含有母乳低聚糖的乳蛋白部分水解低致敏性婴儿配方食品的制作方法

1.本发明是关于一种低致敏性婴儿配方食品，具体而言，是关于一种含有母乳低聚糖的乳蛋白部分水解低致敏性婴儿配方食品、其制备方法与相关应用，属于婴儿特医低敏食品技术领域。


背景技术：

2.近年来，食物过敏(food hypersensitivity/allergy，fh/fa)的发病率呈逐年上升趋势，成为研究关注热点。婴幼儿食物过敏中，牛奶和鸡蛋过敏最为常见。牛奶蛋白是普通婴幼儿配方最常用的蛋白质来源。cmpa是指机体对牛奶蛋白产生的由免疫机制介导的不良反应，可由ige介导、非ige介导或两者混合介导。从症状上来看，非ige介导的轻中度cmpa更倾向于出现胃肠道症状，最常见的是易激惹，也就是肠痉挛；另外还有呕吐、腹泻等；皮肤症状包括瘙痒、红斑，非特异性皮疹，明显特应性湿疹等。ige介导的cmpa皮肤症状更为突出，表现为急性瘙痒、红斑、荨麻疹、血管性水肿、急性弥漫性特应性湿疹；胃肠道症状包括呕吐、腹泻、腹痛/肠痉挛；呼吸道症状为急性鼻炎和/或结膜炎，而非ige介导的cmpa在1岁以内很少出现呼吸道症状。
3.目前对于乳蛋白过敏的孩子均采用回避治疗作为指南性意见。过程中会用到乳蛋白深度水解配方(ehf)做诊断和治疗，用乳蛋白部分水解配方(phf)和整蛋白配方做家庭再引入试验。但是，临床研究表明，长期食用深度水解配方，规避整蛋白饮食，会导致婴儿在一定程度上生长发育缓慢。而且，长时间使用水解配方对患儿家庭的经济负担加重。临床数据表明，乳蛋白过敏群体在做再引入实验时，比整蛋白配方具有更高比例的耐受性，从而更早的从深度水解配方转到部分水解配方。婴儿尽快通过乳蛋白深度水解配方改善症状，进而尽快从乳蛋白部分水解配方转到整蛋白配方，是有意义的。
4.另一方面，肠漏(leaky gut)，是指肠道通透性增加引起肠内有害物质如细菌和毒素穿过肠黏膜进入人体内其他组织、器官和血液循环的现象。肠道通透性与肠屏障功能有关，正常的肠道通透性取决于肠黏膜屏障的完整性。肠黏膜屏障是一个复杂的多层系统，包括物理屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障。肠道物理屏障作为抵御外界环境的第一道防线，在肠道屏障结构中占据中心地位，它是由肠道上皮细胞及细胞间的连接所组成。肠道细胞通透性主要分为跨上皮或跨细胞通透性与细胞旁通透性。细胞旁通透性依赖于通过细胞间的间隙空间运输。细胞间的连接包括紧密连接、黏附连接、桥粒等，其中最重要的是紧密连接，它位于肠道上皮细胞外膜顶端，为一狭长的带状结构，以阻断细胞间的间隙，从而可防止肠腔中的大分子物质如细菌和毒素等通过细胞间的间隙空间进入到血液循环中。细胞间的紧密连接结构具有高度的动态稳定性，其通透性决定着整个肠上皮细胞的屏障功能，受到胞内外信号的调节，可受到饮食、疾病、应激等的影响。肠道化学屏障主要是由黏液层所构成，黏液层可改变肠道微生物的位点，防止它们与宿主肠道组织细胞的直接接触。此外，肠道中产生的一些物质如胆汁胆盐、黏多糖、溶菌酶和糖蛋白等也可起到一定的化学屏障作用。肠道生物屏障是由肠道共生菌与宿主可形成一个具有动态稳定性的微生态系统，
肠道共生菌附着在宿主肠道表面黏膜层上，形成了一层由细菌构成的微生物屏障，它通过竞争性黏附等机制抑制病原菌的定植和繁殖。肠道免疫屏障中，肠道相关淋巴组织发挥重耍作用，其中淋巴细胞、巨噬细胞等在抵抗病菌侵袭的过程中发挥重耍作用，而在肠道免疫的效应分子中，分泌型免疫球蛋白a(siga)起着关键作用，它是在肠道固有层产生并经过肠道上皮细胞的加工后而分泌到肠腔中的，可阻断细菌、毒素和病毒等抗原在黏膜上的黏附，起到清除抗原的作用。这些屏障的交互作用使得肠道能够保持渗透性平衡，防止水和电解质的丢失及抗原和微生物进入体内，同时允许机体与环境之间进行分子交换和食物中营养物质的吸收。
5.肠道屏障功能异常引起的肠漏是许多健康问题的主要潜在原因，特别是肠道里菌群代谢产生的微生物毒素或是随食物进入的其他毒素物质，透过通透性增加的肠壁(“肠漏”)进入血液循环中，会通过刺激自身免疫系统引起多种自身免疫症状，或者毒害内脏器官，从而引起各种疾病。相比于母乳喂养的婴幼儿，未接受母乳喂养的婴幼儿肠道发育不健全，更容易出现肠漏现象。
6.目前市面上绝大多数婴儿特医乳蛋白水解配方奶粉中，益生元来源是低聚果糖或低聚半乳糖，或者不添加益生元，不能在根本上解决改善肠道上皮完整性，无法预防或减少肠漏，也无法促进过敏婴儿尽快耐受整蛋白配方。
7.因此，需要有改善婴儿肠道健康的解决方案。


技术实现要素：

8.本发明的一个目的在于提供一种可改善婴儿肠道健康的婴儿配方食品。
9.本发明的另一目的在于提供所述婴儿配方食品的制备方法。
10.本发明的另一目的在于提供所述婴儿配方食品的应用。
11.本案发明人在实验研究中发现，母乳低聚糖乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)单独或与其他母乳低聚糖组合，可用于预防或改善肠漏或肠道屏障损伤，有利于改善细胞间的肠道通透性与肠道屏障，改善细胞间的间隙，特别有利于维持婴儿肠道健康。从而，本发明中将包括乳糖-n-四糖的母乳低聚糖添加到婴儿配方食品中，提供了一种可预防肠漏以促进肠道健康的婴儿配方食品。
12.具体而言，一方面，本发明提供了一种婴儿配方食品，该婴儿配方食品中含有母乳低聚糖，所述母乳低聚糖包括乳糖-n-四糖，以婴儿配方食品的总质量计，乳糖-n-四糖在婴儿配方食品中的总含量为14.2-2273.0mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.02-3.0g/l；
