一种蜂花粉酵素的制备方法与流程

1.本发明涉及微生物或酶或其组合物的技术领域，尤其涉及一种适 合蜂花粉酵素的发酵方法。


背景技术：

2.蜂花粉是指蜜蜂从被子植物雄性花药和裸子植物小孢子叶上的 小孢子囊采集的花粉粒，并经过蜜蜂加工而成的花粉团状物。蜂花粉 是一种天然的自然资源，含有丰富的营养物质，它不仅含有人体必需 的糖类、蛋白质、游离氨基酸、核酸、不饱和脂肪酸、维生素、矿物 质、微量元素和酚类等多种活性成分，而且营养物质全面均衡，被誉 为“微型营养库”。蜂花粉既是很好的天然营养食品，又具有抗氧化、 抗菌消炎、抗肿瘤、抗过敏和提高机体免疫力等功效，一直备受消费 者的青睐。
3.市场上常见的蜂花粉有油菜花粉、荷花粉、荞麦花粉、玉米花粉 以及茶花粉等。其中，油菜花粉中含有大量的多糖和一定量的脂肪及 蛋白质，以及丰富的维生素b和维生素a、维生素d、维生素e、维 生素k及各种必需氨基酸和非必需氨基酸等物质，还含有铁、锌、 钙、镁、钾等十多种无机盐和三十多种微量元素以及淀粉酶、过氧化 氢酶、肠肽酶、纤维素酶、胃蛋白酶、脂酶、胰酶等重要酶类。此外， 油菜花粉中还含有一定量的黄酮、甾醇、多酚及不饱和脂肪酸等物质， 这些活性成分不仅可以提高人体的功能，还能抑制前列腺增生、治疗 男性不育症。
4.荷花粉作为一种新兴花粉保健品，黄酮类含量高、种类多，富含 蛋白质、氨基酸、维生素、脂肪酸、矿物质、核酸及酶类等活性物质， 而维生素尤其是b族维生素的含量也是首屈一指，还含有丰富的铜、 镁、铁、锌、钙等矿物质成分，在蜂花粉系列中属于名贵产品，可用 来治疗痢疾、肠胃炎、小便不利、水肿肝炎，具有防止动脉硬化、增 强心肌收缩、加快心率、改善心肌功能、消减脂肪、抗氧化、降血脂、 护血管、预防癌症和润肤美容的功效，备受广大消费者尤其是女性消 费者的青睐。
5.然而，由于蜂花粉外壁较厚、较坚硬、缺乏弹性，其主要成分为 孢粉素，具有很强的抗水、抗渗透性、抗腐蚀性、抗酸碱性、抗生物 分解性能，与绝大多数的化学物质不发生反应，使其丰富的内容物不 能直接被人体利用，而且其中的部分蛋白质易使部分人群发生过敏反 应，因此需要通过破壁将花粉内部的营养物质释放出来。
6.目前，国内外的破壁方法主要包括机械破壁、物理破壁和生物破 壁。机械破壁主要有旋风粉碎法和超微粉碎法；物理破壁主要有温差 法、辐射法、水合破壁法、超声波法、渗透压破擘法、超低温加微波 破壁法和液氮淬冷破壁法；生物破壁主要有发酵破壁和酶解破壁，考 虑到工艺、成本及安全性等问，目前主要的破壁方法是机械破壁或生 物破壁或这两种方法联合破壁。
7.生物破壁主要是通过利用了酵母菌、曲霉菌、乳酸菌等有益菌发 酵过程中产生的各种酶以及花粉内部含有的各种酶的作用打通了花 粉内外壁的部分通道，从而使得花粉内壁中的营养成分溶出，经该方 法破壁的花粉有较好的色泽风味，并且有利于维生素、酶、
蛋白质、不饱和脂肪酸、黄酮、多酚等功能成分的保存。蜂花粉经过发酵破壁后会产生并积累大量代谢产物，生成有机酸、酶类、多酚类、多糖类、黄酮类等多种有益物质，而且可以将花粉中致敏的大分子蛋白降解为多肽或氨基酸，结合原料和微生物自身所含有的营养及功能成分，具有抗菌、抗过敏、抗发炎、抗病毒以及舒张血管、抑制脂质过氧化、促进肠胃消化、提高免疫力、增强抗癌抗辐射能力、延缓衰老等，不仅降低了人体对花粉过敏的风险而且对人体有多种有益功效，其中的黄酮类物质更是对抑制前列腺炎和前列腺增生有显著疗效，富含的多酚类物质不仅具有抗氧化、抗衰老的作用，同时还能美容养颜，具备很大的食用价值及药用价值，能带来重大的生态和社会效益。
8.传统的蜂花粉酵素发酵往往使用的是单一菌种，由于单菌的发酵能力有限，导致其对蜂花粉的破壁效果较差，发酵后的酵素中功能性成分含量较低、脱敏效果较差；本发明使用三种乳酸菌混合发酵来制备蜂花粉酵素，可显著增加蜂花粉酵素的营养功能成分和风味物质，且其中的主要致敏物质大分子蛋白质也被降解地更彻底。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种适合蜂花粉酵素的制备方法，这种适合蜂花粉酵素的制备方法采用气流粉碎破壁与三种乳酸菌混合发酵相结合的方式处理蜂花粉，提高了花粉的破壁率，使花粉内容物得到更充分的释放，有效增加蜂花粉的营养价值和活性成分的同时还能去除花粉中的主要过敏源，大大扩增了蜂花粉酵素的市场受众；最后发酵产物通过冷冻干燥和压片制成固态产品，具有广泛的市场前景。
10.本发明一种蜂花粉酵素的制备方法，包括如下步骤：
11.a制备种子液：将植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)从斜面培养基或甘油保藏管中分别接种至mrs培养基中于37℃、180r/min摇床内振荡培养28-36h；
12.b制备酵素发酵培养基：将巴氏灭菌后的蜂蜜添加到无菌水中，蜂蜜(含糖度为78～85brix)的添加比例为10-20g/l，然后添加经机械破壁后的蜂花粉，蜂花粉添加比例为500-550g/l，混合均匀；
13.c制备酵素发酵液：将种子液以10～15％(v/v)的比例接种至步骤b的蜂花粉酵素发酵培养基中，置于37-40℃摇床中以150-210r/min振荡培养48-60h；
14.d制备酵素成品：将发酵好的酵素液进行后续处理。
15.优选地，在步骤a中，活化三种乳酸菌，控制植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)的od
600
为2.0左右、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)的od
600
为2.1左右、罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的od
600
为1.5左右。
16.具体地，在步骤a中，所述mrs培养基为蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，酵母膏4g/l，葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾2g/l，三水合乙酸钠5g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，一水合硫酸锰0.005g/l，所述mrs培养基的ph为6-6.5。
