，有效抑制病原菌生长，且噬菌体凝胶结构有效保护噬菌体活性，提高噬菌体保存稳定性，常温储存期6个月以上。
21.有益效果：与现有技术相比，本发明制备得到的噬菌体凝胶可以耐受饲料制粒过程中的高温破坏，保持高活性和稳定性(90℃5min)，且可以耐受胃酸及胃蛋白酶侵蚀，仍保持稳定性和活性(耐胃酸，ph 1.2)，同时噬菌体可以顺利通过胃液到达肠道，在肠道内释放时间长达6天，有效抑制肠道病原菌生长，保证肠道健康，另外，本发明的噬菌体凝胶结构有效保护噬菌体活性，提高噬菌体保存稳定性，常温储存期6个月以上，所用包封材料均为天
然高分子纳米材料，不添加任何表面活性剂或者有机试剂，无毒绿色型、无刺激性气味、无环境污染问题、生物可降解、来源广、价格便宜，适合作为畜禽的饲料添加剂，尤其可以用于饲料制粒，有效清除动物肠道病原菌。
附图说明
22.图1为制备的噬菌体凝胶；
23.图2为噬菌体凝胶储存期活性检测结果图；
24.图3为噬菌体凝胶在模拟胃肠液中的稳定性结果示意图；
25.图4为噬菌体凝胶高温耐受性结果示意图；
26.图5为噬菌体凝胶体外杀菌曲线图。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
28.实施例中sm缓冲液的配制方法为：nacl 5.8g，mgso4·
7h2o 2g，1mol/l的tris
·
hcl 50ml(ph＝7.0)，5ml 2％gelatin，加入ddh2o补足至1000ml。
29.模拟胃液的配制方法为：称取2.0g nacl、3.2g胃蛋白酶，量取7ml浓盐酸，双蒸水定容于1000ml，ph约为1.2。
30.模拟肠液的配制方法为：将6.8g kh2po4溶于250ml双蒸水，振荡，完全溶解后加190ml 0.2mol/l naoh和400ml的双蒸水。加胰蛋白酶10.0g，混匀，用0.2mol/l naoh调ph到7.5
±
0.1，双蒸水定容于1000ml。
31.0.3％胆盐的配制方法为：取0.3g胆盐，加入到100ml pbs(ph6.8)。
32.0.2％醋酸改性壳聚糖配置方法为：首先配制质量浓度为1％的醋酸100ml，然后，加入0.2g壳聚糖，磁力搅拌10h～24h，使其完全溶解即得。
33.本发明所用的裂解性噬菌体具体信息如下：
34.大肠杆菌噬菌体vb_ecom_c1，由zl201710540832.6公开，保藏号为ctcc no:m2017190；
35.沙门氏菌噬菌体psa-6，由zl201010508259.9公开，保藏号为cctcc no:m 2010226；
36.鸡白痢沙门氏菌噬菌体pspu-4-116，由zl201110053518.8公开，保藏号为cctcc no:m2011042；
37.肠炎沙门氏菌噬菌体jn54kde，由zl201410717164.6公开，保藏号为cctcc no:m2014429；
38.鼠伤寒沙门氏菌噬菌体jx178，由zl201410717164.6公开，保藏号为cctcc no:m2014433；
39.德尔卑沙门氏菌噬菌体jx067-2，由zl201410717164.6公开，保藏号为cctcc no:m2014431；
40.伦敦沙门氏菌噬菌体jsd9，由zl201410717164.6公开，保藏号为cctcc no:m2014432；
41.肺炎克雷伯氏菌vb_kpnm_he1,由zl201611072115公开，保藏号为cctcc no:m2015760；