13.并且，以婴儿配方食品的总质量计，所述婴儿配方食品中的总蛋白含量为9～20g/100g，所述的总蛋白包括水解乳蛋白，且水解度8-23，分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的80％以上。
14.乳糖-n-四糖，为乳糖与四糖形成的六糖结构，是以核心糖链为基础结构且不含岩藻糖基或唾液酸基的低聚糖的代表性物质，市售该物质通常为经微生物发酵法制备，且与人乳中发现的乳糖-n-四糖具有相同结构。
15.根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品中，乳糖-n-四糖在婴儿配方食品中的量为70.9-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-2.0g/l；优选为70.9-757.7mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-1.0g/l。
16.根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品中，所述母乳低聚糖还包括3
’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sialyllactose，3
’‑
sl或3-sl或3sl)，以婴儿配方食品的总质量计，3
’‑
唾液酸基乳糖在婴儿配方食品中的应用量为14.2-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.02-2.0g/l。优选地，3
’‑
唾液酸基乳糖在婴儿配方食品中的量为70.9-454.6mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-0.6g/l；更优选为70.9-227.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-0.3g/l。
[0017]3’‑
唾液酸基乳糖，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。现有技术中的3
’‑
唾液酸基乳糖商品，多是经微生物发酵法制备，与人乳中发现的3
’‑
唾液酸基乳糖具有相同结构。
[0018]
根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品，所述母乳低聚糖中，乳糖-n-四糖与3
’‑
唾液酸基乳糖的质量比为(3～5)：1。本发明的研究表明，这样的母乳低聚糖组合物，可更加显著地预防或改善肠漏或肠道屏障损伤，有利于改善细胞间的肠道通透性与肠道屏障，改善细胞间的间隙，特别有利于维持婴儿肠道健康。
[0019]
根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品中，所述母乳低聚糖还包括2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fucosyllactose，2
’‑
fl或2-fl或2fl)，以婴儿配方食品的总质量计，2
’‑
岩藻糖基乳糖在婴儿配方食品中的应用量为14.2-3182.2mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.02-4.2g/l。优选地，2
’‑
岩藻糖基乳糖在婴儿配方食品中的量为70.9-1818.4mg/100g粉，或以换算成奶液为0.1-2.4g/l；更优选地，为70.9-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-2.0g/l。
[0020]2’‑
岩藻糖基乳糖，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。市售该物质通常为经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0021]
根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品中，所述母乳低聚糖在婴儿配方食品中的总含量在4000mg/100g粉以下。
[0022]
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的婴儿配方食品，其中，所述母乳低聚糖由质量比为(1～4)：1的2
’‑
岩藻糖基乳糖与乳糖-n-四糖组成。这样的母乳低聚糖组合物可显著抑制或减少肠道支链脂肪酸的产生，特别是对于未接受母乳喂养的婴儿(配方粉喂养的婴儿)，能够显著地减少肠道内支链脂肪酸如异戊酸的产生，还可进一步减少远端结肠异丁酸的产生、降低肠道ph值、在肠道系统中作为益生元被肠道菌群利用并产气，和/或调控肠道系统中有益的短链脂肪酸的产生，所述有益的短链脂肪酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和/或乳酸。
[0023]
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的婴儿配方食品，其中，所述母乳低聚糖由质量比为(3～5)：(1.5～2.5)：1的2
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖与3
’‑
唾液酸基乳糖组成。本发明的研究表明，这样的母乳低聚糖组合物，可用于改善肠道免疫应答，具体而言可用于改善肠道单核细胞分化为巨噬细胞的免疫应答活性。在本发明的一些具体实施方案中，所述改善单核细胞分化为巨噬细胞的免疫应答活性，是指提升单核细胞分化为巨噬细胞后应对刺激时的免疫应答活性，或是预防单核细胞受训分化为巨噬细胞后免疫应答活性的下降。特别是在人体肠道中，菌群代谢紊乱会产生异常浓度的脂多糖等毒素，本发明的母乳低聚糖组合物可提升巨噬细胞应对这些毒素刺激的免疫应答活性。此外，单核细胞如果经过一些肠道毒素的刺激(即受训条件)，再分化为巨噬细胞后其免疫应答活性会降低，而
