含有肽组分的营养组合物及其用途的制作方法

含有肽组分的营养组合物及其用途
1.本技术是申请日为2014年3月11日，中国国家申请号为201480015653.5，发明名称为“含有肽组分的营养组合物及其用途”的发明申请的分案申请。
技术领域
2.本公开内容涉及可减少自身免疫性疾病发病率的包含肽组分的营养组合物。更具体地说，所述营养组合物可减少糖尿病的发病率，包括1型糖尿病(“t1d”)和2型糖尿病(“t2d”)。本文描述的营养组合物适合给予成人和儿童受试者。营养组合物的肽组分包括本文公开的选择的肽。
3.此外，本公开内容涉及通过提供包含本文描述的肽组分的营养组合物，减少自身免疫性疾病的发病率的方法。


背景技术：

4.自身免疫性疾病起因于人体对存在于体内的某些组织的不适当的免疫反应。这种自身免疫反应可限于某些器官，例如胰腺(如在糖尿病中)，或可仅影响某些组织和器官的某些膜。免疫系统的功能之一是通过对入侵微生物，例如病毒或细菌的反应，通过产生抗体或增敏的淋巴细胞来保护身体。在正常条件下，不能针对人们的自身细胞触发免疫反应。然而，自身免疫性疾病的特征在于身体的免疫系统可能会犯错误并攻击它们所要保护的细胞。因此，自身免疫性疾病涵盖广泛种类的相关疾病，其中身体免疫系统攻击其自身组织。
5.自身免疫性疾病是由变得误导身体的健康细胞和/或组织的免疫细胞引起的任何疾病。目前，自身免疫性疾病影响3%的美国人口并且很可能影响类似百分率的工业化世界人口。自身免疫性疾病的特征为异常靶向自-蛋白、-多肽、-肽和/或引起体内器官、组织或细胞类型损害和/或功能障碍的其它自-分子的t和b淋巴细胞。因此，当有一些正常控制过程(其使得淋巴细胞避免抑制)中断时，或当在一些身体组织中存在变化，以致其不再被识别为“自身的”并因此受到攻击时，发生自身免疫性疾病。引起自身免疫性疾病的准确机理可以不同，但可由许多因素触发，所述因素包括：细菌、病毒、毒素、药物和遗传倾向。
6.自身免疫性疾病包括影响特定组织的疾病以及可影响多个组织的疾病。组织特异性自身免疫的特征性特征是单一组织或单个细胞类型的选择性靶向。然而，某些靶向遍在自-蛋白的自身免疫性疾病也可影响特定组织。
7.具体的自身免疫性疾病通常分类为器官特异性疾病和非-器官-特异性类型。例如，桥本氏病(hashimoto’s disease)影响甲状腺，爱迪生氏病(addison’s disease)影响肾上腺，和1型糖尿病影响胰腺。非-器官-特异性自身免疫性疾病的实例包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和皮肌炎。目前已知超过30种自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、胰岛素-依赖性糖尿病、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮和硬皮病。自身免疫性疾病的另外的非限制性实例包括：急性播散性脑脊髓炎、爱迪生氏病(addison’s disease)、肌萎缩性侧索硬化、自身免疫性肝炎、自身免疫性淋巴增生性综合征、伯杰氏病(berger’s disease)、blau综合征、某些类型的癌症、腹腔疾病、美洲锥虫病、慢性复发性多灶性骨髓
炎、churg-strauss综合征、cogan综合征、冷凝集素病、克罗恩氏病(crohn's disease)、库兴氏综合征(cushing's syndrome)、1型糖尿病、evan’s综合征、grave’s病、桥本氏脑病(hashimoto’s encephalopathy)、川崎氏病(kawasaki’s disease)、lou gehrig’s病、美尼尔氏病(meniere's disease)、多发性硬化、神经性肌强直、眼瘢痕性类天疱疮、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺现象(reynaud phenomenon)、reiter’s综合征、不宁腿综合征、类风湿性关节炎、干燥综合征(sjogren’s syndrome)、颞动脉炎、横贯性脊髓炎、血管炎和韦格纳氏肉芽肿(wegener’s granulomatosis)。
8.糖尿病是特征为持续的高血糖状态(由于胰岛素作用的缺乏)的代谢病症的一个通用术语。一般来说，糖尿病粗略地分为胰岛素-依赖性糖尿病(“iddm”)和非-胰岛素-依赖性糖尿病(“niddm”)。iddm的一种形式包括1型糖尿病(“t1d”)，其是由胰腺的产生胰岛素的β细胞的自身免疫性破坏导致的糖尿病形式。
9.胰岛素是抑制血糖水平升高的生物物质。胰岛素是由胰腺分泌的激素，其可在肝中促进碳水化合物代谢和增强肌肉细胞和脂肪细胞对葡萄糖的吸收，以降低升高的血糖水平。缺乏胰岛素，其导致血糖和尿糖增加，在胰腺的β细胞正被破坏和当所有的β细胞已经被破坏这两种情况下被观察到。因此，糖尿病的特征为复发性或持续性高血糖。
10.t1d可由许多不同的因素引起，包括遗传因素、环境因素、饮食因素、个体的总体敏感性、糖尿病的触发剂和/或暴露于驱动抗原。目前t1d被认为是一种多基因病，这意味着不同的基因可促进t1d的发病。
11.t1d的典型症状包括多尿症(尿频)、多饮(增加的口渴)、口腔干燥(干口)、多食症(增加的饥饿感)、疲劳和体重减轻。通常，未治疗的t1d可导致糖尿病酮症酸中毒。糖尿病酮症酸中毒是潜在的威胁生命的并发症，其在当身体经历胰岛素缺乏并因此为了能量开始分解脂肪酸时发生。脂肪酸的分解产生酸性酮体，其引起本文描述的许多症状。
12.另一形式的糖尿病包括t2d，其是其中由于胰岛素分泌不足和由不确定和多样的因素例如年老、应激和饮食引起的胰岛素抵抗而表现为高血糖的一类糖尿病。t2d的特征为niddm。典型地，患有糖尿病的所有个体的约90%属于niddm。
13.餐后血糖水平的快速增加及其延续许多年被认为是加重糖尿病。糖尿病的加重常常伴有血管病的发展，这可导致神经症、肾病和视网膜病的发展并导致心肌梗塞和中风的其它并发症。
14.通常对于易于发生或易患糖尿病的个体，可采用某些类型的饮食和锻炼疗法。采用某些锻炼和饮食方式可帮助稳定血糖水平且可改进整体碳水化合物代谢。
15.证据显示严格的血糖控制是预防与糖尿病相关的并发症的主要因素。然而，由于胰腺细胞功能的逐渐丧失所致的高血糖进行性恶化，目前可获得的药物一般不能维持足够的长期血糖控制。因此，通过药物、治疗方案、营养补剂和/或营养组合物的最佳血糖控制是治疗糖尿病的重要途径。虽然糖尿病可通过胰岛素或给予口服降血糖药物治疗，但仍有对减少糖尿病发病率的安全和有效的营养补剂或营养组合物的需求。
16.自身免疫性疾病可以用免疫抑制剂、激素替代疗法或输血(在自身免疫性血液病的情况下)治疗。这些治疗包括几种不需要的副作用且对于目标受试者而言可能是昂贵的。其次，当给予免疫抑制剂时，一般来说，在降低免疫系统的活性同时允许免疫系统对抗疾病的能力之间存在脆弱的平衡。此外，免疫抑制剂可引起不需要的副作用例如骨丢失和/或骨
和组织退化。
17.因此，本公开内容提供包含肽组分的营养组合物，其可减少自身免疫性疾病的发病率。此外，本公开内容提供包含肽组分的营养组合物，其可通过提供给目标受试者包含本文公开的肽组分的营养组合物，减少t1d和t2d的发病率。
18.本发明的公开内容简单地说，在一个实施方案中，本公开内容涉及包含蛋白等价物源的营养组合物，所述蛋白等价物源包含含有seq id no 4、seq id no 13、seq id no 17、seq id no 21、seq id no 24、seq id no 30、seq id no 31、seq id no 32、seq id no 51、seq id no 57、seq id no 60和seq id no 63的肽组分。在一些实施方案中，肽组分包含至少10种选自表1的另外的肽。
19.在一些实施方案中，肽组分可包含至少5种选自表1的肽和至少另外3种选自表2的肽。在又一个实施方案中，肽组分可包含至少10种选自表1的另外的肽。
20.在一些实施方案中，20%-80%的蛋白等价物源包括本文描述的蛋白质组分和20%-80%的蛋白等价物源包括完整蛋白、水解蛋白(包括部分水解蛋白)及其组合。
21.本公开内容的营养组合物可还包含婴儿配方食品。在一些实施方案中，本公开内容的营养组合物可包含儿童营养组合物、营养补剂或成人营养组合物。
22.在一些实施方案中，本公开内容涉及一种减少自身免疫性疾病的发病率的方法，该方法包括提供包含蛋白等价物源的营养组合物，所述蛋白等价物源包含本文公开的肽组分。在还有的其它实施方案中，本公开内容提供通过提供包含本文公开的肽组分的营养组合物，用于减少糖尿病的发病率的方法。
23.应理解，前面的一般性描述和下面的详细描述二者提供本公开内容的实施方案，并意欲提供用于理解如所要求保护的本公开内容的性质和特征的概观或框架。说明书起着解释要求保护的主题的原理和操作的作用。本公开内容的其它和进一步的特征和优点在本领域技术人员阅读以下公开内容后将是显而易见的。
24.附图简述图1说明通过激活暴露于广泛水解酪蛋白的原代人树突细胞的il12p70的促炎细胞因子分泌。
25.图2说明通过激活暴露于大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的原代人树突细胞的il12p70的促炎细胞因子分泌。
26.图3说明通过激活暴露于广泛水解酪蛋白的人树突细胞的干扰素-γ的促炎细胞因子分泌。
27.图4说明通过激活暴露于大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的原代人树突细胞的干扰素-γ的促炎细胞因子分泌。
28.图5说明通过激活暴露于广泛水解酪蛋白的人树突细胞的白介素-8的促炎细胞因子分泌。