17.进一步地，在步骤a中，植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)、罗伊氏乳杆菌322hr
(lactobacillus reuteri 322hr)在mrs 固体培养基上的菌落形态见下表1。
18.表1三种菌种的形态特征
[0019][0020]
优选地，在步骤b中，所述的机械破壁为气流粉碎机破壁。
[0021]
进一步地，在步骤b中，所述的蜂花粉可以为油菜花粉、荷花粉、 茶花粉、西瓜花粉、玉米花粉、荞麦花粉中的一种或几种，所述的蜂 蜜可以为桔花蜜、椴树蜜、荔枝蜜、刺槐蜜、紫云英蜜、油菜蜜、枣 花蜜、野桂花蜜、龙眼蜜、野菊花蜜、狼牙蜜、鹅掌柴蜜、乌桕蜜中 的一种或几种。
[0022]
优选地，在步骤c中，接种至发酵培养基中的植物乳杆菌322hp (lactobacillus plantarum 322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus 322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillus reuteri 322hr) 的体积比为1:1:1～3:1:1；所述植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum 322hp)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 cctcc no:m 20211049，保藏时间为2021年8月18日；所述嗜酸 乳杆菌322ha(lactobacillus acidophilus 322ha)保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20211048，保藏时间为2021 年8月18日；所述罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillus reuteri 322hr) 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m20211050，保藏时间为2021年8月18日。
[0023]
具体地，在步骤d中，所述的后续处理包括低温冷冻干燥及压片。
[0024]
本发明的有益效果：
[0025]
本发明一种适合蜂花粉酵素的制备方法针对蜂花粉采用气流粉 碎后再经三种乳酸菌混合发酵的方式以提高蜂花粉酵素的营养价值 及风味物质，发酵后的蜂花粉酵素营养物质增多、口感和风味提高， 含有大量的多糖和一定量的脂肪酸及蛋白质，以及丰富的维生素和微 量元素，能延缓人体细胞衰老过程，具有抗菌、抗过敏、抗发炎、抗 病毒以及抑制脂质过氧化等作用，其中的甾醇、多酚及不饱和脂肪酸 等物质更是可以改善毛细血管的脆性和渗透性、促进免疫器官发育、 增强免疫细胞活性、提高机体免疫功能，还能抗疲劳、増强记忆能力 等，尤其是其中的黄酮类物质，能够抑制前列腺增生、缓解前列腺炎、 治疗男性不育症，富含的多酚类物质不仅具有抗氧化、抗衰老的作用， 同时还能美容养颜。此外，经三种乳酸菌发酵后的蜂花粉酵素产品可 以去除花粉中的主要致敏源，扩大了蜂花粉的受众人群。
[0026]
为了更具体地体现出混菌相对于单菌的优越性，以油菜花粉酵素 的制备为例，分别将活化好的植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum 322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillus acidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillus reuteri 322hr)按10％ (v/v)的比例接种至成分相同的发酵培养基中，然后将植物乳杆菌 322hp(lactobacillus plantarum 322hp)、嗜酸乳杆菌322ha (lactobacillus acidophilus 322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr (lactobacillus reuteri 322hr)以3:1:1的体积比按10％(v/v)的比例 接种至同样的发酵培养基中，在相同条件下培养相同的时间，发酵结 束后得
到的不同油菜花粉酵素部分营养成分含量如下表2所示。
[0027]
表2不同菌种组合发酵得到的油菜花粉酵素营养成分含量
[0028][0029]
说明书附图
[0030]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方 案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简 单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记 标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
[0031]
图1是本发明以蜂花粉为原料制备蜂花粉酵素的工艺流程图。
具体实施方式
[0032]
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以 下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例， 而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0033]
需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学 术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
[0034]
本发明提供了一种以蜂花粉为原料得到蜂花粉酵素的制备工艺， 其中，原料蜂花粉符合蜂花粉食品安全标准gb/t 30359-2013，所用 蜂蜜符合蜂蜜食品安全标准gb14963-2011，所加无菌水为去离子水， 或符合国家饮用水标准。
[0035]