本发明的母乳低聚糖组合物可预防免疫应答活性的降低，甚至进一步提升免疫应答活性。根据本发明的一些具体实施方案，本发明中通过检测单核细胞分化成巨噬细胞后分泌tnf-α的量来表征免疫应答活性。实验证明，本发明的母乳低聚糖组合物，可提升单核细胞分化为巨噬细胞后应对刺激(例如脂多糖刺激)时分泌tnf-α的量。
[0024]
根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品，提供母乳低聚糖的原料采用市售食品级母乳低聚糖原料。
[0025]
根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品，是用于减少乳蛋白过敏对婴儿的高风险，因而要求其中总蛋白的主要成分(80％以上)为水解乳蛋白，且水解度8-23，分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的80％以上。
[0026]
本发明中的婴儿配方食品，其原料中用于提供总蛋白的原料可包括水解乳清蛋白粉、水解酪蛋白粉、水解牛奶蛋白粉、水解乳脂肪球膜蛋白中的一种或多种。
[0027]
根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品，以婴儿配方食品的总质量计，其中的脂肪含量为15～29g/100g；碳水化合物含量为50～58g/100g。
[0028]
本发明中的婴儿配方食品，其原料中用于提供脂肪的原料可包括含有乳脂的基础原料，还可包括植物油，所述植物油可以包括葵花籽油、玉米油、大豆油、低芥酸菜籽油、椰子油、棕榈油、核桃油中的一种或多种，优选包括葵花籽油、玉米油和大豆油，这些植物油的添加一方面为产品提供脂肪成分，另一方面提供亚油酸，同时还可提供α-亚麻酸。此外，提供脂肪的原料还可选择性包括为提供1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯而添加的原料opo结构脂。更优选地，基于1000重量份的所述婴儿配方食品，其原料包括：葵花籽油0～150重量份；玉米油0～40重量份；大豆油0～80重量份；opo结构脂0～140重量份。
[0029]
根据本发明的具体实施方案，本发明中的婴儿配方食品，其中碳水化合物一部分来自乳糖，一部分来自非乳糖来源物质，如预糊化淀粉、麦芽糊精、固体玉米糖浆、葡萄糖浆。即本发明中的婴儿配方食品，提供碳水化合物的原料除含有乳糖的基础原料外，还包括原料乳糖和预水解和糊化的淀粉类物质。优选地，基于1000重量份的所述配方粉，其原料包括：乳糖0～580重量份，非乳糖类物质0-580重量份。可在所述范围内调整乳糖的具体添加量。
[0030]
根据本发明的具体实施方案，本发明中的婴儿配方食品中还包括营养素、dha、ara、核苷酸、乳铁蛋白、益生菌中的一种或多种。优选地，基于1000重量份的所述婴儿配方食品，其原料包括：dha为8-15重量份，ara为14-28重量份；乳铁蛋白0～0.7重量份；包含钙粉、维生素和矿物质的复配营养素7～50重量份。
[0031]
根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品中，所述的复配营养素为符合国家标准的营养成分的组合，按照不同配方使用不同添加量。本发明的婴儿配方食品根据需要若添加营养素可选择性采用下述复配营养素成分中的任一或任意组合。优选地，所述复配营养素至少包括复配维生素、钙粉、矿物质营养包，各组分用量为：
[0032]
1)复配维生素，每克复配维生素中：
[0033]
牛磺酸：140～340mg
[0034]
维生素a：1700～5800μgre
[0035]
维生素d：25～70μg
[0036]
维生素b1：2000～6800μg
[0037]
维生素b2：3000～6900μg
[0038]
维生素b6：1700～4000μg
[0039]
维生素b
12
：8～20μg
[0040]
维生素k1：200～700μg
[0041]
维生素c：0～700mg
[0042]
维生素e：10～70mgα-te
[0043]
烟酰胺：10000～41550μg
[0044]
叶酸：350～920μg
[0045]
生物素：70～245μg
[0046]
泛酸：7100～25230μg
[0047]
肌醇：0-250mg
[0048]
左旋肉碱：0-60mg
[0049]
2)矿物质二，每克矿物质二中：
[0050]
钠：40～100mg
[0051]
钾：200～500mg
[0052]
2)矿物质三，每克矿物质二中：
[0053]
钙：200～500mg
[0054]
磷：75～300mg
[0055]
3)矿物质一，每克矿物质一中：
[0056]
铁：20～110mg
[0057]
锌：23～90mg
[0058]
铜：2000～4180μg
[0059]
碘：500～995μg
[0060]
硒：0～200μg
[0061]
锰：0～579μg
[0062]
4)复配氯化镁，每克氯化镁包中：
[0063]
镁：80～170mg
[0064]
5)氯化胆碱，每克氯化胆碱包中
[0065]
胆碱：300～950mg
[0066]
