杰米拉类芽孢杆菌W51在草莓和桃采后病害防治中的应用及应用方法

杰米拉类芽孢杆菌w51在草莓和桃采后病害防治中的应用及应用方法
1.技术领域
2.本发明涉及水果采后病害防治领域，特别涉及一种杰米拉类芽孢杆菌w51在草莓和桃采后病害防治中的应用及应用方法。


背景技术：

3.草莓属于浆果类水果，果实鲜红柔嫩，美味可口，具有很高的营养和药用价值，同时将其深受消费者喜爱。但是草莓质软多汁，成熟期短，不易储藏，采后极易受到机械损伤和病原菌侵染，在我国每年都会造成严重的经济损失。桃原产地为中国，每年产量极大，因其色香味俱佳，在我国受欢迎度极高。而夏季是桃的主要成熟期，同时桃皮薄，汁水丰厚，因此贮藏运输极不方便，易受果实损失率很高。灰霉（botrytis cinerea）和葡枝根霉（rhizopus stolonifer）分别是引起草莓和桃采后腐烂的主要病原菌。
4.目前主要的防治手段有化学防治和生物防治两种。化学杀菌剂见效快，抑制力强，在我国被广泛使用。但是连续多年使用容易使得病原菌产生抗药性，降低防效，同时由于化学杀菌剂多为人工合成，使用在果实上会造成残留，极易污染环境并对人体健康造成威胁。生物防治作为有效的生防手段，生防菌不仅具有良好的拮抗病原菌能力，同时对环境友好，生物防治的开发利用能够有效降低化学杀菌剂对人体和环境的危害，因此生物防治具有广阔的发展前景。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种杰米拉类芽孢杆菌w51在草莓和桃采后病害防治中的应用及应用方法，杰米拉类芽孢杆菌w51具有广泛的抑菌能力，能够拮抗引起草莓采后腐烂的病原菌灰霉以及引起桃采后腐烂的病原菌葡枝根霉，对防治草莓和桃采后病害有良好的效果，能被开发利用在果实采后病害防治领域；该菌株易培养，生长繁殖快。
6.技术方案：本发明提供了一种杰米拉类芽孢杆菌（paenibacillus jamilae）w51在防治灰霉所致草莓采后病害和葡枝根霉所致桃采后病害中的应用。
7.进一步地，所述杰米拉类芽孢杆菌w51于2018年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no.16639。
8.本发明还提供了一种杰米拉类芽孢杆菌（paenibacillus jamilae）w51在防治灰霉所致草莓采后病害和葡枝根霉所致桃采后病害中的应用方法，其特征在于：使用活菌总浓度为1
×
10
8 cfu/ml的杰米拉类芽孢杆菌w51的菌悬液对草莓进行浸泡处理，对桃进行接种处理。
9.进一步地，所述杰米拉类芽孢杆菌w51的菌悬液的制备方法如下：将杰米拉类芽孢杆菌w51划线培养于lb平板培养基上；在30~35
º
c下培养22~26h后转接于lb培养液中，28~32
ꢀº
c、180~200 rpm培养22~26h；将所得菌液在4000~6000 rpm室温离心10 min，所得菌体用无菌水悬浮。
10.进一步地，所述浸泡处理的具体方法如下：对草莓进行消毒处理，表面消毒晾干后，在菌悬液中浸泡3 min；自然晾干放入盒中，每盒放150~200 g草莓，置于20 ℃，湿度为80~90%的恒温恒湿培养箱中贮藏8天。
11.进一步地，所述接种处理的具体方法如下：在桃赤道部刺孔，向孔中定量注入所述杰米拉类芽孢杆菌w51的菌悬液，24 h之后再定量注入葡枝根霉病原菌孢子悬浮液，自然风干后，将接种的果实装入聚乙烯袋中，置于20
±
1 ℃贮藏3天。
12.进一步地，所述葡枝根霉病原菌孢子悬浮液的制备方法如下：葡枝根霉在pda平板上生长48h后，向平板加入10 ml无菌水清洗孢子，用血球计数板计数，并将葡枝根霉孢子液浓度稀释至1
×
10
5 cfu ml-1
，现配现用。
13.优选地，在所述桃赤道部等距离刺孔2个。
14.优选地，使用微量移液器向孔中定量注入所述杰米拉类芽孢杆菌w51的菌悬液。
15.优选地，所述草莓的品种为“红颜”，成熟度为八成熟，形状大小一致，无损伤病害；所述桃的品种为“突围”，形状大小一致，无损伤病害。
16.有益效果：杰米拉类芽孢杆菌w51能够拮抗引起草莓采后腐烂的主要病原菌灰霉和引起桃采后腐烂的主要病原菌葡枝根霉。分别对草莓进行浸泡菌悬液处理，对桃进行接种注射菌悬液处理，通过对处理后的草莓测定腐烂率、腐烂指数、失重率，检测相关品质指标：硬度、vc、可滴定酸和可溶性固形物的含量。对处理过的桃测定发病率、病斑直径，检测硬度、vc、可滴定酸和可溶性固形物含量。结果显示w51菌悬液处理对草莓和桃采后病害防治效果显著优于对照组。由此可见，w51能够有效防治草莓、桃的采后腐烂，维持果实的相关品质指标。本发明对果实采后病害防治效果好，同时操作简单，所使用的杰米拉类芽孢杆菌w51尚未在果实采后病害防治领域有所应用，具有创新性。
附图说明
17.图1为w51对灰霉和葡枝根霉的抑制效果柱状图。
具体实施方式
18.下面结合附图对本发明进行详细的介绍。