29.图6说明通过激活暴露于大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的原代人树突细胞的白介素-8的促炎细胞因子分泌。
30.图7说明通过激活暴露于广泛水解酪蛋白的人树突细胞的肿瘤坏死因子-α的促炎细胞因子分泌。
31.图8说明通过激活暴露于大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的原代人树突细胞的肿瘤坏死因子-α的促炎细胞因子分泌。
32.图9说明通过激活暴露于广泛水解酪蛋白的人树突细胞的白介素-6的促炎细胞因子分泌。
33.图10说明通过激活暴露于大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的原代人树突细胞的白介素-6的促炎细胞因子分泌。
34.图11说明通过激活暴露于广泛水解酪蛋白的人树突细胞的白介素-1β的促炎细胞因子分泌。
35.图12说明通过激活暴露于大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的人树突细胞的白介素-1β的促炎细胞因子分泌。
36.图13显示当暴露于广泛水解酪蛋白时，激活的原代人巨噬细胞的肿瘤坏死因子-α的分泌。
37.图14说明当暴露于大于500 da部分的广泛水解酪蛋白时，激活的原代人巨噬细胞的肿瘤坏死因子-α的分泌。
38.图15说明在nod小鼠、balb/c小鼠和广泛水解酪蛋白饮食喂养的nod小鼠的回肠中白介素-1 (il1)的分泌。
39.图16说明在nod小鼠、balb/c小鼠和广泛水解酪蛋白饮食喂养的nod小鼠的回肠中白介素-18 (il18)的分泌。
40.图17说明在nod小鼠、balb/c小鼠和广泛水解酪蛋白饮食喂养的nod小鼠的回肠中白介素-6 (il6)的分泌。
41.图18说明在nod小鼠、balb/c小鼠和广泛水解酪蛋白饮食喂养的nod小鼠的回肠中白介素-17 (il17)的分泌。
42.图19说明nod小鼠、balb/c小鼠和广泛水解酪蛋白饮食喂养的nod小鼠的肠道-引流淋巴结t细胞的ifn-γ的分泌。
43.图20说明nod小鼠、balb/c小鼠和广泛水解酪蛋白饮食喂养的nod小鼠的肠道-引流淋巴结t细胞的白介素-4的分泌。
44.图21说明nod小鼠、balb/c小鼠和广泛水解酪蛋白饮食喂养的nod小鼠的肠道-引流淋巴结t细胞的白介素-17的分泌。
45.图22说明来自暴露于广泛水解酪蛋白、非-无菌过滤的广泛水解酪蛋白和大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的小鼠巨噬细胞的白介素-12p40的促炎细胞因子分泌。
46.图23说明来自暴露于广泛水解酪蛋白、非-无菌过滤的广泛水解酪蛋白和大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的小鼠巨噬细胞的白介素-1β的促炎细胞因子分泌。
47.图24说明来自暴露于广泛水解酪蛋白、非-无菌过滤的广泛水解酪蛋白和大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的小鼠巨噬细胞的白介素-6的促炎细胞因子分泌。
48.图25说明来自暴露于广泛水解酪蛋白、非-无菌过滤的广泛水解酪蛋白和大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的小鼠巨噬细胞的肿瘤坏死因子-α的促炎细胞因子分泌。
49.图26说明来自暴露于广泛水解酪蛋白、非-无菌过滤的广泛水解酪蛋白和大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的小鼠巨噬细胞的白介素-12p40、白介素-1β、白介素-6和肿瘤坏死因子-α的促炎细胞因子分泌。
50.图27说明在暴露于il-1β时，广泛水解的酪蛋白对胰岛素分泌(n=4)的影响。
51.图28说明在暴露于il-1β时，大于500 da部分的广泛水解酪蛋白对胰岛素分泌(n=4)的相应影响。
52.图29说明在暴露于ifn-γ时，水解产物样品对胰岛素分泌(n=4)的影响。
53.图30说明在暴露于il-23时，广泛水解酪蛋白对胰岛素分泌(n=4)的影响。
54.图31说明对于il-17，》500da部分的广泛水解的酪蛋白的相应影响。
55.实施本发明的最佳方式现在将详细地提及本公开内容的实施方案，下文阐述了其一个或多个实例。各个实例通过解释本公开内容的营养组合物来提供，并且不是限制。实际上，对于本领域技术人员将是显而易见的是，可在不偏离本公开内容的范围的情况下对本公开内容的教义进行各种修改和变动。例如，作为一个实施方案的一部分说明或描述的特征，可以与另一个实施方案一起使用以产生又一个实施方案。
56.因此，预期本公开内容涵盖落入随附权利要求书的范围内的这类修改和变动及其等同内容。本公开内容的其它目的、特征和方面公开于下面的详细描述，或从下面的详细描述来看是显而易见的。本领域普通技术人员要了解，本论述只是示例性实施方案的描述，并无意限制本公开内容的更宽泛的方面。
57.本公开内容总体上涉及包含肽组分的营养组合物。此外，本公开内容涉及通过提供目标受试者一种含有本文描述的肽组分的营养组合物，减少自身免疫性疾病和/或糖尿病的发病率的方法。
[0058]“营养组合物”意指满足受试者的营养需要的至少一部分的物质或制剂。术语“营养品”、“营养配方食品”、“肠内营养品”和“营养补剂”在整个公开内容中使用作为营养组合物的非限制性实例。而且，“营养组合物”可指液体剂、散剂、凝胶剂、糊剂、固体剂、浓缩剂、混悬剂或即用形式(ready-to-use form)的肠内配方食品、口服配方食品、婴儿配方食品、儿童受试者配方食品、儿童配方食品、成长乳和/或成人配方食品。
[0059]
术语“肠内”意指可通过胃肠道或消化道或在胃肠道或消化道内传递的。“肠内给予”包括经口喂食、灌胃给食、经幽门给予或任何其它给予进入消化道。“给予”比“肠内给予”更广义并包括胃肠外给予或使物质进入受试者体内的任何其它给予途径。
[0060]
如本文所用的术语“肽”描述氨基酸的线性分子链，包括单一链分子或它们的片段。本文描述的肽包含总共不超过50个氨基酸。肽还可形成低聚体或由至少两个相同或不同的分子组成的多聚体。这样的多聚体的相应的更高级结构相应地被称为同源-或异源二聚体、同源-或异源三聚体等。而且，术语“肽”也涵盖这样的肽的拟肽(其中氨基酸和/或肽键已被功能类似物替代)。这样的功能类似物可包括，但不限于，除了20个基因编码的氨基酸之外所有已知的氨基酸，例如硒代半胱氨酸。
[0061]
术语“肽”也可指其中进行了修饰的天然修饰肽，例如，通过糖基化、乙酰化、磷酸化和本领域熟知的类似修饰。此外，肽可例如经重组地、半-合成地、合成地生产，或从天然来源例如蛋白质水解后获得，全部依据本领域已知的方法。
[0062]
术语“水解度”指肽键被水解方法打破的程度。水解后存在的肽可以被水解至各种程度。例如，在一些实施方案中，本公开内容的蛋白等价物源可包含具有水解度不大于40%的蛋白质。这意味着蛋白质的不大于40%的肽键已被水解方法打破。
[0063]
术语“部分水解的”意指具有大于0%但少于50%的水解度。
[0064]
术语“广泛水解的”意指具有大于或等于50%的水解度。
[0065]
术语“摩尔质量分布”当用于提及水解蛋白或蛋白水解物时，指存在于蛋白水解物中的各种肽的摩尔质量。例如，具有摩尔质量分布大于500道尔顿的蛋白水解物意指蛋白水解物中包含的各种肽具有至少500道尔顿的摩尔质量。因此，在一些实施方案中，表1和表2中公开的肽衍生自具有大于500道尔顿的摩尔质量分布的蛋白水解物。为提供具有摩尔质量分布大于500道尔顿的蛋白水解物，蛋白水解物可经受某些过滤程序或本领域已知的用于除去肽、氨基酸和/或具有摩尔质量少于500道尔顿的其它蛋白质材料的任何其它程序。为了本公开内容的目的，本领域已知的任何方法可以用来生产具有摩尔质量分布大于500道尔顿的蛋白水解物。
[0066]
术语“蛋白等价物”或“蛋白等价物源”包括任何蛋白质源，例如大豆、蛋、乳清或酪蛋白，以及非-蛋白质源，例如肽或氨基酸。蛋白等价物源可以是本领域使用的任何来源，例如，脱脂乳、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、水解蛋白、氨基酸等。可用于实施本公开内容的牛乳蛋白源包括，但不限于，乳蛋白粉、乳蛋白浓缩物、乳蛋白分离物、脱脂乳固体、脱脂乳、脱脂奶粉、乳清蛋白、乳清蛋白分离物、乳清蛋白浓缩物、甜乳清、酸乳清、酪蛋白、酸酪蛋白、酪蛋白酸盐(如酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钠钙、酪蛋白酸钙)、大豆蛋白质，及其任何组合。在一些实施方案中，蛋白等价物源可包含水解蛋白，包括部分水解蛋白和广泛水解蛋白。在一些实施方案中，蛋白等价物源可包括完整蛋白。
[0067]
术语“蛋白等价物源”还包含游离氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸可包含，但不限于，组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、肉毒碱、牛磺酸及其混合物。在一些实施方案中，氨基酸可以是支链氨基酸。在某些其它实施方案中，小氨基酸肽可以作为营养组合物的蛋白质组分被包括在内。这样的小氨基酸肽可以是天然存在的或合成的。
[0068]“儿童受试者”意指年龄不足13岁的人。在一些实施方案中，儿童受试者是指介于出生和8岁之间的人受试者。在其它实施方案中，儿童受试者是指介于1到6岁之间的人类受试者。在更进一步的实施方案中，儿童受试者是指介于6到12岁之间的人类受试者。术语“儿童受试者”可指如下所述的婴儿(早产或足月)和/或儿童。