上述复配营养素的基料优选为乳糖、固体玉米糖浆或l-抗坏血酸钠。基于1000重量份的所述一种含有母乳低聚糖的乳蛋白部分水解配方粉，复配营养素的添加量为7～52重量份，其中，复配维生素营养包优选为2～4重量份，矿物质二营养包优选为2～16重量份，矿物质三营养包优选为0.5～20重量份，矿物质一营养包优选为0.5～3重量份，氯化镁0～3.5重量份，氯化胆碱0～4.5重量份，各营养包的基料优选为乳糖或l-抗坏血酸钠。
[0067]
为保证营养素的利用效率，本发明选择稳定的营养素剂型。
[0068]
上述复配营养素的各组分含量，是指为强化所述营养素物质的添加量，不包括奶粉其他原料中的营养素组分含量，
[0069]
根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品中，所述益生菌为双歧杆菌。优选地，基于1000重量份的所述婴儿配方食品，双歧杆菌的添加量为0.1～0.2重量份；再优
选为0.18～0.2重量份。更优选地，每重量份双歧杆菌粉含双歧杆菌为3
×
10
10
cfu以上。
[0070]
根据本发明的一些优选的具体实施方案，本发明的一种婴儿配方食品，其原料包括：
[0071][0072]
可以理解，本发明的婴儿配方食品中，各原料的具体用量应在满足对配方奶粉产品指标要求的前提下进行调整而确定。本发明的婴儿配方食品中，未详细说明或列出的产品性能指标均应按照婴儿配方食品(婴儿配方粉)的国家标准及相关标准和法规的规定执行。
[0073]
本发明的婴儿配方食品中，各原料均可商购获得，各原料的选用应符合相关标准要求。此外，本发明中采用“复配”、“组合”的表述仅是为方便描述，并不意味着各组分必须先混合在一起再应用。各原料均应在满足相关法规前提下添加使用。
[0074]
另一方面，本发明还提供了一种制备所述婴儿配方食品的方法，该方法包括：
[0075]
采用湿法或干法生产工艺，将母乳低聚糖与婴儿配方食品中的其他原料混合，制备所述婴儿配方食品。其制备的工艺流程主要包括：配料、均质、浓缩杀菌、喷雾干燥、干混得到成品。本发明中，母乳低聚糖可以在配料时一起混料，也可以在后混料或干混过程中添加。具体方法条件可参照配方奶粉生产领域的常规方法进行。
[0076]
根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿配方食品的制备方法包括：
[0077]
1)粉类添加：各种粉类原料按配方经计量后通过风送系统统一加入到配粉罐中贮存。
[0078]
2)真空吸粉：配粉罐中的各种粉类原料通过真空系统吸入真空混料罐中。
[0079]
3)溶化配油：按配方要求将配方中规定的油脂放入化油间，化油间的温度应保持在50～90℃，待油溶化后，按配方比例要求通过油泵和流量计打入混合油贮罐中。
[0080]
4)混合油料贮存：混合油在油贮存罐中保温贮存，温度40～50℃，贮存时间小于12小时防止脂肪氧化。
[0081]
5)称重：按配方要求将混合油经油泵打入混料罐。
[0082]
6)营养素溶解添加：钙粉、矿物质、维生素等分别添加，用100～200kg纯净水，分别溶解后，打入湿混缸，每打完一种用100kg纯净水冲洗添加罐和管线。
[0083]
7)母乳低聚糖溶解添加：将母乳低聚糖原料用步骤6中部分混合料液溶解后，添加到混料罐中，得到含母乳低聚糖的混合料液。
[0084]
8)过滤：经混合的料液经滤网过滤，去除原料中可能带入的物理杂质。
[0085]
9)均质：混合后的料液通过均质机进行均质，均质一级压力为105
±
5bar，一级压力为32
±
3bar，将脂肪球进行机械处理，把它们分散成均匀一致的脂肪球。
[0086]
10)冷却与贮存：均质后的料液进入板式换热器进行冷却：冷却至20℃以下，暂存在预存缸中，6小时内进入下道工序，搅拌器按设定需求开启。
[0087]
11)浓缩杀菌：生产时使用双效浓缩，杀菌温度≥83℃，杀菌时间25秒。出料浓度均为48％～52％干物质。
[0088]
12)浓奶贮存、预热过滤、喷雾干燥：浓缩后的奶暂存在浓奶平衡罐。经刮板预热器预热到60～70℃，预热后物料经1mm孔径的过滤器过滤后，用高压泵打入干燥塔喷雾干燥，细粉按要求在塔顶或流化床附聚。进风温度：165～180℃，排风温度75-90℃，高压泵压力160～210bar，塔负压-4～-2mbar。
[0089]
13)流化床干燥冷却：从干燥塔出来的粉再经流化床(一级)二次干燥后，经流化床(二级)冷却到25～30℃，得到奶粉主料。
[0090]
14)分装：配方中含有dha、ara、乳铁蛋白、双歧杆菌时，按照配方要求，将dha、ara、乳铁蛋白、双歧杆菌称量封袋分装。
[0091]
15)干混：将称量好的dha、ara、乳铁蛋白、双歧杆菌与奶粉主料在干混机内混均。
[0092]
16)筛粉：通过振动筛，使奶粉的颗粒度均匀，粉渣报废处理。
[0093]
17)出粉：用经过消毒的集粉箱接粉，并由出粉间运至上粉间。
[0094]
18)上粉：将奶粉按包装要求倒入大小包装机上的储粉罐中。
[0095]
19)包装：800克自动包装机充氮包装。充氮时含氧量低于1％。900克铁听自动充氮包装含氧量低于5％。
[0096]
20)装箱：将已包装的小袋装入纸箱中同时加入粉勺，用封箱机封口。
[0097]
21)成品检验：对包装完后的产品按检验计划进行抽样检验。
[0098]
22)入库贮存：经检验合格的产品入库贮存，要求在常温下贮存，湿度≤65％。
[0099]
另一方面，本发明还提供了所述婴儿配方食品作为改善婴儿肠道健康、增加产品耐受性的食品中的应用。具体而言，所述改善婴儿肠道健康包括预防肠漏和/或改善免疫应答。所述预防肠漏包括改善细胞间的肠道通透性和/或肠道屏障，和/或减少细胞间的间隙。所述改善免疫应答包括改善单核细胞分化为巨噬细胞的免疫应答活性，和/或所述改善免疫应答包括用于提升单核细胞分化为巨噬细胞后应对刺激时分泌tnf-α的量。
[0100]
