一种水产加工下脚料资源化方法与流程

1.本发明属于水产加工技术领域，具体涉及一种水产加工下脚料资源化方法。


背景技术：

2.我国是渔业大国，同时，我国也是世界水产品来(进)料加工贸易的主要基地。在水产品加工过程中会产生20%-40%的废弃物(鱼头、内脏、鱼皮、鱼骨等)。这些下脚料中含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质等，如果不加以利用，将造成资源的极大浪费。因此，充分利用鱼类加工下脚料，不仅能提高鱼类产品的附加值，而且在减少加工业污染物排放、保护环境等方面均具有重要的现实意义。
3.下脚料的处理是水产加工企业普遍存在的问题。以沿海最为常见的鱼类和贝类加工企业为例，在生产过程中均会产生大量的下脚料，鱼类加工企业下脚料主要是鱼头、鱼排(刺)、鱼尾、鱼皮等，贝类加工企业下脚料主要是贝壳。以往很多企业将下脚料作为废料外售，售价较低，贝壳则多是白送，影响企业经济效益。下脚料的加工工艺水平较低，鱼类下脚料多用于加工鱼粉，贝壳一般用于加工饲料，产品附加值较低，造成资源的浪费。因此，许多研究人员根据各自下脚料产生特点，组织技术力量探索适合各自特点的下脚料再利用途径，实现废料资源化。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种能够将水产加工下脚料充分资源化的方法，得到的发酵产物具有较高的蛋白质含量、总氨基酸含量以及不饱和脂肪酸的含量、非蛋白氮含量。
5.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种水产加工下脚料资源化方法，包括以下步骤：（1）将水产加工下脚料切碎，加水进行水浴处理，灭菌，得到发酵基质；（2）在发酵基质添加有机溶液，并接种菌种培养液进行发酵培养；其中，菌种培养液分别为酪酸梭状芽孢梭菌培养液与施氏假单胞菌培养液。
6.本发明采用酪酸梭状芽孢梭菌联合施氏假单胞菌对水产品下脚料进行处理，两者可能具有共生作用或协同增强作用，将两者接种至水产品下脚料的发酵基质中进行发酵培养，提高了发酵基质中营养成分的含量，使水产品下脚料更好地进行资源利用；可能是酪酸梭状芽孢梭菌和施氏假单胞菌分泌产生的物质能够使水产品下脚料发酵充分，得到的产物中蛋白质含量、总氨基酸含量较高，同时提高了发酵产物中不饱和脂肪酸的含量以及非蛋白氮含量，将其作为饲料的成分，能够有效提高饲料的利用率。
7.进一步地，在本发明的一些实施例中，水产品为沙丁鱼、红鱼、鲽鱼、鲭鱼、鳕鱼中的至少一种。
8.进一步地，在本发明的一些实施例中，步骤（1）中，水浴处理过程中添加红薯皮、小麦粉、玉米皮；由于红薯皮、小麦粉、玉米皮中含有碳水化合物、蛋白质和一些生长素，在水产加工下脚料中添加红薯皮、小麦粉、玉米皮，并进行水浴处理，得到发酵基质，其可能为菌
种发酵提供较多营养物质，以使水产品加工下脚料得到更充分的资源化利用。
9.本发明还公开了酪酸梭状芽孢梭菌与施氏假单胞菌在水产加工下脚料资源化中的用途。
10.进一步地，在本发明的一些实施例中，酪酸梭状芽孢梭菌与施氏假单胞菌在提高水产加工下脚料中蛋白质和/或总氨基酸和/或不饱和脂肪酸和/或非蛋白氮含量中的用途进一步地，在本发明的一些实施例中，以水产加工下脚料重量计，红薯皮的添加量为1~3%、小麦粉的添加量为0.5~1.5%、玉米皮的添加量为1.5~2.5%。
11.进一步地，在本发明的一些实施例中，步骤（1）中，水浴处理温度为55~75℃，处理时间为25~45min。
12.进一步地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，有机溶液包括葡萄糖、β-羟基-β-甲基丁酸钙。
13.更进一步地，在本发明的一些实施例中，有机溶液中葡萄糖的含量为100~200g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为25~50g/l。
14.进一步地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，有机溶液的添加量为发酵基质重量的7.5~8.5%。
15.进一步地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，接种菌种培养液采用分段发酵方式；步骤为：先在发酵基质中接种酪酸梭状芽孢梭菌培养液进行发酵培养，再接种施氏假单胞菌培养液进行发酵培养。