[0069]“婴儿”意指年龄范围从出生至不满1岁的人类受试者并包括从0至12个月的矫正年龄的婴儿。短语“矫正年龄”意指婴儿的实足年龄减去婴儿早产的时间量。因此，如果怀胎已达足月，则矫正年龄是该婴儿的年龄。术语婴儿包括低出生体重婴儿、非常低出生体重婴儿和早产婴儿。“早产儿”意指在妊娠的第37周结束前出生的婴儿，而“足月儿”意指在妊娠的第37周结束后出生的婴儿。
[0070]“儿童”意指年龄范围从12个月至约13岁的受试者。在一些实施方案中，儿童是年龄介于1和12岁之间的受试者。在其它实施方案中，术语“儿童”是指介于1和约6岁之间或介于约7和约12岁之间的受试者。在其它实施方案中，术语“儿童”是指介于12个月和约13岁之间的任何年龄范围。
[0071]“儿童的营养制品”指满足儿童的至少一部分营养需要的组合物。成长乳是儿童的营养制品的实例。
[0072]“婴儿配方食品”意指满足婴儿的至少部分营养需求的组合物。在美国，21 c.f.r.第100、106和107章阐述的联邦法规规定了婴儿配方食品的内含物。这些法规限定尽力模拟人母乳的营养和其它性质的常量营养物、维生素、矿物质和其它成分水平。
[0073]
术语“成长乳”是指预期用作不同膳食的一部分，以支持年龄介于约1和约6岁之间的儿童的正常成长和发育的一大类营养组合物。
[0074]“营养完全的”意指可用作营养的唯一来源的组合物，其可供应基本上所有每日必需量的维生素、矿物质和/或痕量元素以及蛋白质、碳水化合物和脂质。实际上，“营养完全的”描述了提供支持受试者的正常生长和发育所需的足量碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量的营养组合物。
[0075]
因此，按定义，对早产儿是“营养完全的”营养组合物提供早产儿生长所需要的质量上和数量上足量的碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
[0076]
按定义，对足月婴儿是“营养完全的”的营养组合物提供足月婴儿生长所需要的质量上和数量上足量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
[0077]
按定义，对儿童是“营养完全的”的营养组合物提供儿童生长所需要的质量上和数量上足量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
[0078]
当应用于营养物时，术语“必需的”是指机体无法以足用于正常生长和维持健康的量合成，因此必须通过膳食供应的任何营养物。术语“条件必需的”在应用于营养物时意指在机体出现无法获得用于内源合成的足量的前体化合物的条件下营养物必须通过膳食供应。
[0079]“益生元”意指不易消化的食物成分，其通过选择性地刺激消化道中一种或有限数量的可增进宿主健康的细菌生长和/或活性而有益地影响宿主。
[0080]“益生菌”意指对宿主的健康发挥至少一种有益作用的具有低致病性或无致病性的微生物。
[0081]
术语“灭活的益生菌”意指这样的益生菌，其中所提及的益生菌生物体的代谢活性或繁殖能力已经减少或被破坏。然而，“灭活的益生菌”在细胞水平上仍然保留至少一部分其生物二醇-蛋白和dna/rna结构。如本文所用的，术语“灭活的”与“无活力的”同义。更具体地说，灭活的益生菌的非-限制性实例是灭活的鼠李糖乳杆菌gg (lactobacillusrhamnosusgg) (“lgg”)或“灭活的lgg”。
[0082]
如本文所用的所有百分比、份数和比例均基于总制剂的重量计，除非另外指明。
[0083]
本公开内容的营养组合物可基本上不含任何本文所述的任选的或选择的成分，条件是其余的营养组合物仍含有本文所述的所有必需成分或特征。在本上下文中，并且除非另外指明，否则术语“基本上不含”意指所选的组合物可含有小于有用量的任选成分，通常小于0.1%重量，并且还包括0%重量的此类任选或选择的成分。
[0084]
本公开内容提及的所有单数特性或限制应包括相应的复数特征或限制，并且反之亦然，除非另外指明或在提及的上下文中有相反的明显提示。
[0085]
可以任何顺序进行本文所采用的方法或过程步骤的所有组合，除非另有说明或在
作出所提及的组合的上下文中明确说明与之相反。
[0086]
本公开内容的方法和组合物(包括其组分)，可包含本文所述实施方案的必需要素和限制以及本文或别处描述的可用于营养组合物的任何额外或任选的成分、组分或限制；由本文所述实施方案的必需要素和限制以及本文或别处描述的可用于营养组合物的任何额外或任选的成分、组分或限制组成；或基本由它们组成。
[0087]
本文所用术语“约”应解释为是指任何范围的端点所指定的两个数字。对范围的任何提及应视为对该范围内的任何子集提供支持。
[0088]
自身免疫性疾病，包括糖尿病，是广泛存在的、未能治愈的慢性疾病。自身免疫性疾病的发病率和流行率正呈指数增长。例如，在发达和发展中国家中，糖尿病是最常见的代谢性疾病之一。此外，用来治疗自身免疫性疾病的免疫抑制剂具有不需要的副作用且可降低免疫系统抵抗感染的能力。
[0089]
糖尿病与高血糖、高胆固醇血症和高脂血症有关。未控制的高血糖由于微血管和大血管疾病(包括肾病、神经病、视网膜病、高血压、中风和心脏病)的风险增加，与增加和过早的死亡率有关。
[0090]
因此，本公开内容总体上涉及包含蛋白等价物源的营养组合物，其中蛋白等价物源包括含有seq id no 4、seq id no 13、seq id no 17、seq id no 21、seq id no 24、seq id no 30、seq id no 31、seq id no 32、seq id no 51、seq id no 57、seq id no 60和seq id no 63的肽组分。在一些实施方案中，肽组分可包含在表1中公开的另外的肽。例如，组合物可包括至少10种在表1中公开的另外的肽。在一些实施方案中，20%-80%的蛋白等价物源包含肽组分，和20%-80%的蛋白等价物源包括完整蛋白、部分水解蛋白及其组合。在一些实施方案中，术语“另外的”意指选择与那些枚举的不同的肽。
[0091]
在另一个实施方案中，20%-80%的蛋白等价物源包括肽组分，所述肽组分包含至少5种选自表1的肽和至少3种选自表2的另外的肽；和20%-80%的蛋白等价物源包括完整蛋白、部分水解蛋白或其组合。
[0092]
不受任何特别的理论的束缚，包含表1和/或表2中鉴定的肽的肽组分可防止血糖水平的升高，促进糖原储存，增强体力和/或促进糖原储存。此外，提供包含来自表1和/或表2的某些肽的营养组合物可防止或减少自身免疫性疾病和/或糖尿病的发病率。
[0093]
下表1鉴定可以包括在本文公开的肽组分中的肽的具体氨基酸序列。
[0094]
表1
下表2还鉴定来自表1的具体氨基酸序列的亚组，其可包括和/或包含在本文公开的肽组分中。
[0095]
表2在一些实施方案中，肽组分可以从约0.2 g/100 kcal至约5.6 g/100 kcal的量存在于营养组合物中。在其它实施方案中，肽组分可以从约1 g/100 kcal至约4 g/100 kcal
的量存在于营养组合物中。在还有的其它实施方案中，肽组分可以从约2 g/100 kcal至约3 g/100 kcal的量存在于营养组合物中。
[0096]
肽组分可与营养组合物中的其它成分一起配制，以提供用于目标受试者适宜的营养物水平。在一些实施方案中，肽组分被包括在适合于支持正常生长的营养完全的配方食品中。
[0097]
在一些实施方案中，肽组分可包含可加入到其它营养制剂、食品或饮料中的营养补剂。为了本公开内容的目的，“营养补剂”包括营养物的浓缩来源，例如本文鉴定的肽，或者备选地，其目的为是补充正常饮食的具有营养或生理功效的其它物质。
[0098]
肽组分可以作为蛋白等价物源的要素提供。在一些实施方案中，在表1和2中鉴定的肽可由从牛乳蛋白(包括但不限于牛酪蛋白和牛乳清)获得的蛋白等价物源提供。在一些实施方案中，蛋白等价物源包括水解牛酪蛋白或水解牛乳清。因此，在一些实施方案中，在表1和2中鉴定的肽可由酪蛋白水解产物提供。这样的肽可通过水解获得或可通过技术人员已知的方法在体外合成。
[0099]
本文公开水解方法的非限制性实例。在一些实施方案中，可使用这种方法以获得本公开内容的蛋白水解物和肽。蛋白质使用蛋白水解酶，蛋白酶n水解。蛋白酶n
ꢀ“
amano”可从amano enzyme u.s.a. co., ltd., elgin, ill经市售获得。蛋白酶n是源自菌种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的蛋白水解酶制剂。蛋白酶粉末被指定为“不少于150,000单位/g”，意思是蛋白酶n的一个单位是在7.0的ph下经60分钟产生等同于100微克酪氨酸的氨基酸的酶的量。为提供本发明的婴儿配方食品，蛋白酶n可以被水解总蛋白质的约0.5%-约1.0%重量的水平使用。
[0100]
经蛋白酶n的蛋白质水解通常在约50℃-约60℃的温度下进行。水解发生一段时间以获得介于约4%和10%之间的水解度。在特定的实施方案中，水解发生一段时间以获得介于约6%和9%之间的水解度。在另一个实施方案中，水解发生一段时间以获得约7.5%的水解度。这种水解的水平可能花费约半小时-约3小时。
[0101]
在水解期间应维持恒定的ph。在本发明的方法中，ph被调整至和维持在约6.5和8之间。在特定的实施方案中，ph维持在约7.0。
[0102]