本发明的婴儿配方食品，具有减少乳蛋白过敏高风险和胃肠功能不适婴儿肠漏等功效，并可促进肠道微环境健康，增加产品耐受性，同时可缩短婴儿对水解配方的使用时间，尽快使用整蛋白配方。
附图说明
[0101]
图1显示本发明的母乳低聚糖对fd4的分子转运情况的影响。
[0102]
图2显示本发明中的母乳低聚糖对单核细胞分化巨噬细胞的免疫应答的效果。
具体实施方式
[0103]
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0104]
除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。实施例中各母乳低聚糖原料来自供应商jennewein，母乳低聚糖的含量检测采用所属领域中的常规方法。实施例中未详细注明的操作条件，按照所属领域的常规操作进行。
[0105]
实施例1
[0106]
本实施例的婴儿配方食品的原料组成如下(生产1000千克)：
[0107]
水解乳清蛋白粉(水解度8)80％120千克，乳糖115千克，固体玉米糖浆435千克，高油酸葵花籽油120千克，玉米油40千克，大豆油50千克，opo结构脂80千克，母乳低聚糖(lnt)0.16千克，复配营养素38千克，dha9千克，ara 18千克，双歧杆菌0.1千克，核苷酸0.65千克。
[0108]
其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0千克、氯化胆碱营养包约2.0千克、钙粉营养包约12千克、钠钾营养素包16千克、矿物质营养包约2千克、氯化镁营养包约3.0千克，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
[0109]
本实施例的婴儿配方食品的制备工艺如下：
[0110]
1)粉类添加：各种粉类原料按配方经计量后通过风送系统统一加入到配粉罐中贮存。
[0111]
2)真空吸粉：配粉罐中的各种粉类原料通过真空系统吸入真空混料罐中。
[0112]
3)溶化配油：按配方要求将配方中规定的油脂放入化油间，化油间的温度应保持在50～90℃，待油溶化后，按配方比例要求通过油泵和流量计打入混合油贮罐中。
[0113]
4)混合油料贮存：混合油在油贮存罐中保温贮存，温度40～50℃，贮存时间小于12小时防止脂肪氧化。
[0114]
5)称重：按配方要求将混合油经油泵打入混料罐。
[0115]
6)营养素溶解添加：钙粉、矿物质、维生素等分别添加，用100～200千克纯净水，分别溶解后，打入湿混缸，每打完一种用100千克纯净水冲洗添加罐和管线。
[0116]
7)母乳低聚糖溶解添加：将母乳低聚糖用步骤6中部分混合料液溶解后，添加到混料罐中，得到含母乳低聚糖的混合料液。
[0117]
8)过滤：经混合的料液经滤网过滤，去除原料中可能带入的物理杂质。
[0118]
9)均质：混合后的料液通过均质机进行均质，均质一级压力为105
±
5bar，一级压力为32
±
3bar，将脂肪球进行机械处理，把它们分散成均匀一致的脂肪球。
[0119]
10)冷却与贮存：均质后的料液进入板式换热器进行冷却：冷却至20℃以下，暂存在预存缸中，6小时内进入下道工序，搅拌器按设定需求开启。
[0120]
11)浓缩杀菌：生产时使用双效浓缩，杀菌温度≥83℃，杀菌时间25秒。出料浓度均
为48％～52％干物质。
[0121]
12)浓奶贮存、预热过滤、喷雾干燥：浓缩后的奶暂存在浓奶平衡罐。经刮板预热器预热到60～70℃，预热后物料经1mm孔径的过滤器过滤后，用高压泵打入干燥塔喷雾干燥，细粉按要求在塔顶或流化床附聚。进风温度：165～180℃，排风温度75-90℃，高压泵压力160～210bar，塔负压-4～-2mbar。
[0122]
13)流化床干燥冷却：从干燥塔出来的粉再经流化床(一级)二次干燥后，经流化床(二级)冷却到25～30℃，得到奶粉主料。
[0123]
14)分装：制粉车间人员按照配方要求，将dha、ara、双歧杆菌称量封袋分装。
[0124]
15)干混：将称量好的dha、ara、双歧杆菌与奶粉主料在干混机内混均。
[0125]
16)筛粉：通过振动筛，使奶粉的颗粒度均匀，粉渣报废处理。
[0126]
17)出粉：用经过消毒的集粉箱接粉，并由出粉间运至上粉间。
[0127]
18)上粉：将奶粉按包装要求倒入大小包装机上的储粉罐中。
[0128]
19)包装：800克自动包装机充氮包装。充氮时含氧量低于1％。900克铁听自动充氮包装含氧量低于5％。
[0129]
20)装箱：将已包装的小袋装入纸箱中同时加入粉勺，用封箱机封口。
[0130]
21)成品检验：对包装完后的产品按检验计划进行抽样检验。
[0131]
22)入库贮存：经检验合格的产品入库贮存，要求在常温下贮存，湿度≤65％。
[0132]
本产品中，蛋白质含量9.6g/100g(分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的85％以上)，脂肪含量29g/100g，碳水化合物含量55g/100g，乳糖-n-四糖的含量为15mg/100g粉。
[0133]
实施例2
[0134]
本实施例的婴儿配方食品的原料组成如下(生产1000千克)：
[0135]
水解乳清蛋白粉(水解度15)80％200千克，乳糖500千克，高油酸葵花籽油90千克，玉米油10千克，大豆油50千克，opo结构脂110千克，母乳低聚糖(lnt)2.8千克，复配营养素38千克，dha3千克，ara 6千克，双歧杆菌0.1千克，核苷酸0.65千克。
[0136]