42.这些裂解性噬菌体均在中国典型培养物保藏中心保藏，在实际应用时，根据具体的致病菌选择合适的噬菌体。
43.实施例1噬菌体凝胶的制备。
44.(1)扩增并纯化裂解性噬菌体中的一种或者几种：
45.本实施例以沙门氏菌噬菌体psa-6为代表制备噬菌体溶液。
46.具体步骤简述如下：从lb琼脂平板上挑取沙门氏菌atcc13076单克隆，接种到5ml lb液体培养基中，37℃震荡培养过夜，次日按照1:100转接至3l发酵罐中扩培宿主菌，至对数生长期时，按照moi＝0.01加入噬菌体psa-6，37℃需氧培养6h，12 000rpm，4℃离心10min，收集上清液，即为粗噬菌体裂解液；通过50kda指状有机膜过滤除菌技术和100-150kda切向流超滤系统，以sm缓冲液置换培养基，去除培养基、细菌毒素和碎片，再经0.22μm的水系滤膜过滤，得到精纯噬菌体颗粒psa-6，最后，检测污染情况及噬菌体效价测定。
47.(2)噬菌体凝胶制备：
48.将5g明胶、2g聚乙烯基吡咯烷酮完全溶解在100ml蒸馏水中，制备成耐高温溶液，备用。
49.将步骤(1)制备的噬菌体、耐高温溶液，4％海藻酸钠、3％碳酸钙溶液按照体积比4:1:1:1混匀，制备成噬菌体与载体混合液；
50.使用振动喷嘴将混合液制备成微液滴，不断滴入100mm氯化钙溶液中固化30分钟，形成噬菌体凝胶。
51.形成的噬菌体凝胶转移到醋酸改性壳聚糖(0.2％，wt/vol，g/ml)溶液中15min，再包裹一层保护膜，保护噬菌体凝胶，并且去掉溶液，制备成耐高温、耐胃酸及实现肠道缓释的噬菌体凝胶。
52.(3)噬菌体凝胶效价测定：
53.取2g噬菌体凝胶溶解于模拟肠液中，37℃ 180rpm震荡4h，在4℃ 10000r/min离心10min，取上清测定噬菌体效价。
54.通过此方法制备的实验如图1所示，其噬菌体凝胶为白色颗粒，游标卡尺测量直径为1mm
±
0.2mm，凝胶中的噬菌体效价为2
×
109pfu/g。
55.实施例2噬菌体凝胶中活噬菌体效价测定及保存稳定性。
56.将制备好的三个不同批次的噬菌体凝胶颗粒分装于无菌离心管中，置于4℃或25℃常温保存，每月每管抽取2g样品，检测噬菌体凝胶球中的噬菌体效价。
57.结果图2所示，本发明提供的噬菌体凝胶微球常温储存6个月，噬菌体效价仍保持在7.15
×
108pfu/g以上，此结果表明噬菌体凝胶可以有效保持噬菌体的活性。
58.实施例3制备的噬菌体凝胶在模拟胃肠液中的抗逆性和稳定性测定。
59.将上述抗逆性噬菌体凝胶颗粒2.0g，分别在40ml不同ph值(1.2,1.93,2.48,2.91)的模拟胃液中，37℃，180r/min振荡15min～2h，10000rpm离心5min，弃掉模拟胃液并将样品转移至40ml模拟肠液中重悬振荡，使噬菌体凝胶全部释放，然后检测模拟肠液中噬菌体效价，并以同等效价的游离噬菌体做对照。
60.结果如图3所示，本发明提供的噬菌体凝胶对噬菌体活性进行了很好的保护，即使
在模拟胃液中处理长达2h后没有明显的破损，但是在模拟肠液中4h后充分释放，噬菌体凝胶在模拟胃液(ph＝1.2)可以抵御15min,在ph＝1.93、2.48、2.91的模拟胃液中孵育120min，噬菌体活性略微降低，与游离噬菌体组相比，显著提高了噬菌体的抗逆性。
61.实施例4制备的噬菌体凝胶高温耐受。