为维持乳清蛋白、酪蛋白、水和蛋白酶n的溶液的最适ph，氢氧化钠和/或氢氧化钾的苛性碱溶液可被用来在水解期间调节ph。如果使用氢氧化钠调节ph，加入到该溶液的氢氧化钠的量应控制在这样的水平，即在最终蛋白水解物中包含少于约0.3%的总固体。在加入酶之前或者在水解过程期间，10%的氢氧化钾溶液也可用来调节溶液的ph至所需值，以维持最适ph。
[0103]
在蛋白质水解期间加入到该溶液的苛性碱溶液的量可通过ph固定计(ph-stat)或通过连续和按比例加入苛性碱溶液加以控制。水解产物可通过标准分批过程或通过连续过程制备。
[0104]
为了更好地确保一致的蛋白质部分水解产物的质量，水解产物经受酶失活以终止水解过程。酶失活步骤可包括在约82℃的温度下热处理约10分钟。或者，酶可通过加热该溶液至约92℃的温度约5秒钟而失活。在酶失活完成后，水解产物可在低于10℃的温度下呈液态贮存。
[0105]
实施例1
实施例1进一步说明一种产生蛋白质部分水解产物的方法。首先，将60.3 kg非-乳固体(奶粉)和37.4 kg乳清蛋白浓缩物(60%)在含有54℃的水的罐中混合。浆液具有介于20%和23%之间的总固体含量。然后测量浆液的ph。将氢氧化钠和氢氧化钾加入到浆液以调节浆液的ph至7.0。在调节ph后，将0.5 kg的amano n酶加入到浆液中。在加入amano n至浆液后，使用氢氧化钠和氢氧化钾将ph连续地调节至ph 7.0。加入到浆液中的氢氧化钠总量是0.3 kg。加入到浆液中的氢氧化钾总量是1.5 kg。
[0106]
允许水解发生90分钟，该时间自加入amano n酶至浆液中开始计。在90分钟结束时，浆液经热处理以灭活酶。热处理包括升高浆液的温度至82℃达10分钟。在该实施例中获得的水解度是在6%和9%之间。然后冷却浆液和喷雾干燥，得到粉末状水解产物。
[0107]
实施例2实施例2提供一种测定水解产物肽的分子量分布的非-限制性方法。
[0108]
尺寸排阻色谱法(sec)被用来测定由本文描述的水解过程建立的水解产物肽的分子量分布。特别地，称出足够量的粉末状婴儿配方食品以提供0.5克蛋白质至50 ml尖底离心管中。加水使管到45毫升的体积。将该混合物置于sarstedt d-5223混合器中并混合1小时。混合后，通过加入另外5 ml水至管中创立1%蛋白质溶液。准备储备液标准并且还混合1小时。
[0109]
此外，将14.91克氯化钾(kcl)加入到1000 ml烧瓶中。通过加入700 ml水至烧瓶来溶解kcl。然后将250 ml乙腈和1.0 ml三氟乙酸加入到kcl溶液(洗脱液)中。使用0.2m k2hpo4溶液将ph调节至3.0。
[0110]
填充hpcl试剂瓶并用洗脱液洗涤瓶，保留约50 ml用于稀释样品和标准品。用洗脱液清洗hitachi l-6200 a智能泵线(hitachi l-6200 a intelligent pump line)且柱用洗脱液平衡1小时。
[0111]
在样品混合1小时后，将5.0 ml的每个样品移进玻璃螺帽管中。5.0 ml二氯甲烷也被移入各管中。盖帽各管并经反复颠倒4次来混合。然后将样品以200
×
g离心5分钟。
[0112]
在样品置于离心分离机中的同时，用洗脱液稀释储备液标准品1-5 (800 ul+3200 ul)。将约1 ml的各个标准品移入两个自动进样管的每一个中并盖帽。
[0113]
离心的样品1-10的上(含水)层用洗脱液(100 ul+900 ul)稀释。将如下的管装载到自动进样器托盘中：空白品、标准品、样品和第二标准品。将托盘置于hitachi自动进样器中。使用自动进样器前部的键使要运行的管的总数目进入自动进样程序并运行样品。结果指明了蛋白质的分子量分布。
[0114]
在一些实施方案中，蛋白等价物源包括部分水解蛋白，例如酪蛋白。在一些实施方案中，蛋白等价物源包括水解蛋白，其包含具有大于500道尔顿的摩尔质量分布的肽。在一些实施方案中，水解蛋白包含具有摩尔质量分布在从约500道尔顿至约1,500道尔顿范围内的肽。另外，在一些实施方案中，水解蛋白可包含具有从约500道尔顿至约2,000道尔顿的摩尔质量分布范围的肽。
[0115]
在一些实施方案中，蛋白等价物源可包含肽组分、完整蛋白、水解蛋白(包括部分水解蛋白)，及其组合。在一些实施方案中，20%-80%的蛋白等价物源包含本文公开的肽组分。在一些实施方案中，40%-70%的蛋白等价物源包含本文公开的肽组分。在还有的其它实施方案中，50%-60%的蛋白等价物源包含肽组分。
[0116]
在一些实施方案中，20%-80%的蛋白等价物源包括完整蛋白、部分水解蛋白或其组合。在一些实施方案中，40%-70%的蛋白等价物源包括完整蛋白、部分水解蛋白或其组合。在更进一步的实施方案中，50%-60%的蛋白等价物源可包含完整蛋白、部分水解蛋白或其组合。
[0117]
在一些实施方案中，蛋白等价物源包括具有少于40%的水解度的部分水解蛋白。在还有的其它实施方案中，蛋白等价物源可包含具有水解度少于25%或少于15%的部分水解蛋白。
[0118]
在一些实施方案中，营养组合物包含约1 g-约7 g蛋白等价物源/100 kcal。在其它实施方案中，营养组合物包含约3.5 g和约4.5 g之间的蛋白等价物源/100 kcal。
[0119]
包含肽组分的蛋白等价物源可通过本领域熟知的任何方法加入或掺入营养组合物中。在一些实施方案中，肽组分可被加入到营养组合物中以补充营养组合物。例如，在一个实施方案中，肽组分可以加入到可市售获得的婴儿配方食品中。例如，enfalac、enfamil
®
、enfamil
®
早产儿配方食品(premature formula)、含铁enfamil
®
、enfamil
®ꢀ
lipil
®
、lactofree
®
、nutramigen
®
、pregestimil
®
和prosobee
®ꢀ
(可从mead johnson & company, evansville, in, u.s.a.购得)可用合适水平的肽组分补充，并用于本公开内容的实践中。
[0120]
本公开内容的营养组合物可以每日一个或多个剂量给予。本公开内容涵盖任何口服可接受的剂型。这样的剂型的实例包括，但不限于丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、液体剂、液体浓缩剂、散剂、酏剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖锭剂、珠粒、香囊剂及其组合。
[0121]
在一些实施方案中，包含本文描述的肽组分的蛋白等价物源可以加入到更完全的营养制品中。在这个实施方案中，营养组合物可含有蛋白质、脂肪和碳水化合物组分并可用来补充饮食或可以用作营养物的唯一来源。
[0122]
在一些实施方案中，营养组合物包含至少一种碳水化合物源。碳水化合物源可以是本领域使用的任何来源，例如，乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精、蔗糖、淀粉、大米糖浆固体等。碳水化合物组分在营养组合物中的量通常可在约5 g/100 kcal和约25 g/100 kcal之间变化。在一些实施方案中，碳水化合物的量在约6 g/100 kcal和约22 g/100 kcal之间。在其它实施方案中，碳水化合物的量在约12 g/100 kcal和约14 g/100 kcal之间。在一些实施方案中，玉米糖浆固体是优选的。然而，由于它们的易消化性，包含在营养组合物中的水解的、部分水解的和/或广泛水解的碳水化合物可以是合乎需要的。特别地，水解的碳水化合物不太可能含有变应原表位。
[0123]
适用于本文的碳水化合物物质的非限制性实例包括来源于玉米、木薯、大米或马铃薯的水解或完整的、天然或化学改性的淀粉(蜡质或非-蜡质形式)。合适的碳水化合物的非限制性实例包括特征为水解玉米淀粉、麦芽糊精、麦芽糖、玉米糖浆、右旋糖、玉米糖浆固体、葡萄糖和各种其它葡萄糖聚合物及其组合的各种水解淀粉。其它合适的碳水化合物的非限制性实例包括通常称为蔗糖、乳糖、果糖、高果糖玉米糖浆、不消化的寡糖(例如果寡糖)及其组合的那些。
[0124]
在一些实施方案中，营养组合物可以是不含蛋白质的并含有游离氨基酸作为蛋白等价物源的要素。在一些实施方案中，氨基酸可以是支链氨基酸。在某些其它实施方案中，小氨基酸肽可以作为营养组合物的蛋白质组分被包括在内。这样的小氨基酸肽可以是天然
存在的或合成的。游离氨基酸在营养组合物中的量可从约1 g/100 kcal至约5 g/100 kcal变化。
[0125]
营养组合物还可包含脂肪源。本公开内容的营养组合物的合适脂肪或脂质源可以是本领域已知的或使用的任何来源，包括但不限于，动物来源，例如，乳脂肪、黄油、黄油脂肪、蛋黄脂质；海洋来源，例如鱼油、海产油、单细胞油；蔬菜和植物油，例如玉米油、油菜油(canola oil)、向日葵油、大豆油、棕榈液油、椰子油、高油酸向日葵油、月见草油、菜籽油、橄榄油、亚麻仁(亚麻籽)油、棉籽油、高油酸红花油、棕榈硬脂酸甘油酯、棕榈仁油、麦胚芽油；中链甘油三酯油和乳液和脂肪酸的酯；及其任何组合。
[0126]
在一些实施方案中，营养组合物包含介于约1.3 g/100 kcal至约7.2 g/100 kca之间的脂肪源。在其它实施方案中，脂肪源可以从约2.5 g/100 kcal至约6.0 g/100 kcal的量存在。在还有的其它实施方案中，脂肪源可以从约3.0 g/100 kcal至约4.0 g/100 kcal的量存在于营养组合物中。
[0127]
本公开内容的营养组合物也可含有长链多不饱和脂肪酸(“lcpufa”)源。合适的lcpufa包括，但不限于dha、二十碳五烯酸(“epa”)、ara、亚油酸(18:2 n-6)、γ-亚麻酸(18:3 n-6)、在n-6途径中的二同型-γ-亚麻酸(20:3 n-6)、α-亚麻酸(18:3 n-3)、十八碳四烯酸(18:4 n-3)、二十碳四烯酸(20:4 n-3)、二十碳五烯酸(20:5 n-3)和二十二碳五烯酸(22:6 n-3)。