其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0千克、氯化胆碱营养包约2.0千克、钙粉营养包约12千克、钠钾营养素包16千克、矿物质营养包约2千克、氯化镁营养包约3.0千克，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
[0137]
产品制备工艺如实施例1。
[0138]
本产品中，蛋白质含量16g/100g(分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的85％以上)，脂肪含量26g/100g，碳水化合物含量50g/100g，乳糖-n-四糖的含量为270mg/100g粉。
[0139]
实施例3
[0140]
本实施例的婴儿配方食品的原料组成如下(生产1000千克)：
[0141]
水解乳清蛋白粉(水解度15)80％160千克，固体玉米糖浆530千克，高油酸葵花籽油60千克，玉米油20千克，大豆油70千克，opo结构脂140千克，母乳低聚糖(lnt)7.8千克，复配营养素38千克，dha9千克，ara 18千克，双歧杆菌0.2千克，核苷酸0.65千克。
[0142]
其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0千克、氯化胆碱营养包约2.0千克、钙粉营养包约12千克、钠钾营养素包16千克、矿物质营养包约2千克、氯化镁营养包约3.0千
克，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
[0143]
产品制备工艺如实施例1。
[0144]
本产品中，蛋白质含量11.2g/100g(分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的85％以上)，脂肪含量29g/100g，碳水化合物含量53g/100g，乳糖-n-四糖含量约为750mg/100g粉。
[0145]
实施例4
[0146]
本实施例的婴儿配方食品的原料组成如下(生产1000千克)：
[0147]
水解乳清蛋白粉(水解度8)80％120千克，乳糖115千克，固体玉米糖浆435千克，高油酸葵花籽油120千克，玉米油40千克，大豆油50千克，opo结构脂80千克，母乳低聚糖(lnt+3
’‑
sl)组合物0.12千克，复配营养素38千克，dha9千克，ara 18千克，双歧杆菌0.1千克，核苷酸0.65千克。
[0148]
其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0千克、氯化胆碱营养包约2.0千克、钙粉营养包约12千克、钠钾营养素包16千克、矿物质营养包约2千克、氯化镁营养包约3.0千克，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
[0149]
产品制备工艺如实施例1。
[0150]
本产品中，蛋白质含量9.6g/100g(分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的85％以上)，脂肪含量29g/100g，碳水化合物含量55g/100g，乳糖-n-四糖的含量为85.7mg/100g粉；3
’‑
唾液酸基乳糖的含量为21.4mg/100g粉；
[0151]
实施例5
[0152]
本实施例的婴儿配方食品的原料组成如下(生产1000千克)：
[0153]
水解乳清蛋白粉(水解度15)80％200千克，乳糖500千克，高油酸葵花籽油90千克，玉米油10千克，大豆油50千克，opo结构脂110千克，母乳低聚糖(lnt+3
’‑
sl)组合物8.7千克，复配营养素38千克，dha3千克，ara 6千克，双歧杆菌0.1千克，核苷酸0.65千克。
[0154]
其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0千克、氯化胆碱营养包约2.0千克、钙粉营养包约12千克、钠钾营养素包16千克、矿物质营养包约2千克、氯化镁营养包约3.0千克，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
[0155]
产品制备工艺如实施例1。
[0156]
本产品中，蛋白质含量16g/100g(分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的85％以上)，脂肪含量26g/100g，碳水化合物含量50g/100g，乳糖-n-四糖的含量约为680mg/100g粉；3
’‑
唾液酸基乳糖含量为170mg/100g粉；
[0157]
实施例6
[0158]
本实施例的婴儿配方食品的原料组成如下(生产1000千克)：
[0159]
水解乳清蛋白粉(水解度15)80％155千克，固体玉米糖浆530千克，高油酸葵花籽油60千克，玉米油20千克，大豆油70千克，opo结构脂140千克，母乳低聚糖(lnt+3
’‑
sl)组合物9.6千克，复配营养素38千克，dha9千克，ara 18千克，双歧杆菌0.2千克，核苷酸0.65千克。
[0160]
其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0千克、氯化胆碱营养包约2.0千克、钙粉营养包约12千克、钠钾营养素包16千克、矿物质营养包约2千克、氯化镁营养包约3.0千克，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
[0161]
产品制备工艺如实施例1。
[0162]
本产品中，蛋白质含量11.2g/100g(分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的85％以上)，脂肪含量29g/100g，碳水化合物含量53g/100g，乳糖-n-四糖含量约为751mg/100g粉；3’唾液酸基乳糖含量约为188mg/100g粉。