本发明蜂花粉酵素制备工艺所用菌种为植物乳杆菌322hp (lactobacillus plantarum 322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus 322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillus reuteri322hr)；其中，植物乳杆菌322hp(lactobacillus plantarum 322hp) 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国湖北省武汉市武 汉大学，保藏编号为cctcc no:m 20211049，保藏时间为2021年8 月18日；嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillus acidophilus 322ha)保藏 于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国湖北省武汉市武汉大 学，保藏编号为cctcc no:m 20211048，保藏时间为2021年8月 18日；罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillus reuteri 322hr)保藏于中 国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国湖北省武汉市武汉大学， 保藏编号为cctcc no:m 20211050，保藏时间为2021年8月18日。
[0036]
实施例一
[0037]
本发明一种蜂花粉酵素的制备方法，包括如下步骤：
[0038]
a制备种子液：将植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)从斜面培养基或甘油保藏管中分别接种至mrs培养基中于37℃、180r/min的摇床内振荡培养28-36h，直至植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的od
600
分别达到2.0、2.1以及1.5左右。所述mrs培养基为蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，酵母膏4g/l，葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾2g/l，三水合乙酸钠5g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，一水合硫酸锰0.005g/l，所述mrs培养基的ph为6.5；
[0039]
b制备酵素发酵培养基：将巴氏灭菌后的蜂蜜添加到无菌水中，蜂蜜(含糖度为78～85brix)添加比例为20g/l，然后添加经机械破壁后的油菜花粉，油菜花粉添加比例为550g/l，混合均匀；
[0040]
c制备酵素发酵液：将接种到发酵培养基中的植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)、罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的体积比控制为3:1:1并以10％(v/v)的接种量接种至步骤b的油菜花粉酵素发酵培养基中，置于38.5℃摇床中于180r/min振荡培养48h；
[0041]
d制备酵素成品：将发酵好的酵素液进行低温冷冻干燥并压片。
[0042]
实施例二
[0043]
本发明一种蜂花粉酵素的制备方法，包括如下步骤：
[0044]
a制备种子液：将植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)从斜面培养基或甘油保藏管中分别接种至mrs培养基中于37℃、180r/min的摇床内振荡培养28-36h，直至植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的od
600
分别达到2.0、2.1以及1.5左右。所述mrs培养基为蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，酵母膏4g/l，葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾2g/l，三水合乙酸钠5g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，一水合硫酸锰0.005g/l，所述mrs培养基的ph为6.5；
[0045]
b制备酵素发酵培养基：将巴氏灭菌后的蜂蜜添加到无菌水中，蜂蜜(含糖度为78～85brix)的添加比例为10g/l，然后添加经机械破壁后的油菜花粉，油菜花粉的添加比例为500g/l，混合均匀；
[0046]
c制备酵素发酵液：将接种到发酵培养基中的植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)、罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的体积比控制为3:1:1并以10％(v/v)的接种量接种至步骤b的油菜花粉酵素发酵培养基中，置于37℃摇床中于180r/min振荡培养48h；
[0047]
d制备酵素成品：将发酵好的酵素液进行低温冷冻干燥并压片。
[0048]
实施例三
[0049]
本发明一种蜂花粉酵素的制备方法，包括如下步骤：
[0050]
a制备种子液：将植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆
菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)从斜面培养基或甘油保藏管中分别接种至mrs培养基中于37℃、180r/min的摇床内震荡培养28-36h，直至植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的od
600
分别达到2.0、2.1以及1.5左右。所述mrs培养基为蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，酵母膏4g/l，葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾2g/l，三水合乙酸钠5g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，一水合硫酸锰0.005g/l，所述mrs培养基的ph为6.5；