[0128]
营养组合物中lcpufa的量有利地为至少约5 mg/100 kcal，且可从约5 mg/100 kcal至约100 mg/100 kcal，更优选从约10 mg/100 kcal至约50 mg/100 kcal变化。
[0129]
lcpufa源包括乳制品像蛋和黄油脂肪；海产油，例如鳕鱼、鲱鱼、沙丁鱼、金枪鱼和许多其它鱼；某些动物脂肪、猪油、牛油和微生物油如真菌和藻类油，或来自任何其它强化或未强化的来源，从中可获得lcpufa并用于营养组合物。lcpufa可以是经本领域已知的、旨在富集这样的混合物中的lcpufa和lcpufa的衍生物或前体的分离技术获得的复杂混合物的部分。
[0130]
lcpufa可以以游离脂肪酸的酯；单-、二-和三-甘油酯；磷酸甘油酯(phosphoglyerides)，包括卵磷脂；和/或其混合物的形式在营养组合物中提供。此外，lcpufa可以以磷脂，特别是磷脂酰胆碱的形式在营养组合物中提供。
[0131]
在一个实施方案中，特别地，如果营养组合物是婴儿配方食品，营养组合物用dha和ara二者补充。在这个实施方案中，ara:dha的重量比可以是介于约1:3和约9:1之间。在一特别的实施方案中，ara:dha的重量比是从约1:2至约4:1。
[0132]
在一些实施方案中，dha有利地以至少约17 mg/100 kcal存在于营养组合物中，且可从约5 mg/100 kcal至约75 mg/100 kcal变化。在一些实施方案中，dha以约10 mg/100 kcal-约50 mg/100 kcal存在。
[0133]
营养组合物可采用本领域已知的标准技术，补充含有dha和/或ara的油。例如，可通过替换正常存在于组合物中的等量的油(例如高油酸向日葵油)，将dha和ara加入组合物中。作为另一个实例，通过替换正常存在于没有dha和ara的组合物中的等量的其余的总脂肪混合物，可将含有dha和ara的油加入组合物中。
[0134]
如果利用，dha和/或ara的来源可以是本领域已知的任何来源例如海产油、鱼油、单细胞油、蛋黄脂质和脑脂质。在一些实施方案中，dha和ara源自单细胞martek油、dhasco
®
和arasco
®
，或其变化。dha和ara可呈天然形式，条件是lcpufa源的其余部分不导致对婴儿有任何重大的有害作用。或者，dha和ara可以精制形式使用。
[0135]
在另一个实施方案中，dha和ara源是美国专利号5,374,567、5,550,156和5,397,591中教导的单细胞油，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。然而，本公开内容不仅仅限于这些油。
[0136]
而且，一些营养组合物的实施方案可模拟人类母乳的某些特征。然而，为满足一些受试者的特定营养需要，营养组合物可包含比人乳含有的更大量的一些营养成分。例如，营养组合物可包含比人类母乳含有的更大量的dha。营养组合物的dha的升高水平可以补偿现有营养dha的缺乏。
[0137]
在某些实施方案中，营养组合物也可含有一种或多种益生元(也称为益生元来源)。益生元可刺激消化的益生菌微生物的生长和/或活性，选择性地减少肠道中发现的病原体，和有利地影响肠道的短链脂肪酸分布。这样的益生元可以是天然-存在的、合成的，或通过生物体和/或植物的基因操作开发的，无论这种新的来源是现在已知的还是以后开发的。可用于本公开内容的益生元可包括寡糖、多糖，和含有果糖、木糖、大豆、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的其它益生元。
[0138]
更具体地说，可用于本公开内容的益生元可包括聚葡萄糖、聚葡萄糖粉、乳果糖、乳蔗糖、棉子糖、葡-寡糖、菊糖、果-寡糖、异麦芽-寡糖、大豆寡糖、乳蔗糖、木-寡糖、壳-寡糖、甘露-寡糖、阿拉伯-寡糖、唾液酸-寡糖、岩藻-寡糖、半乳-寡糖和龙胆-寡糖。在一些实施方案中，存在于营养组合物中的益生元的总量可为从约0.1 g/100 kcal至约1 g/100 kcal。在某些实施方案中，存在于营养组合物中的益生元的总量可为从约0.3 g/100 kcal至约0.7 g/100 kcal。此外，营养组合物可包含益生元组分，其包含聚葡萄糖(“pdx”)和/或半乳-寡糖(“gos”)。在一些实施方案中，益生元组分包含至少20% gos、pdx或其混合物。
[0139]
如果pdx用于益生元组合物中，在另一个实施方案中，pdx在营养组合物中的量可在从约0.1 g/100 kcal至约1 g/100 kcal的范围内。在另一个实施方案中，聚葡萄糖的量在从约0.2 g/100 kcal至约0.6 g/100 kcal的范围内。此外，在还有的其它实施方案中，pdx在营养组合物中的量可以是从约0.1 mg/100 kcal至约0.5 mg/100 kcal。
[0140]
在一个实施方案中，如果gos用于益生元组合物，gos在营养组合物中的量可以是从约0.1 g/100 kcal至约1 g/100 kcal。在另一个实施方案中，gos在营养组合物中的量可以是从约0.2 g/100 kcal至约0.5 g/100 kcal。在其它实施方案中，gos在营养组合物中的量可以是从约0.1 mg/100 kcal至约1.0 mg/100 kcal或从约0.1 mg/100 kcal至约0.5 mg/100 kcal。
[0141]
在营养组合物的特定实施方案中，pdx与gos组合给予。在这个实施方案中，pdx和gos可以介于约9:1和1:9之间的pdx:gos的比例给予。在另一个实施方案中，pdx:gos的比例可以在约5:1和1:5之间。在又一个实施方案中，pdx:gos的比例可以在约1:3和3:1之间。在一具体的实施方案中，pdx与gos的所述比例可以是约5:5。在另一个具体的实施方案中，pdx与gos的比例可以是约8:2。
[0142]
在特定的实施方案中，gos和pdx以至少约0.2 mg/100 kcal或约0.2 mg/100 kcal至约1.5 mg/100 kcal的总量补充到营养组合物中。在一些实施方案中，营养组合物可包含从约0.6至约0.8 mg/100 kcal的总量的gos和pdx。
[0143]
在一个实施方案中，营养组合物可含有一种或多种益生菌。本领域已知的任何益生菌可以是这个实施方案中可接受的。在一特别的实施方案中，益生菌可以选自任何乳杆菌类(lactobacillus species)、鼠李糖乳杆菌gg (lactobacillus rhamnosus gg) (atcc编号53103)、双歧杆菌类(bifidobacterium species)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum) bb536 (bl999, atcc: baa-999)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum) ah1206 (ncimb: 41382)、短双歧杆菌(bifidobacterium breve)ah1205 (ncimb: 41387)、婴儿双岐杆菌(bifidobacterium infantis)35624 (ncimb: 41003)和动物双歧杆菌产乳酸亚种bb-12 (bifidobacterium animalis subsp. lactis bb-12) (dsm no. 10140)或其任何组合。
[0144]
如果包括在组合物中，益生菌的量可以从约1 x 104至约1.5 x 10
10 cfu的益生菌/100 kcal变化，更优选从约1 x 106至约1 x 10
9 cfu的益生菌/100 kcal变化。在某些其它实施方案中，益生菌的量可从约1 x 10
7 cfu/100 kcal至约1 x 10
8 cfu/100 kcal变化。
[0145]
在一个实施方案中，益生菌可以是有活力的或无活力的。本文所用术语“有活力的”是指活的微生物。术语“无活力的”或“无活力的益生菌”意指无生命的益生菌微生物、其细胞组分和/或其代谢物。所述无活力的益生菌可以被热杀或以别的方式灭活，但它们保留有利地影响宿主健康的能力。可用于本公开内容的益生菌可以是天然-存在的、合成的或通过生物体的基因操作开发的，无论这种来源是现在已知的还是以后开发的。
[0146]
在一些实施方案中，本公开内容的营养组合物还可包含来自益生菌分批培养过程的后指数增长期的培养上清液(后文称为“培养上清液”)，而不是益生菌本身；在特定的实施方案中，益生菌是lgg。分批培养上清液(其也可称为“用尽的培养基”)可具有对抗病原体感染，包括阪崎肠杆菌(c. sakazakii)感染的保护作用。特别地，收获的培养上清液可防止阪崎肠杆菌对器官例如脑的入侵并减少与阪崎肠杆菌有关的死亡率。
[0147]
在一些实施方案中，营养组合物包含来自益生菌分批培养过程的后指数增长期的培养上清液，用于治疗或预防病原体感染。在某些实施方案中，益生菌是lgg，和病原体是阪崎肠杆菌。
[0148]
不希望受理论的束缚，相信培养上清液的活性可归因于如在lgg的分批培养的指数(或“log”)期的后阶段发现的释放到培养基中的组分(包括蛋白质材料，和可能包括(exo)多糖材料)的混合物。培养上清液的化学组成被认为是各种分子量的多种氨基酸、寡肽和多肽以及蛋白质的混合物。培养上清液可还包含多糖结构和/或核苷酸。在一些实施方案中，培养上清液属于完全的，即未分级培养上清液。此外，在一些实施方案中，培养上清液属于完全的，即未分级培养上清液。