16.更进一步地，在本发明的一些实施例中，酪酸梭状芽孢梭菌培养液的接种量为发酵基质重量的5.5~7.5%，施氏假单胞菌培养液的接种量为发酵基质重量的3.5~4.5%。
17.更进一步地，在本发明的一些实施例中，发酵用摇床转速为120~160r/min；所述酪酸梭状芽孢梭菌的发酵温度为35~38℃，发酵时间为5~8h；所述施氏假单胞菌的发酵温度为30~35℃，发酵时间为24~48h。
18.进一步地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，发酵培养后的发酵基质中蛋白质的含量高于78.5%；氨基酸总量高于65.8%。
19.本发明由于采用酪酸梭状芽孢梭菌联合施氏假单胞菌对水产品下脚料进行处理，两者可能具有共生作用或协同增强作用，将两者接种至水产品下脚料的发酵基质中进行发酵培养，提高了发酵基质中营养成分的含量，使水产品下脚料更好地进行资源利用；可能是酪酸梭状芽孢梭菌和施氏假单胞菌分泌产生的物质能够使水产品下脚料发酵充分，得到的产物中蛋白质含量、总氨基酸含量较高，同时提高了发酵产物中不饱和脂肪酸的含量以及非蛋白氮含量，将其作为饲料的成分，能够有效提高饲料的利用率。因此，本发明是一种能够将水产加工下脚料充分资源化的方法，得到的发酵产物具有较高的蛋白质含量、总氨基酸含量以及不饱和脂肪酸的含量、非蛋白氮含量。
附图说明
20.图1为蛋白质含量；图2为总氨基酸含量；图3为不饱和脂肪酸含量；图4为非蛋白氮含量。
具体实施方式
21.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
22.进一步地，在本发明的一些实施例中，一种水产加工下脚料资源化方法，包括以下步骤：（1）将水产加工下脚料切碎，采用打浆机打碎，加水并添加红薯皮、小麦粉、玉米皮，以水产加工下脚料重量计，其中水的添加量为30~50%、红薯皮的添加量为1~3%、小麦粉的添加量为0.5~1.5%、玉米皮的添加量为1.5~2.5%，然后在55~75℃下水浴处理25~45min，在115~125℃下灭菌20~30min，得到发酵基质；（2）在发酵基质中添加7.5~8.5%发酵基质重量的有机溶液，其中有机溶液中葡萄糖的含量为100~200g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为25~50g/l，然后采用分段发酵方式；其中摇床转速为120~160r/min，以发酵基质重量计，先在发酵基质中接种5.5~7.5%酪酸梭状芽孢梭菌培养液，在35~38℃下发酵5~8h，然后接种3.5~4.5%施氏假单胞菌培养液，在30~35℃下发酵24~48h，得到产物。
23.需要说明地是，酪酸梭状芽孢梭菌培养液的制备为：将酪酸梭状芽孢梭菌接入发酵培养基中，其中发酵培养基的成分为：0.5~1%葡萄糖、1.2~1.5%牛肉蛋白胨、0.45~0.75%酵母膏、0.2~0.4%nacl、0.25~0.45%k2hpo4·
3h2o、0.1~0.2%caco3，然后于35~38℃、120~140r/min条件下摇床培养6~8h，然后在5000~8000r/min下离心10~20min，用0.75~0.85%生理盐水冲洗并调整酪酸梭状芽孢梭菌的浓度为10~15g/l，得到酪酸梭状芽孢梭菌培养液。
24.同样地，需要说明地是，施氏假单胞菌培养液的制备为：将施氏假单胞菌接入发酵培养基中，其中发酵培养基的成分为：15~20g/l蛋白胨、8~12g/l蔗糖、1~2g/l k2hpo4·
3h2o、0.35~0.45g/l mgso4·
7h2o、0.05~0.075g/l 无水cacl2、8.2~8.5g/l橄榄油，然后于30~35℃、150~160r/min条件下摇床培养6~8h，然后在5000~8000r/min下离心10~20min，用0.75~0.85%生理盐水冲洗并调整酪酸梭状芽孢梭菌的浓度为8~12g/l，得到施氏假单胞菌培养液。