19.实施方式1：杰米拉类芽孢杆菌w51对灰霉和葡枝根霉的抑制效果测定灰霉和葡枝根霉分别是引起草莓和桃采后腐烂的主要病原菌。采用牛津杯法，在pda平板中间接种直径为5 mm的灰霉菌饼，将牛津杯对称放置在距菌饼2 cm处，其中一个牛津杯注入50 μl菌悬液，另一个牛津杯中注入等量无菌水作为对照，当菌丝生长接触到注入无菌水的牛津杯时，计算抑制率。抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径
×
100。对葡枝根霉的抑制效果测定方法同上。
20.结果如图1所示，杰米拉类芽孢杆菌w51对灰霉的抑制率为84.60%，对葡枝根霉的
抑制率为75.00%。因此可以看出杰米拉类芽孢杆菌w51对灰霉和葡枝根霉有明显的抑制作用。
21.实施方式2：杰米拉类芽孢杆菌w51对草莓采后病害防治效果验证和相关品质指标测定对草莓采用浸泡的方式处理。分组排列经过挑选的草莓并对其进行消毒处理，表面消毒晾干后，分成两组，分别为对照组和处理组。对照组将筛选出的草莓浸泡无菌水3 min，处理组则将筛选出的草莓在1
×
10
8 cfu ml-1 w51菌悬液中浸泡3 min。两组在室温下自然晾干后放入盒中，每盒放150~200 g草莓，置于20 ℃，湿度为80~90%的恒温恒湿培养箱中贮藏8天，观察草莓腐烂情况，并分别在第0、2、4、6、8天取样。
22.每隔两天记录草莓的腐败变质情况，测定样品的腐烂率、腐烂指数，腐烂率=腐烂果数/总果数。腐烂指数根据草莓腐烂程度分级：0级，无草莓腐烂；1级，低于10%的腐烂面积；2级，10%~30%的腐烂面积；3级，30~50%的腐烂面积；4级，大于50%的腐烂面积，腐烂指数（%）=（∑腐烂级数
×
该腐烂级数下样品果数）/（样品中最高腐烂级数
×
样品总果数）；使用gy-3指针式水果硬度计测量草莓果实的硬度，使用电子天平称重草莓果实的重量测定草莓的失重率；采用便携式糖度计测定草莓的可溶性固形物含量；以酸碱滴定法测定可滴定酸含量；使用紫外吸收法测定草莓的vc的含量。实验重复三次。
23.结果：在草莓贮藏的第8天，对照组的草莓完全腐烂，腐烂指数则为78.64%，而经过处理的草莓腐烂率则为75.00%，腐烂指数仅为59.82%，结果表明经过w51处理过的草莓腐烂率和腐烂指数均要优于用清水处理的对照组，结果见下表1。
24.表1 w51对草莓腐烂率、腐烂指数的影响注：组间比较使用单因素方差分析，不同小写字母表示差异显著（p《0.05）。
25.从下表2可以看出，在草莓贮藏的第8天，处理组的草莓硬度是对照组的0.50倍，对照组草莓完全没有硬度，已经全部腐烂。同时处理组的失重率相对于对照组低了3.40%，可溶性固形物含量、vc含量、可滴定酸含量分别高于对照组1.80%、1.47 mg kg-1
、0.08%，因此可以看出，经过w51菌悬液处理的草莓各项品质指标均要优于对照组。
26.表2 w51对草莓相关品质指标的影响
注：组间比较使用单因素方差分析，不同小写字母表示差异显著（p《0.05）。
27.实施方式3：杰米拉类芽孢杆菌w51对桃采后病害防治效果验证和相关品质指标测定对桃采用接种注射的方式。在桃赤道部用灭菌的枪头等距离刺孔2个，处理组向每孔中定量注入1
×
10
8 cfu ml-1 w51菌悬液，对照组接种等量的无菌水。24 h之后再定量注入葡枝根霉病原菌孢子悬浮液（配制方法：在培养2 d的葡枝根霉板子中加入10 ml的无菌水洗下孢子，用血球计数板计数，用无菌水将葡枝根霉孢子悬浮液浓度稀释至1
×
10
5 cfu/ml，现配现用），在室温下自然风干后。每天每组取3个桃进行指标测定。将接种的果实装入聚乙烯袋中，每组处理30个桃，重复三次，置于20
±
1 ℃贮藏3天。
28.每天统计桃的发病率和病斑直径。发病率（%）=（桃发病总数/桃总数）
×
100。相关品质指标：硬度、失重率、可溶性固形物、可滴定酸测定方法同上，vc含量的测定采用2，6-二氯靛酚滴定法进行测定。实验重复三次。
29.结果：见下表3，在贮藏期间，经过w51菌悬液处理过的桃的病斑直径均显著小于对照组，在贮藏第3天，处理组的病斑直径仅为1.20 cm，而对照组的病斑直径则为6.46 cm，处理组的病斑直径显著低于对照组。在桃贮藏第1天和第2天，经过w51处理的桃的发病率为31.46%和60.68%，相比于对照组的发病率，效果显著。因此可知，w51接种处理过的桃均显著优于对照组。
30.表3 w51处理对桃发病率、病斑直径的影响
注：组间比较使用单因素方差分析，不同小写字母表示差异显著（p《0.05）。
31.桃相关品质指标测定结果如下表4所示，在贮藏的第3天，经过w51处理过的桃的硬度高于对照组0.30 n，可溶性固形物含量比对照组高0.76%，vc含量比对照组高2.36 mg kg-1
，含量显著高于对照组，是对照组的1.60倍，同时可溶性酸含量也高于对照组。由此可以看出，w51能够显著维持桃相关品质指标，延长货架期。
32.表4 w51处理对桃相关品质指标的影响注：组间比较使用单因素方差分析，不同小写字母表示差异显著（p《0.05）上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。