[0163]
实施例7
[0164]
本实施例的婴儿配方食品的原料组成如下(生产1000千克)：
[0165]
水解乳清蛋白粉(水解度8)80％120千克，乳糖115千克，固体玉米糖浆435千克，高油酸葵花籽油120千克，玉米油40千克，大豆油50千克，opo结构脂80千克，母乳低聚糖(2
’‑
fl+lnt+3
’‑
sl)组合物千克1.1千克，复配营养素38千克，dha9千克，ara 18千克，双歧杆菌0.1千克，核苷酸0.65千克。
[0166]
其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0千克、氯化胆碱营养包约2.0千克、钙粉营养包约12千克、钠钾营养素包16千克、矿物质营养包约2千克、氯化镁营养包约3.0千克，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
[0167]
产品制备工艺如实施例1。
[0168]
本产品中，蛋白质含量9.6g/100g(分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的85％以上)，脂肪含量29g/100g，碳水化合物含量55g/100g。产品中2
’‑
岩藻糖基乳糖含量约为57mg/100g，产品中乳糖-n-四糖的量约为28.5mg/100g，产品中3
’‑
唾液酸基乳糖的量约为14.2mg/100g。
[0169]
实施例8
[0170]
本实施例的婴儿配方食品的原料组成如下(生产1000千克)：
[0171]
水解乳清蛋白粉(水解度15)80％200千克，乳糖500千克，高油酸葵花籽油90千克，玉米油10千克，大豆油50千克，opo结构脂110千克，母乳低聚糖(2
’‑
fl+lnt+3
’‑
sl)组合物20千克，复配营养素38千克，dha3千克，ara 6千克，双歧杆菌0.1千克，核苷酸0.65千克。
[0172]
其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0千克、氯化胆碱营养包约2.0千克、钙粉营养包约12千克、钠钾营养素包16千克、矿物质营养包约2千克、氯化镁营养包约3.0千克，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
[0173]
产品制备工艺如实施例1。
[0174]
本产品中，蛋白质含量16g/100g(分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的85％以上)，脂肪含量26g/100g，碳水化合物含量50g/100g。产品中2
’‑
岩藻糖基乳糖约1113mg/100g，乳糖-n-四糖的量约为557mg/100g，3
’‑
唾液酸基乳糖的量约为278mg/100g。
[0175]
实施例9
[0176]
本实施例的婴儿配方食品的原料组成如下(生产1000千克)：
[0177]
水解乳清蛋白粉(水解度15)80％150千克，固体玉米糖浆530千克，高油酸葵花籽油60千克，玉米油20千克，大豆油70千克，opo结构脂140千克，母乳低聚糖(2
’‑
fl+lnt+3
’‑
sl)组合物28千克，，复配营养素38千克，dha9千克，ara18千克，双歧杆菌0.2千克，核苷酸0.65千克。
[0178]
其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0千克、氯化胆碱营养包约2.0千克、钙粉营养包约12千克、钠钾营养素包16千克、矿物质营养包约2千克、氯化镁营养包约3.0千克，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
[0179]
产品制备工艺如实施例1。
[0180]
本产品中，蛋白质含量11.2g/100g(分子量分布3000dal以下的蛋白占总蛋白的85％以上)，脂肪含量29g/100g，碳水化合物含量53g/100g。产品中2
’‑
岩藻糖基乳糖约1515mg/100g，乳糖-n-四糖的量约为757mg/100g，3
’‑
唾液酸基乳糖的量约为378mg/100g。
[0181]
母乳低聚糖改善肠漏功效实验
[0182]
1.改善细胞旁通透性实验
[0183]
本实验考察了不同种类hmo及其组合物在正常情况下对于小肠上皮功能的影响，通过肠道屏障和fd4(异硫氰酸荧光素葡聚糖；fitc标记葡聚糖)分子转运情况等指标体现改善细胞间的肠道通透性与肠道屏障(改善细胞旁通透性)。
[0184]
正常(非侵袭)情况
[0185]
将caco-2细胞在transwell体系的dmem培养基中培养21天以模拟小肠上皮细胞层。加入受试hmo或hmo组合物(在培养体系中的终浓度0.1mg/ml)，并培养24小时，然后加入fd4分子(最终表面浓度为250ug/ml)并继续培养。在继续培养到24小时时测定fd4分子转运情况，测定三次作为生物学重复。另设置不加任何受试hmo或hmo组合物的dmem培养基对照组。
[0186]
数据分析
[0187]
用two-tailed paired t-test(双尾配对t检验)对fd4的分子转运情况渗透率数据进行统计分析。两个组若有显著性差异，且p《0.05，则用星号*表示。两个星号**表示p《0.01。三个星号***表示p《0.001。
[0188]
实验结果
[0189]
结果请参见图1所示。本发明的lnt组别、质量比4：1的lnt与3
’‑