62.取2g噬菌体凝胶样品置于无菌平皿中，分别在60℃、70℃、80℃、90℃中，加热1min、2min、3min、4min后，将样品转移到20ml mbs中，在37℃100rpm中震荡4h后，计算噬菌体效价。
63.如图4所示，经过凝胶包裹的噬菌体，在面对高温处理，虽然噬菌体效价会随着时间递增有所下降，但是总体效价还是维持在108pfu/ml左右。说明噬菌体凝胶对噬菌体有很好的耐高温保护作用。
64.实施例5制备的噬菌体凝胶的杀菌效果分析。
65.取2.0ml细菌混合液加6.0ml模拟肠液稀释，再将2g(9.8
×
108pfu/g)凝胶加入上述细菌菌液中，37℃、100rpm震荡培养，在培养的0h、2h、4h、6h检测细菌数量的变化。
66.结果如图5所示，相较于细菌对照组，噬菌体凝胶和肠炎沙门氏菌atcc13076反应后，体现了很好的杀菌性能，在6h时杀菌效率高达95％。
67.实施例6制备的噬菌体凝胶作为饲料添加剂在肉鸡体内胃肠道停留时间测定。
68.将1日龄aa肉鸡，随机分为2组，噬菌体凝胶(ebp)和游离噬菌体灌胃组(bp)，每组30只。实验前禁食12h，自由饮水。每只鸡口服噬菌体凝胶2g或灌胃噬菌体悬液1ml，剂量均为1
×
108pfu/只。给噬菌体后24h、48h、72h、96h和120h，收集粪便，并从每组中随机取5只鸡处死，解剖后取出肠道，收集内容物，用10倍缓冲液重悬，漩涡振荡器混匀后，检测样品中的噬菌体。
69.表1噬菌体凝胶与游离噬菌体在胃肠道留存时间
[0070][0071]
结果如表1所示，与游离噬菌体相比，噬菌体凝胶在肉鸡胃肠道内停留时间延长，小肠和大肠内的停留时间以及排出时间均延长2d，如此可以给噬菌体提供更多防御致病菌的时间和机会。
[0072]
实施例7制备的噬菌体凝胶在肉鸡体内抗沙门氏菌感染测定。
[0073]
将90只1日龄aa肉鸡，随机分为2组，无噬菌体对照组(con)、噬菌体凝胶治疗组(ebp)，游离噬菌体组(nbp)，每组30只。实验前禁食12h，自由饮水。在0h每只鸡口服攻毒肠炎沙门氏菌0.5ml 2
×
108cfu，攻毒后，噬菌体凝胶治疗组(ebp)立即口服2g制备的噬菌体凝胶，游离噬菌体组(nbp)立即灌服1ml游离噬菌体，剂量为噬菌体剂量为1
×
108pfu/只，对
照组灌服1ml sm溶液。攻毒后观察并测定粪样中攻毒沙门氏菌的数量。
[0074]
结果表明：使用噬菌体凝胶治疗后，可快速恢复雏鸡的状态，而且，噬菌体凝胶治疗组(ebp)减轻鸡只减轻腹泻症状，噬菌体凝胶可以在肠道内有效杀灭沙门氏菌，减少沙门氏菌肠道炎症反应；显著降低粪样中沙门噬菌体的数量，表明该噬菌体凝胶可以作为饲料添加剂用于防治动物肠道致病菌。
[0075]
本发明筛选天然高分子纳米材料，如耐高温、耐胃酸、阴离子多糖及固化剂等包被噬菌体，不添加任何表面活性剂或者有机试剂，多糖材料结构中的醛基等阴离子与核结构中钙离子结合，形成一定的空间结构将噬菌体有效保护起来，维持噬菌体良好的耐热稳定性，减少噬菌体在加工、储存和运输过程中的效价损失，同时保护噬菌体有效抵御动物消化道中的胃酸和消化酶的破坏，保证噬菌体靶向动物肠道，延长作用时间，提高稳定性和裂解活性，为噬菌体临床应用解决卡脖子的技术问题，为抗生素替代品提供产品储备。
[0076]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。