[0149]
细菌的分批培养中公认的阶段是技术人员已知的。这些是“滞后(lag)”、“log
”ꢀ
(“对数的”或“指数的”)、“静止”和“死亡
”ꢀ
(或“对数下降”)期。在活菌存在的所有阶段中，细菌从培养基中代谢营养物，并将材料分泌(施加、释放)到培养基中。在生长阶段的给定的时间点分泌的材料的组成一般是不可预测的。
[0150]
在一些实施方案中，依据本公开内容和/或其实施方案的组合物可通过包括以下步骤的方法获得：(a) 使用分批方法使益生菌例如lgg在合适的培养基中培养；(b) 收获在培养步骤的后指数生长期的培养上清液，该期参照分批-培养过程的滞后期和静止期之间的后半段时间限定；(c) 任选地从上清液除去低分子量成分以保留5千道尔顿(kda)以上或
甚至在6kda以上分子量的成分；(d) 从培养上清液除去液体内容物以获得组合物。
[0151]
在本公开内容及其实施方案中，从后指数期收获分泌的材料。后指数期发生在中期指数期(其为指数期持续时间的中段时间，因此将后指数期称为滞后期和静止期之间的后半段时间)之后的时间。特别是，本文使用术语“后指数期”是指分批-培养过程的滞后期和静止期之间时间的后四分之一部分。在本公开内容的一些实施方案中，培养上清液的收获是在指数期持续时间的75%-85%的时间点，和最优选是在指数期中流逝的约5/6的时间。
[0152]
术语“培养(cultivation)”或“培养(culturing)”指微生物(在该情况下为lgg)在合适的培养基上或培养基中的繁殖。这样的培养基可以是多种多样的，并且特别是液体肉汤，如本领域所惯用的。一种优选的肉汤，例如，是如一般用于乳酸菌培养的mrs肉汤。mrs肉汤一般包含聚山梨醇酯、乙酸盐、镁和锰(已知它们用作乳酸菌的特殊生长因子)以及富含营养物的基质。典型的组合物包含(以g/升计的量)：来自酪蛋白的蛋白胨10.0；肉提取物8.0；酵母提取物4.0；d(+)-葡萄糖20.0；磷酸氢二钾2.0；tween
®ꢀ
80 1.0；柠檬酸三铵2.0；乙酸钠5.0；硫酸镁0.2；硫酸锰0.04。
[0153]
在一些实施方案中，本公开内容的培养上清液可以包括在为婴儿配方食品的营养组合物中。收获分泌的细菌产物带来一个问题，即培养基不能容易地剥脱不期望的组分。这尤其涉及相对脆弱的受试者的营养制品，例如婴儿配方食品或临床营养物。如果首先从培养上清液分离、纯化特定组分，然后应用于营养制品，则这个问题不会产生。然而，利用更完全的培养上清液是合乎需要的。这将适合提供更好反映益生菌(即lgg)的天然作用的组合物。然而，人们不能仅使用培养上清液本身作为要特别用于婴儿配方食品等的无活力益生菌材料的基础。
[0154]
在一些实施方案中，从lgg培养物收获的培养上清液不含有不需要的组分(因为可存在于培养基中)，或一般在营养组合物例如婴儿配方食品中为常规的组分。关于通常存在于mrs肉汤中的聚山梨醇酯，用于细菌培养的培养基可包括例如基于聚乙氧基化脱水山梨醇和油酸的乳化的非-离子型表面活性剂(通常作为tween
®
聚山梨醇酯，例如tween
®ꢀ
80获得)。虽然这些表面活性剂频繁地发现于食品，如冰淇淋中，且一般认为是安全的，但它们并不是在所有的司法管辖区内都被认为是可取的或甚至对用于相对脆弱的受试者的营养产品例如婴儿配方食品或临床营养物是可接受的。
[0155]
因此，在一些实施方案中，本公开内容利用其中前述聚山梨醇酯可以被避免的培养基。为此，本公开内容的培养基缺乏聚山梨醇酯例如tween 80。在本公开内容和/或其实施方案的优选实施方案中，培养基可包含选自油酸、亚麻仁油、橄榄油、油菜籽油、向日葵油及其混合物的油性成分。应该理解，如果聚山梨醇酯表面活性剂的存在基本或完全避免，则获得油性成分的完全利益。
[0156]
在一些实施方案中，培养上清液可具有中性ph，例如ph 5和ph 7之间的ph，优选ph 6。
[0157]
除了前述，还应该注意到，乳酸菌，包括lgg的分批培养是本领域技术人员可获得的普通常识。因此这些方法不需要在此进一步说明。本公开内容的培养上清液可通过任何已知的用于从细菌培养物分离培养上清液的技术收获。这样的技术是本领域熟知的并包括，例如，离心、过滤、沉降等。
[0158]
本公开内容的营养组合物可以本领域已知的任何形式提供，例如粉末、凝胶剂、混
悬剂、糊剂、固体剂、液体剂、液体浓缩物、可复溶奶粉代用品或即用制品。在某些实施方案中，营养组合物可包含营养补剂、儿童营养制品、婴儿配方食品、人乳强化剂、成长乳或设计用于婴儿或儿童受试者的任何其它的营养组合物。本公开内容的营养组合物包括例如可口服摄入的促进健康的物质，包括例如食品、饮料、片剂、胶囊剂和散剂。而且，可使本公开内容的营养组合物标准化至特定的含热量，可作为即用制品提供，或可以浓缩形式提供。在一些实施方案中，营养组合物呈粉末形式，其粒径范围为5 μm-1500 μm，更优选范围为10 μm-300 μm。
[0159]
如果营养组合物呈现即用制品的形式，营养组合物的渗透压可介于约100和约1100 mosm/kg水之间，更通常在约200至约700 mosm/kg水。
[0160]
在某些实施方案中，营养组合物是低变应原的。在其它实施方案中，营养组合物是犹太教规食品(kosher)和/或伊斯兰教规食品(halal)。在更进一步的实施方案中，营养组合物含有非-遗传修饰的成分。在一个实施方案中，营养制剂是无蔗糖的。营养组合物也可以是无乳糖的。在其它实施方案中，营养组合物不含有任何中-链甘油三酯油。在一些实施方案中，组合物中不存在角叉菜胶。在其它实施方案中，营养组合物不含所有胶质。
[0161]
本公开内容的营养组合物不限于包含本文特别列出的营养物的组合物。为了满足营养需要的目的和/或为了使受试者的营养状态最优化，任何营养物可以作为组合物的部分递送。
[0162]
此外，在一些实施方案中，营养组合物是营养完全的，含有为受试者营养物的唯一来源的合适类型和量的脂质、碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物质。事实上，营养组合物可任选地包含任何数目的蛋白质、肽、氨基酸、脂肪酸、益生菌和/或它们的代谢副产物、益生元、碳水化合物和任何其它营养物或可提供给受试者许多营养和生理学益处的其它化合物。此外，本公开内容的营养组合物可包含香料、增味剂、甜味剂、色素、维生素、矿物质、治疗成分、功能食物成分、食物成分、加工成分或其组合。
[0163]
本公开内容的营养组合物可被标准化为特别的卡路里含量，它可以作为即用制品提供，或可以作为浓缩的形式提供。
[0164]
在一些实施方案中，本公开内容的营养组合物是成长乳。成长乳为预期用于1岁以上年龄(通常1-3岁年龄、4-6岁年龄或1-6岁年龄)的儿童的强化型基于乳的饮料。它们不是医用食品，且无意作为代餐或补充剂以解决特定的营养缺乏。取而代之的是，设计成长乳以期用作不同膳食的补充，为儿童获得所有的必需维生素和矿物质、常量营养物加其它功能性膳食组分(例如具有声称的促进健康性质的非必需营养物)的持续的每日摄取量提供额外的保障。
[0165]
依据本公开内容的营养组合物的确切组成在市场之间可变化，这取决于地方法规和目标人群的膳食摄入量信息。在一些实施方案中，依据本公开内容的营养组合物包含乳蛋白源，例如全脂乳或脱脂乳，加上实现所需感官性能的添加的糖和甜味剂和添加的维生素和矿物质。脂肪组合物通常源自乳原材料。可设计总蛋白质的指标以与人乳、牛乳或下限值的相符。通常确定总的碳水化合物的指标以提供尽可能少的添加糖(例如蔗糖或果糖)以实现可接受的味道。通常，以符合地方性牛乳的营养基值的水平添加维生素a、钙和维生素d。此外，在一些实施方案中，可以提供膳食参考摄入量(dri)的约20%或每份每日值(dv)的约20%的水平，添加维生素和矿物质。而且，根据已确定的预期人群的营养需求、原料基值和
地区法规，营养值可在市场间变化。
[0166]
还可以足以供应受试者每日营养需要的量将一种或多种维生素和/或矿物质加入营养组合物中。本领域普通技术人员要了解，维生素和矿物质需要将根据例如儿童的年龄而改变。例如，与年龄介于1岁和13岁之间的儿童相比，婴儿可具有不同的维生素和矿物质需要。因此，实施方案无意将营养组合物限于具体的年龄组，而是提供一定范围的可接受的维生素和矿物质组分。
[0167]
在为儿童提供营养组合物的实施方案中，组合物可任选地包括但不限于下列维生素或其衍生物的一种或多种：维生素b
1 (硫胺、焦磷酸硫胺、tpp、三磷酸硫胺、ttp、盐酸硫胺、一硝酸硫胺)、维生素b
2 (核黄素、黄素单核苷酸、fmn、黄素腺嘌呤二核苷酸、fad、核黄素(lactoflavin)、核黄素(ovoflavin))、维生素b
3 (烟酸、尼克酸、尼克酰胺、烟酰胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、nad、烟酸单核苷酸、nicmn、吡啶-3-甲酸)、维生素b
3-前体色氨酸、维生素b
6 (吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、盐酸吡哆醇)、泛酸(泛酸盐、泛醇)、叶酸盐(叶酸、叶酸(folacin)、蝶酰谷氨酸)、维生素b
12 (钴胺素、甲基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素、氰钴胺、羟钴胺素、腺苷钴胺素)、生物素、维生素c (抗坏血酸)、维生素a (视黄醇、乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯、与其它长链脂肪酸所成的视黄酯、视黄醛、视黄酸、视黄醇酯)、维生素d (骨化醇、胆骨化醇、维生素d3、1,25,-二羟基维生素d)、维生素e (α-生育酚、α-生育酚乙酸酯、α-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚烟酸酯、α-生育酚)、维生素k (维生素k1、叶绿醌、萘醌、维生素k2、甲基萘醌-7、维生素k3、甲基萘醌-4、甲萘醌、甲基萘醌-8、甲基萘醌-8h、甲基萘醌-9、甲基萘醌-9h、甲基萘醌-10、甲基萘醌-11、甲基萘醌-12、甲基萘醌-13)、胆碱、肌醇、β-胡萝卜素及其任何组合。