25.实施例1：一种水产加工下脚料资源化方法，包括以下步骤：（1）将红鱼下脚料切碎，采用打浆机打碎，加水并添加红薯皮、小麦粉、玉米皮，以沙丁鱼下脚料重量计，其中水的添加量为35%、红薯皮的添加量为2.5%、小麦粉的添加量为0.5%、玉米皮的添加量为2%，然后在60℃下水浴处理30min，在121℃下灭菌30min，得到发酵基质；（2）在发酵基质中添加7.5%发酵基质重量的有机溶液（在121℃下灭菌15min），其中有机溶液中葡萄糖的含量为150g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为25g/l，然后采用分段发酵方式；其中摇床转速为140r/min，以发酵基质重量计，先在发酵基质中接种5.5%酪酸梭状芽孢梭菌培养液，在37℃下发酵6h，然后接种4.5%施氏假单胞菌培养液，在32℃下发酵48h，得到产物。
26.具体地，本实施例中，酪酸梭状芽孢梭菌培养液的制备为：将酪酸梭状芽孢梭菌
（购自上海吉至生化科技有限公司）接入发酵培养基中，其中发酵培养基的成分为：0.5%葡萄糖、1.5%牛肉蛋白胨、0.45%酵母膏、0.25%nacl、0.35%k2hpo4·
3h2o、0.1%caco3，然后于37℃、120r/min条件下摇床培养6h，然后在8000r/min下离心10min，用0.75%生理盐水冲洗并调整酪酸梭状芽孢梭菌的浓度为13g/l，得到酪酸梭状芽孢梭菌培养液。
27.具体地，本实施例中，施氏假单胞菌培养液的制备为：将施氏假单胞菌（购自上海吉至生化科技有限公司）接入发酵培养基中，其中发酵培养基的成分为：15g/l蛋白胨、10g/l蔗糖、1.5g/l k2hpo4·
3h2o、0.35g/l mgso4·
7h2o、0.055g/l 无水cacl2、8.5g/l橄榄油，然后于32℃、140r/min条件下摇床培养6h，然后在8000r/min下离心10min，用0.75%生理盐水冲洗并调整施氏假单胞菌的浓度为10g/l，得到施氏假单胞菌培养液。
28.实施例2：一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：步骤（1）中，将红鱼下脚料切碎，采用打浆机打碎，加水并添加红薯皮、小麦粉、玉米皮，以沙丁鱼下脚料重量计，其中水的添加量为40%、红薯皮的添加量为1.5%、小麦粉的添加量为1.5%、玉米皮的添加量为2.5%，然后在60℃下水浴处理30min，在121℃下灭菌30min，得到发酵基质。
29.实施例3：一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：步骤（2）中，在发酵基质中添加7.5%发酵基质重量的有机溶液（在121℃下灭菌15min），其中有机溶液中葡萄糖的含量为200g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为45g/l，然后采用分段发酵方式；其中摇床转速为150r/min，以发酵基质重量计，先在发酵基质中接种5.5%酪酸梭状芽孢梭菌培养液，在37℃下发酵6h，然后接种4.5%施氏假单胞菌培养液，在32℃下发酵48h，得到产物。
30.实施例4：一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：步骤（2）中，以发酵基质重量计，先在发酵基质中接种7.5%酪酸梭状芽孢梭菌培养液，在37℃下发酵6h，然后接种3.5%施氏假单胞菌培养液，在32℃下发酵48h，得到产物。
31.实施例5：为了进一步优化水产加工下脚料资源化方法，使得到的产物具有含量更高的营养物质，采取的优选措施还包括：在步骤（2）中的有机溶液中添加荭草苷，其添加量为10~20g/l，其含有的有机成分与有机溶液中的葡萄糖和β-羟基-β-甲基丁酸钙起协同增强作用，为发酵基质中的菌种提供更好地生长所需营养物质，从而使水产品下脚料充分资源化，得到含量较多的营养物质。
32.一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：步骤（2）中，在发酵基质中添加7.5%发酵基质重量的有机溶液（在121℃下灭菌15min），其中有机溶液中葡萄糖的含量为150g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为25g/l、荭
草苷（购自上海博湖生物科技有限公司，纯度≥99%）的含量为15g/l。
33.实施例6：一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例5相同，与实施例5不同的是：步骤（2）中，有机溶液中荭草苷的含量为20g/l。