sl的hmo组合物显著降低了fd4分子转运(p《0.05)，显示本发明的lnt、lnt与3
’‑
sl的组合物可改善细胞间的肠道通透性(降低细胞间的肠道通透性)，提升肠道屏障作用，分析其原因主要是缩小了细胞间的间隙，提升了细胞间的紧密性，从而对于细胞旁转运通路的密封性增加，可有效减少肠漏。
[0190]
2.tcda侵袭实验
[0191]
本实验考察了不同比例hmo组合物(lnt与3
’‑
sl的质量比分别为2：1、4：1)在受微生物毒素艰难梭状芽胞杆菌毒素a(clostridium difficile toxin a，tcda)侵袭情况下对于小肠上皮功能的影响，通过tcda侵袭实验测定跨膜电阻teer指标体现。
[0192]
将caco-2细胞在transwell体系的dmem培养基中培养21天以模拟小肠上皮细胞层。加入受试hmo组合物(在培养体系中的终浓度0.1mg/ml)，并培养24小时，然后加入tcda(最终表面浓度为200ug/ml)并继续培养。在加入tcda继续培养的0、3小时测定跨膜电阻teer，测定三次作为生物学重复。另设置不加任何受试hmo或hmo组合物的dmem培养基对照组。
[0193]
数据分析
[0194]
对于跨膜电阻teer的数据，采用tukey’s multiple comparison test进行统计分析。两个组若有显著性差异，且p《0.05，则用星号*表示。两个星号**表示p《0.01。三个星号***表示p《0.001。
[0195]
实验结果
[0196]
表1显示了加入毒素a培养三小时后测定跨膜电阻，lnt与3
’‑
sl组合物对于跨膜电阻的影响。
[0197]
表1
[0198][0199]
由肠道屏障测试三小时的结果可见，在加入毒素a培养的情况下，质量比2：1的lnt+3
’‑
sl组合物相比对照显著降低了跨膜电阻，而本发明的质量比4：1的lnt+3
’‑
sl组合物未显著降低跨膜电阻，体现了本发明的特定比例范围的lnt与3
’‑
sl的组合物之间协同效应的趋势。
[0200]
母乳低聚糖组合物改善单核细胞分化为巨噬细胞免疫应答功效实验
[0201]
通过驯化与激活单核细胞考察了hmo对单核细胞分化为巨噬细胞免疫应答活性的影响。
[0202]
单核细胞的采集与培养
[0203]
具体血样采集与培养的实验条件如下所述：
[0204]
使用生产商推荐的操作方法，采用quadromacs系统和cd14 microbeads磁珠分选试剂盒(miltenyi biotec，莱顿，荷兰)，从多名健康的成年捐献者血样中分离获得单核细胞。采集血样前，获得了捐献者的书面同意。
[0205]
单核细胞的培养：在添加了10％胎牛血清(fbs，hyclone，埃因霍温，荷兰)，1％mem非必需氨基酸(gibco布雷斯维克，荷兰)，1％丙酮酸钠(lonza，布雷达，荷兰)，1％青霉素/链霉素(sigma，圣路易斯，密苏里州，美国)的rpmi 1640
–
glutamax培养基(gibco，布雷斯维克，荷兰)中，以1
×
106细胞/2ml/孔的浓度在24孔板培养。
[0206]
免疫应答活性考察实验包括了预处理单核细胞以及6天后进行的免疫应答挑战测试。具体操作如下：
[0207]
单核细胞从液氮中恢复，在恢复1天后，分别进行以下组别的实验，且本实验中所有hmo原料均来自于jennewein：
[0208]
hmo组：将不同hmo受试样品(不同hmo单体或不同比例的hmo组合物，其中hmo组合物中各单体比例以质量比计)添加到单核细胞培养基中，添加终浓度为0.1mg/ml，与单核细胞共同培养24小时，之后更换新鲜的培养基(冲洗掉受试hmo)继续培养6天，以使单核细胞分化为巨噬细胞。然后，添加脂多糖(脂多糖在培养基中的终浓度10ng/ml)刺激24小时，再从上清液中测定分泌的tnf-α情况。
[0209]
对照组1(脂多糖组)：采用脂多糖对单核细胞进行预处理，即，将脂多糖添加到单核细胞培养基中，添加终浓度为0.1mg/ml，与单核细胞共同培养24小时，之后更换新鲜的培养基(冲洗掉lps)继续培养6天，以使单核细胞分化为巨噬细胞。然后，添加脂多糖(脂多糖在培养基中的终浓度10ng/ml)刺激24小时，再从上清液中测定分泌的tnf-α情况。该对照组
前期脂多糖预处理的目的是使单核细胞对后续的再度刺激做出响应的能力下降，预期脂多糖可降低单核细胞对于第二次脂多糖刺激的响应情况。
[0210]
对照组2(培养基组)：单核细胞在未添加任何受试物质的培养基中培养7天，以使单核细胞分化为巨噬细胞。然后，添加脂多糖(脂多糖在培养基中的终浓度10ng/ml)刺激24小时，再从上清液中测定分泌的tnf-α情况。实验方法参考了bekkering等人(2016，clinical and vaccine immunology)报道的方法，使用elisa(酶联免疫吸附测定)和tnf-α专用试剂盒测定tnf-α，且elisa测定的波长为450nm，使用plate reader spark装置进行吸收值测定，spark的序列号为2009003477，sparkcontrol应用的序列号为v3.1。
[0211]
数据分析
[0212]
用one way anova对巨噬细胞免疫应答数据进行统计分析。两个组若有显著性差异，且p《0.05，则用星号*表示。两个星号**表示p《0.01。三个星号***表示p《0.001。
[0213]
实验结果
[0214]
实验结果请参见图2。质量比为4：2：1的2
’‑
fl：lnt：3
’‑
sl母乳低聚糖组合物的组别，在单核细胞受训模型中，显示出了对于tnf-α分泌量的显著提升作用(p《0.05)。
[0215]
此外，如实验预期，脂多糖组别的测试结果显示，脂多糖降低了免疫响应，可见相比不含任何受试物质的培养基组，脂多糖组降低效果很显著。