[0168]
在提供儿童的营养制品(例如成长乳)的实施方案中，所述组合物可任选地包括，但不限于，以下矿物质或其衍生物的一种或多种：硼、钙、乙酸钙、葡糖酸钙、氯化钙、乳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、氯化物、铬、氯化铬、吡啶甲酸铬、铜、硫酸铜(copper sulfate)、葡糖酸铜、硫酸铜(cupric sulfate)、氟化物、铁、羰基铁、三价铁、富马酸亚铁、正磷酸铁、铁研制剂、多糖铁、碘化物、碘、镁、碳酸镁、氢氧化镁、氧化镁、硬脂酸镁、硫酸镁、锰、钼、磷、钾、磷酸钾、碘化钾、氯化钾、乙酸钾、硒、硫、钠、多库酯钠、氯化钠、硒酸钠、钼酸钠、锌、氧化锌、硫酸锌及其混合物。矿物质化合物的非限制性示例性衍生物包括任何矿物质化合物的盐、碱性盐、酯和螯合物。
[0169]
可按以下盐的形式将矿物质加入成长乳或其它儿童营养组合物中：例如磷酸钙、甘油磷酸钙、柠檬酸钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰和亚硒酸钠。可加入本领域已知的其它维生素和矿物质。
[0170]
在一个实施方案中，儿童的营养组合物可含有任何指定国家最大膳食推荐的每份约10和约50%之间，或一组国家平均膳食推荐的每份约10和约50%之间的维生素a、c和e、锌、铁、碘、硒和胆碱。在另一个实施方案中，儿童的营养组合物可供应任何指定国家最大膳食推荐的每份约10-30%，或一组国家平均膳食推荐的每份约10-30%的b-维生素。在又一个实施方案中，儿童营养制品中的维生素d、钙、镁、磷和钾水平可与存在于乳中的平均水平一致。在其它实施方案中，儿童营养组合物中的其它营养物的每份量可以任何指定国家最大膳食推荐的约20%，或一组国家平均膳食推荐的约20%存在。
[0171]
本公开内容的营养组合物可任选包括下列矫味剂的一种或多种，包括但不限于调
味提取物、挥发油、可可或巧克力调味料、花生酱调味料、饼干屑、香草或任何可市售获得的调味料。有用的矫味剂的实例包括但不限于纯茴香提取物、仿制香蕉提取物、仿制樱桃提取物、巧克力提取物、纯柠檬提取物、纯橙提取物、纯薄荷提取物、蜂蜜、仿制菠萝提取物、仿制朗姆酒提取物、仿制草莓提取物、葡萄和/或葡萄籽提取物、苹果提取物、越橘提取物或香草提取物；或挥发油，例如蜜蜂花油、月桂油、香柠檬油、雪松木油、樱桃油、肉桂油、丁子香油或薄荷油；花生酱、巧克力调味料、香草饼干屑、奶油糖果、太妃糖及其混合物。矫味剂的量可根据所用的矫味剂而大幅变化。可按本领域已知的，选择矫味剂的类型和量。
[0172]
本公开内容的营养组合物可任选地包含可为最终产品的稳定性而加入的一种或多种乳化剂。合适的乳化剂的实例包括，但不限于，卵磷脂(例如，来自蛋或大豆或任何其它植物和动物来源)、α乳白蛋白和/或甘油单酯和甘油二酯，及其混合物。其它乳化剂对技术人员而言是显而易见的，和合适的乳化剂的选择将部分取决于制剂和最终产品。
[0173]
本公开内容的营养组合物可任选地包含一种或多种也可加入以延长产品保质期的防腐剂。合适的防腐剂包括，但不限于，山梨酸钾、山梨酸钠、苯甲酸钾、苯甲酸钠、edta二钠钙，及其混合物。
[0174]
本公开内容的营养组合物可任选地包括一种或多种稳定剂。用于实施本公开内容的营养组合物的合适稳定剂包括但不限于阿拉伯树胶、茄替胶、刺梧桐树胶、西黄蓍胶、琼脂、红藻胶、瓜尔胶、吉兰糖胶、刺槐豆胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、微晶纤维素、cmc (羧甲基纤维素钠)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、datem (甘油单酯和甘油二酯的二乙酰基酒石酸酯)、葡聚糖、角叉菜胶、citrem及其混合物。
[0175]
本公开还提供通过提供包含本文描述的肽组分的营养组合物给目标受试者，减少自身免疫性疾病(包括糖尿病)的发病率的方法。该方法包括提供包含碳水化合物源、蛋白等价物源和脂肪源的营养组合物给目标受试者，其中蛋白等价物源包括包含seq id no 4、seq id no 13、seq id no 17、seq id no 21、seq id no 24、seq id no 30、seq id no 31、seq id no 32、seq id no 51、seq id no 57、seq id no 60和seq id no 63的肽组分。
[0176]
在一些实施方案中，给予目标受试者的营养组合物包含蛋白等价物源，其中20%-80%的蛋白等价物源包含本文描述的肽组分和20%-80%的蛋白等价物源包括完整蛋白、部分水解蛋白或其组合。
[0177]
在一些实施方案中，目标受试者可以是儿童受试者。此外，在一个实施方案中，提供给儿童受试者的营养组合物可以是婴儿配方食品。本文描述并加入到婴儿配方食品中的肽组分可以选自特定来源，且其浓度可以被调节以使健康益处最大化。在该方法的另一个实施方案中，提供给儿童受试者的包含所述肽组分的营养组合物是成长乳。
[0178]
实施例3-7说明在某些体外和体内模型中促炎细胞因子的减少。
[0179]
实施例3实施例3涉及在原代人树突细胞测定中，促炎细胞因子受广泛水解酪蛋白及其大于500 da的部分的抑制。特别地，被抑制的促炎细胞因子包括，白介素-12p70 (“il12p70”)、干扰素-γ(ifn
ý
)、白介素-8 (“il8”)、肿瘤坏死因子-α (“tnfα”)、白介素-6 (“il6”)和白介素-1β (“il1β”)。
[0180]
使分离的cd14+单核细胞悬浮于rpmi培养基中并补充10%的热-灭活的胎牛血清(“fbs”)、青霉素/链霉素、500 iu/ml重组白介素-4 (“rhil-4”)和800 iu/ml rhgm-csf，并
于37℃和5% co2下，在组织培养瓶中培养5天，以分化成树突细胞。
[0181]
在第5天，将细胞以20,000细胞/孔接种在96-孔u底培养板中的相同培养基中，接着以最终浓度0.007、0.02、0.08和0.2 % m/v加入包括广泛水解酪蛋白及其大于500 da的部分的水解产物样品。使用最终浓度1 μg/ml的地塞米松(“dex”)作为抑制细胞因子生产的阳性对照。所有样品以生物学一式两份测试。
[0182]
在第6天，用水解产物样品在无gm-csf和il-4的培养基中(rpmi + 10% fbs + pen/strep)进行细胞的更新。在加入水解产物后1小时，加入cd40l + 增强剂(alexis)至最终浓度0.5 μg/ml。
[0183]
然后于37℃和5% co2下培养细胞24小时，随后收集上清液并于-20℃储存，直至依据生产商的指示，使用meso scale discovery促炎细胞因子多重测定法量化细胞因子。
[0184]
如在图1-2中所示，经激活的原代人树突细胞的白介素-12p70 (il12p70)的促炎细胞因子分泌受广泛水解酪蛋白和大于500da部分的广泛酪蛋白水解产物的抑制。
[0185]
如在图3-4中所示，经激活的原代人树突细胞的干扰素-γ(ifn
ý
)的促炎细胞因子分泌受广泛水解酪蛋白和大于500 da部分的广泛酪蛋白水解产物的抑制。
[0186]
如在图5-6中所示，经激活的原代人树突细胞的白介素-8 (il8)的促炎细胞因子分泌受广泛水解酪蛋白和大于500 da部分的广泛酪蛋白水解产物的抑制。
[0187]
如在图7-8中所示，经激活的原代人树突细胞的肿瘤坏死因子-α (tnfα)的促炎细胞因子分泌受广泛水解酪蛋白和大于500 da部分的广泛酪蛋白水解产物的抑制。
[0188]
如在图9-10中所示，经激活的原代人树突细胞的白介素-6 (il6)的促炎细胞因子分泌受广泛水解酪蛋白和大于500 da的部分的广泛酪蛋白水解产物的抑制。
[0189]
如在图11-12中所示，经激活的原代人树突细胞的白介素-1β (il1β)的促炎细胞因子分泌受广泛水解酪蛋白和大于500 da部分的广泛酪蛋白水解产物的抑制。
[0190]
实施例4实施例4涉及在原代人巨噬细胞测定中，促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α (“tnfα”)受广泛水解酪蛋白水解产物及其大于500 da的部分的抑制。
[0191]
使分离的单核细胞悬浮于补充有10 %热-灭活的胎牛血清(fbs)和青霉素/链霉素的rpmi培养基中。将重组人m-csf加入至最终浓度100 ng/ml和并于37℃和5% co2下培养细胞5天。
[0192]
在第5天，将包含最终浓度0.007、0.02、0.08和0.2 % m/v的广泛水解酪蛋白及其大于500 da的部分的水解产物样品加入到含m-csf的rpmi培养基中。
[0193]
在第6天，除去包含水解产物样品的培养基并用水解产物样品在无m-csf的培养基中更新细胞。水解产物加入后1小时，加入lps (大肠杆菌(0111:84)至最终浓度10 ng/ml。然后于37℃和5% co2培养细胞24小时，随后收集上清液并于-20℃储存，直至依据生产商的指示，使用meso scale discovery tnfα测定法量化tnfα。
[0194]