34.实施例7：一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例5相同，与实施例5不同的是：步骤（2）在发酵基质中添加7.5%发酵基质重量的有机溶液（在121℃下灭菌15min），其中有机溶液中葡萄糖的含量为150g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为25g/l、荭草苷（购自上海博湖生物科技有限公司，纯度≥99%）的含量为10g/l，然后在摇床转速为140r/min的条件下，以发酵基质重量计，在发酵基质中接种5.5%酪酸梭状芽孢梭菌培养液，在37℃下发酵6h，得到产物。
35.实施例8：一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例5相同，与实施例5不同的是：步骤（2）在发酵基质中添加7.5%发酵基质重量的有机溶液（在121℃下灭菌15min），其中有机溶液中葡萄糖的含量为150g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为25g/l、荭草苷（购自上海博湖生物科技有限公司，纯度≥99%）的含量为15g/l，然后在摇床转速为140r/min的条件下，以发酵基质重量计，在发酵基质中接种4.5%施氏假单胞菌培养液，在32℃下发酵48h，得到产物。
36.对比例1：一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：步骤（2）在发酵基质中添加7.5%发酵基质重量的有机溶液（在121℃下灭菌15min），其中有机溶液中葡萄糖的含量为150g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为25g/l，然后在摇床转速为140r/min的条件下，以发酵基质重量计，在发酵基质中接种5.5%酪酸梭状芽孢梭菌培养液，在37℃下发酵6h，得到产物。
37.对比例2：一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：步骤（2）在发酵基质中添加7.5%发酵基质重量的有机溶液（在121℃下灭菌15min），其中有机溶液中葡萄糖的含量为150g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为25g/l，然后在摇床转速为140r/min的条件下，以发酵基质重量计，在发酵基质中接种4.5%施氏假单胞菌培养液，在32℃下发酵48h，得到产物。
38.对比例3：一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：步骤（2）在发酵基质中添加7.5%发酵基质重量的有机溶液（在121℃下灭菌
15min），其中有机溶液中葡萄糖的含量为150g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为25g/l，然后在摇床转速为140r/min的条件下，以发酵基质重量计，在发酵基质中接种4.5%植物乳杆菌培养液，在32℃下发酵48h，得到产物。
39.具体地，本实施例中，植物乳杆菌培养液的制备为：将植物乳杆菌接入mrs肉汤培养基中，然后于30℃、160r/min条件下摇床培养6h，然后在8000r/min下离心10min，用0.75%生理盐水冲洗并调整植物乳杆菌的浓度为10g/l，得到植物乳杆菌培养液。
40.对比例4：一种水产加工下脚料资源化方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：将红鱼下脚料切碎，采用打浆机打碎，加水并添加红薯皮、小麦粉、玉米皮，以沙丁鱼下脚料重量计，其中水的添加量为35%、红薯皮的添加量为2.5%、小麦粉的添加量为0.5%、玉米皮的添加量为2%，然后在60℃下水浴处理30min，在121℃下灭菌30min，得到发酵基质；在发酵基质中添加7.5%发酵基质重量的有机溶液（在121℃下灭菌15min），其中有机溶液中葡萄糖的含量为150g/l、β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量为25g/l，进行培养48h，得到产物。