[0051]
b制备酵素发酵培养基：向无菌水中添加经机械破壁后的油菜花粉，油菜花粉的添加比例为500g/l，混合均匀。
[0052]
c制备酵素发酵液：将接种到发酵培养基中的植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)、罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的体积比控制为1:1:1并以10％(v/v)的比例接种至步骤b的油菜花粉酵素发酵培养基中，置于37℃摇床中于150r/min振荡培养48h；
[0053]
d制备酵素成品：将发酵好的酵素液进行低温冷冻干燥并压片。
[0054]
实施例四
[0055]
本发明一种蜂花粉酵素的制备方法，包括如下步骤：
[0056]
a制备种子液：将植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)从斜面培养基或甘油保藏管中分别接种至mrs培养基中于37℃、180r/min的摇床内内振荡培养28-36h，直至植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的od
600
分别达到2.0、2.1以及1.5左右。所述mrs培养基为蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，酵母膏4g/l，葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾2g/l，三水合乙酸钠5g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，一水合硫酸锰0.005g/l，所述mrs培养基的ph为6.5；
[0057]
b制备酵素发酵培养基：将巴氏灭菌后的蜂蜜添加到无菌水中，蜂蜜(含糖度为78～85brix)的添加比例为10g/l，然后添加经机械破壁后的油菜花粉，油菜花粉的添加比例为500g/l，混合均匀；
[0058]
c制备酵素发酵液：将接种到发酵培养基中的植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)、罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的体积比控制为1:1:1并以6％(v/v)的比例接种至步骤b的油菜花粉酵素发酵培养基中，置于37℃摇床中于180r/min振荡培养48h；
[0059]
d制备酵素成品：将发酵好的酵素液进行低温冷冻干燥并压片。
[0060]
实施例五
[0061]
本发明一种蜂花粉酵素的制备方法，包括如下步骤：
[0062]
a制备种子液：将植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)从斜面培养基或甘油保藏管中分别接种至mrs培养基中于37℃、180r/min
的摇床内振荡培养28-36h，直至植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusacidophilus322ha)及罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的od
600
分别达到2.0、2.1以及1.5左右。所述mrs培养基为蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，酵母膏4g/l，葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾2g/l，三水合乙酸钠5g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，一水合硫酸锰0.005g/l，所述mrs培养基的ph为6.5；
[0063]
b制备酵素发酵培养基：将巴氏灭菌后的蜂蜜添加到无菌水中，蜂蜜(含糖度为78～85brix)的添加比例为10g/l，然后添加经机械破壁后的油菜花粉，油菜花粉的添加比例为500g/l，混合均匀；
[0064]
c制备酵素发酵液：将接种到发酵培养基中的植物乳杆菌322hp(lactobacillusplantarum322hp)、嗜酸乳杆菌322ha(lactobacillusplantarum322hp)、罗伊氏乳杆菌322hr(lactobacillusreuteri322hr)的体积比控制为1:1:1并以10％(v/v)的比例接种至步骤b的油菜花粉酵素发酵培养基中，置于40℃摇床中于210r/min振荡培养48h；
[0065]
d制备酵素成品：将发酵好的酵素液进行低温冷冻干燥并压片。
[0066]
本发明实施例一到五制备得到的油菜花粉酵素部分营养成分含量如表3所示。黄酮依据gb/t20574-2006进行测定；总多酚依据t/ahfia005-2018进行测定；粗多糖依据sn/t4260-2015进行测定；总酸依据gb12456-2021进行测定；sod酶活力依据gb/t5009.171-2003进行测定；羟自由基清除能力依据fenton法进行测定；超氧阴离子自由基清除能力依据pms/nadh体系还原nbt法进行测定；dpph自由基清除能力依据dpph甲醇溶液显色法进行测定；abts自由基清除能力依据abts过硫酸钾溶液显色法进行测定。测定过程所用的试剂及配制方法见表4。
[0067]
表3实施例酵素产品中部分营养成分含量
[0068][0069][0070]
表4部分营养成分测定所需试剂及配制方法
[0071][0072][0073]
通过上表实验测试数据，本发明实施例制备得到的蜂花粉酵素营 养成分中黄酮、
总多酚、粗多糖、总酸和sod酶活力明显得到提升， 使蜂花粉酵素营养更加丰富，还能有效去除花粉中的主要致敏源，扩 大了蜂花粉酵素的受众人群。
[0074]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何 形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术 实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于 本发明技术方案的范围内。