如在图13-14中所示，激活的原代人巨噬细胞的肿瘤坏死因子-α (tnfα)的促炎细胞因子分泌受广泛水解酪蛋白和大于500 da的部分的广泛酪蛋白水解产物的抑制。
[0195]
实施例5实施例5涉及非-肥胖性糖尿病(nod)小鼠回肠中的促炎细胞因子信使rna表达的评价。
[0196]
简单地说，年龄匹配的雌性balb/c小鼠用作健康对照小鼠。如果没有其他规定的话，使balb/c小鼠保持常规食物，而nod小鼠在断奶开始时保持常规食物或者含有广泛水解酪蛋白(ch)的膳食制剂。
[0197]
从回肠样品分离rna通过rna分离试剂盒进行。合成cdna并通过定量实时pcr评价细胞因子表达。rna (分子/
µ
g)的绝对拷贝数通过运行标准品和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)作为装载对照品进行计算。
[0198]
如可在图15-18中所示的，与年龄匹配的健康(balb/c)对照小鼠比较，nod小鼠的回肠中il1、il6、il18和il17的促炎细胞因子分泌升高。这些升高的水平在广泛水解酪蛋白饮食喂养的nod小鼠中降低。
[0199]
实施例6实施例6涉及从非-肥胖性糖尿病(nod)小鼠的肠引流淋巴结分离的t细胞的促炎细胞因子分布的评价。
[0200]
简单地说，年龄匹配的雌性balb/c小鼠用作健康对照小鼠。如果没有其他规定的话，使balb/c小鼠保持常规食物，而nod小鼠在断奶开始时保持常规食物或者含有广泛水解酪蛋白(ch)的膳食制剂。
[0201]
从各组小鼠分离的肠系膜淋巴结细胞在完全培养基(含10% (vol./vol.) fbs、l-谷氨酰胺2 mmol/l、100 u/ml青霉素加链霉素的dmem)中用板结合的抗-cd3刺激。依据生产商的指示，48 h后收集上清液部分，用多重细胞因子珠阵列进行细胞因子分析。
[0202]
如在图19-21中所示，与年龄匹配的健康(balb/c)对照小鼠比较，从nod小鼠的肠道-引流淋巴结t细胞分泌的促炎细胞因子ifn
ý
、il4和il17升高。这些升高的水平在nod小鼠中通过广泛水解酪蛋白饮食而降低。
[0203]
实施例7实施例7涉及小鼠巨噬细胞细胞系中的细胞因子分泌分析。
[0204]
j774a.1小鼠巨噬细胞细胞系在补充有10% (v/v)胎牛血清、50 iu/ml青霉素和0.5mg/ml链霉素的rpmi-1640中维持。细胞于37℃和5% co2下培养。
[0205]
将包含广泛水解的酪蛋白及其大于500da部分的酪蛋白水解产物样品以100mg/ml的浓度加入到无菌水中并通过0.2
µ
m尼龙过滤器无菌过滤。作为另外的对照，还测试非-无菌过滤的广泛水解的酪蛋白。以1x106细胞/ml接种细胞并用最终浓度1 mg/ml的水解产物按一式三份培养1小时。然后细胞用100ng/ml lps处理，或者不经处理24小时，然后经离心收集上清液并于-20℃贮存。
[0206]
依据生产商的指示，对il-1β、il-6、il12p40和tnf-α使用单独的elisa测定法，评价上清液的各细胞因子浓度。样品按一式三份测试和显著性差别使用普通单因素anova分析，用graphpad prism 6软件计算。p《0.05被认为是显著的。
[0207]
如可从图22-25中所见到的，用lps刺激的来自小鼠巨噬细胞的促炎细胞因子分泌il-12p40和il-1β在细胞培养前，通过经无菌过滤或未经无菌过滤的广泛水解酪蛋白而减少(* p《0.05)。促炎细胞因子il6的分泌通过广泛水解酪蛋白而显著减少(* p《0.05)。促炎细胞因子tnfα的分泌通过大于500 da部分的广泛酪蛋白水解产物显著减少(* p《0.05)。结果也示于图26的表格式中。
[0208]
实施例8
实施例8说明广泛水解酪蛋白和大于500 da部分的广泛水解酪蛋白的胰岛素分泌的作用。
[0209]
材料和方法：胰岛素分泌(brin-bd11)细胞维持在含有11.1 mm葡萄糖、补充有10% (v/v)胎牛血清、2 mm谷氨酰胺、50 iu/ml青霉素、0.05 mg/ml链霉素的gibco
®ꢀ
rpmi-1640培养基中并于37℃，在含有5% co2和95%空气的潮湿气氛中培养。
[0210]
对于胰岛素分泌实验，brin bd 11细胞用1.1 mmol/l葡萄糖krebs培养40分钟。然后所有的孔用(1) 16.7 mmol/l葡萄糖krebs和10 mmol/l丙氨酸或(2) 16.7 mm葡萄糖和1 mg/ml广泛水解酪蛋白处理20分钟。在这种处理后，移去上清液并冷冻直至胰岛素分析。使用mercodia超灵敏大鼠胰岛素elisa试剂盒(mercodia ab, uppsala, sweden)测定分泌的胰岛素。蛋白质含量使用二辛可宁酸(bca)蛋白质测定法测定且浓度表示为如前所述的ng胰岛素/mg蛋白质(wallace等2012)。细胞活力通过mtt (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2h-四唑溴化物)测定法评价。
[0211]
加入最终浓度10ng/ml的经选择的具有已知对β-细胞功能和活力有害作用的细胞因子白介素1β (il-1β)、白介素-23 (il-23)、干扰素-γ (ifn-γ)。选择浓度以不诱导细胞毒作用，但引起温和的作用，以允许广泛水解的酪蛋白的潜在救援作用的研究。
[0212]
对于胰岛素分泌实验，10mm丙氨酸和16.7 mm葡萄糖用作阳性对照。诱导胰岛素分泌超过这种阳性对照品的样品被认为是一种有效的促分泌素。
[0213]
广泛水解的酪蛋白在暴露于il-1β时对胰岛素分泌的作用(n=4)描述于图27中。值是平均值
ꢀ±ꢀ
sem。glu表示16.7 mm葡萄糖，和glu/ala表示16.7 mm葡萄糖和10 mm丙氨酸(阳性对照)。进行方差分析，整体显著性为p 《 0.001。事后分析揭示与阳性对照的显著性差别(* p《0.05)。广泛水解酪蛋白证实比阳性对照更大程度地显著促进胰岛素分泌的能力。
[0214]
图28显示》500da部分的广泛水解酪蛋白的相应的作用。glu-il-1β表示未暴露于il-1β的葡萄糖对照，g/a-il-1β表示未暴露于il-1β的葡萄糖/丙氨酸对照，glu:葡萄糖表示暴露于il-1β的对照品，和g/a:葡萄糖/丙氨酸表示暴露于il-1β的对照品。
[0215]
图29描述水解产物样品在暴露于ifn-γ时对胰岛素分泌(n=4)的影响。值是平均值
ꢀ±ꢀ
sem。glu表示16.7 mm葡萄糖，和glu/ala表示16.7 mm葡萄糖和10 mm丙氨酸(阳性对照)。进行方差分析，整体显著性为p 《 0.001。事后分析揭示与阳性对照的显著性差别(** p《0.01)。广泛水解酪蛋白证实比阳性对照更大程度地显著促进胰岛素分泌的能力。
[0216]
图30描述广泛水解酪蛋白在暴露于il-23时对胰岛素分泌(n=4)的影响。值是平均值
ꢀ±ꢀ
sem。glu表示16.7 mm葡萄糖，和glu/ala表示16.7 mm葡萄糖和10 mm丙氨酸(阳性对照)。进行方差分析，整体显著性为p 《 0.001。事后分析揭示与阳性对照的显著性差别(** p《0.01)。广泛水解酪蛋白证实比阳性对照更大程度地显著促进胰岛素分泌的能力。
[0217]
图31右显示》500da部分的广泛水解的酪蛋白对于il-17的相应的作用。g/a-il-17:葡萄糖/丙氨酸表示未暴露于il-17的对照，glu:葡萄糖表示暴露于il-17的对照，和g/a:葡萄糖/丙氨酸表示暴露于il-17的对照。
[0218]
制剂实施例表3提供包含5种选自表1的肽和3种选自表2的肽的肽组分的实施例实施方案，其可包含本文描述的可掺入或加入到本文描述的营养组合物中的肽组分。
[0219]
表3. 实施例肽组分的营养分布用于肽组分的经选择的肽的实例seqidno5seqidno24seqidno33seqidno56seqidno64seqidno13seqidno24seqidno60表4提供包含5种选自表1的肽、3种选自表2的肽和至少10种选自表1的另外的肽的肽组分的实施例实施方案，其可包含本文描述的可掺入或加入到营养组合物中的肽组分。
[0220]
表4. 实施例肽组分的营养分布用于肽组分的经选择的肽的实例seqidno13seqidno24seqidno60seqidno5seqidno11seqidno22seqidno25seqidno33seqidno45seqidno46seqidno47seqidno48seqidno52seqidno34seqidno36seqidno61seqidno62seqidno64表5提供依据本公开内容的营养组合物的实施例实施方案，并描述包括在每100 kcal份中的各成分的量。
[0221]
表5. 实施例营养组合物的营养分布
本说明书引用的所有参考文献，包括而不限于所有的论文、出版物、专利、专利申请、简报、教科书、报告、底稿、小册子、书籍、互联网文章、杂志文章、期刊等，通过引用以其整体结合到本说明书中。本文的参考文献的阐述仅仅意在概括其作者所做出的断言，并非承认任何参考文献构成先有技术。申请人保留对所引用的参考文献的准确性和相关性提出异议的权利。
[0222]
虽然使用特定术语、装置和方法已描述了本公开内容的实施方案，但是这类描述只用于说明目的。所用词汇是描述词汇而不是限制词汇。要了解，在不偏离随附权利要求书
中阐述的本公开内容的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可进行变动和改变。另外，应了解，不同实施方案的方面可全部或部分互换。例如，在举例说明依据那些方法制备的市售无菌液体营养补剂的生产方法的同时，考虑了其它的应用。因此，随附权利要求书的精神和范围不应限于其中所含形式的描述。