41.试验例1：1. 蛋白质含量测定按照gb/t 6432-1994凯氏定氮法进行测定。
42.图1为蛋白质含量。由图1可以看出，实施例1的蛋白含量高于78.5%，对比实施例1与实施例1-4，实施例1的蛋白含量明显高于对比例1-4，这说明在水产品下脚料发酵过程中同时采用酪酸梭状芽孢梭菌与施氏假单胞菌进行发酵培养，提高了下脚料加工后的蛋白含量，使其更好地资源化利用。对比实施例1与实施例5、实施例7与对比例1、实施例8与对比例2，实施例5的蛋白质含量高于实施例1，实施例7的蛋白质含量高于对比例1，实施例8的蛋白质含量高于对比例1，这说明在发酵基质的有机溶液中添加荭草苷，进一步提高了得到的水产品加工下脚料中的蛋白质含量。
43.2. 总氨基酸含量测定按照gb/t 18654.11-2008进行测定。
44.图2为总氨基酸含量。由图2可以看出，实施例1的总氨基酸含量高于65.8%，对比实施例1与实施例1-4，实施例1的总氨基酸含量明显高于对比例1-4，这说明在水产品下脚料发酵过程中同时采用酪酸梭状芽孢梭菌与施氏假单胞菌进行发酵培养，提高了下脚料加工后得到的产物中的总氨基酸含量。对比实施例1与实施例5、实施例7与对比例1、实施例8与对比例2，实施例5的总氨基酸含量高于实施例1，实施例7的总氨基酸含量高于对比例1，实施例8的总氨基酸含量高于对比例1，这说明在发酵基质的有机溶液中添加荭草苷，进一步提高了得到的水产品下脚料产物中的总氨基酸含量。
45.3. 不饱和脂肪酸含量测定称取20g样品置于300ml碘量瓶中，加入90ml氯仿-甲醇混合液(体积比为2:1)，放在50℃水浴锅中，水浴过程需不断摇匀混合液，使脂肪得到充分抽提，待溶液上层有大量油脂出现时结束抽提。将脂肪提取液置于500ml分液漏斗中，摇匀，静置待澄清后回收下层脂肪澄清液。将脂肪澄清液置于40℃旋转蒸发仪，浓缩至无液体蒸出为止，所得样品置于-20℃下待用。
46.称取上述得到的脂肪样品50mg于5ml离心管中，加入1ml 10% h2so
4-甲醇溶液，振荡后置于60℃水浴锅中30min，取出冷却至室温，加入1ml正己烷，振荡后静置分层；吸出上层油性液体置于干燥的试管中，加入少量的无水硫酸钠以除去其中的水分，经0.22μm有机滤膜过滤后收集，用于气相色谱(gc)分析，测定不饱和脂肪酸的相对含量。
47.图3为不饱和脂肪酸含量。由图3可以看出，实施例1的不饱和脂肪酸含量高于6.9%，对比实施例1与实施例1-4，实施例1的不饱和脂肪酸含量明显高于对比例1-4，这说明在水产品下脚料发酵过程中同时采用酪酸梭状芽孢梭菌与施氏假单胞菌进行发酵培养，提高了下脚料加工后得到的产物中的不饱和脂肪酸含量，其对预防心脑血管疾病以及增强免疫功能具有一定的功效。对比实施例1与实施例5、实施例7与对比例1、实施例8与对比例2，实施例5的不饱和脂肪酸含量高于实施例1，实施例7的不饱和脂肪酸含量稍高于对比例1，实施例8的不饱和脂肪酸含量稍高于对比例1，这说明在发酵基质的有机溶液中添加荭草苷，进一步提高了得到的水产品下脚料产物中的不饱和脂肪酸含量。
48.4. 非蛋白氮含量测定称取样品5g于锥形瓶中，加入50ml蒸馏水静置30min，然后加入10ml 10%三氯乙酸液静置30 min，滤纸过滤，残渣用适量的10%三氯乙酸溶液冲洗2次，采用凯氏定氮仪定氮。
49.图4为非蛋白氮含量。非蛋白氮(npn)在饲料加工领域是饲料中蛋白质以外的含氮化合物的总称；由图4可以看出，实施例1的非蛋白氮含量高于65.8%，对比实施例1与实施例1-4，实施例1的非蛋白氮含量明显高于对比例1-4，这说明在水产品下脚料发酵过程中同时采用酪酸梭状芽孢梭菌与施氏假单胞菌进行发酵培养，提高了下脚料加工后得到的产物中的非蛋白氮含量，将其作为饲料的成分，以有效提高饲料的利用率。对比实施例1与实施例5、实施例7与对比例1、实施例8与对比例2，实施例5的非蛋白氮含量高于实施例1，实施例7的非蛋白氮含量高于对比例1，实施例8的非蛋白氮含量高于对比例1，这说明在发酵基质的有机溶液中添加荭草苷，进一步提高了得到的水产品下脚料产物中的非蛋白氮含量。
50.本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
51.以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。