变异型谷氨酰胺转氨酶的制作方法

本发明涉及：耐热性和/或ph稳定性较高的变异型谷氨酰胺转氨酶(变异型tg)及其的利用。

背景技术：

1、谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase；tg)作为催化蛋白质的交联的酶而广为人知，用于食品的物理性质的改善。

2、此外，已知提高了耐热性的变异型tg、提高了ph稳定性的变异型tg等修饰了功能的各种变异型tg。作为提高了耐热性的变异型tg，例如已知专利文献1～4所述的变异型tg。作为提高了ph稳定性的变异型tg，例如已知专利文献4所述的变异型tg。

3、此外，专利文献1中，作为使tg脱酰胺酶化的变异，公开了g275a等变异。

4、现有技术文献

5、专利文献

6、专利文献1：wo2019/107288a1

7、专利文献2：wo2010/101256a1

8、专利文献3：wo2008/099898a1

9、专利文献4：wo2019/094301a1

技术实现思路

1、发明所解决的技术问题

2、本发明的技术问题在于：提供耐热性和/或ph稳定性较高的变异型tg。

3、解决问题的技术手段

4、本发明人等发现了提高tg的耐热性和/或ph稳定性的变异，从而完成了本发明。

5、即，本发明可如下例示。

6、[1]

7、一种食品的制造方法，其包含：

8、在加热条件、酸性条件或碱性条件下用变异型谷氨酰胺转氨酶对食品原料进行处理的工序，

9、所述变异型谷氨酰胺转氨酶是在野生型谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列中具有特定变异并且具有谷氨酰胺转氨酶活性的蛋白质，

10、所述特定变异为提高耐热性和/或ph稳定性的变异。

11、[2]

12、根据上述方法，其中，所述特定变异包含下述变异(a)和/或(b)：

13、变异(a)：选自下述的一个或一个以上的氨基酸残基中的变异：

14、g275、d1、y24、r48、s101、g102、n139、d142、l147、k152、g157、r167、n176、k181、e182、h188、d189、r208、t245、s246、g250、s284、h289、g301、k327；

15、变异(b)：导入二硫键的变异。

16、[3]

17、根据上述方法，其中，所述变异(a)包含选自下述的一个或一个以上的氨基酸残基中的变异：

18、g275、s101、g157、r208、g250。

19、[4]

20、根据上述方法，其中，所述变异(a)包含选自下述的一个或一个以上的变异：

21、g275a、d1f、y24(g,n)、r48(i,k)、s101(g,a,v,i,p,f,n,q,y,k,r,e)、g102n、n139s、d142a、l147w、k152t、g157(a,v,i,s,n,k,r,h,d,e)、r167g、n176d、k181r、e182d、h188y、d189i、r208(l,a,e)、t245a、s246(k,n,r)、g250(a,v,l,m,p,f,w,s,t,n,q,y,k,r,h,d)、s284p、h289i、g301w、k327f。

22、[5]

23、根据上述方法，其中，所述变异(a)包含选自下述的一个或一个以上的变异：

24、g275a、s101p、g157(a,r,s)、r208e和g250(n,r,s)。

25、[6]

26、根据上述方法，其中，所述变异(a)包含下述的任一个变异：

27、s101p/g157(a,r,s)/r208e/g250(n,r,s)/g275a、s101p/g157(a,r,s)/g250(n,r,s)、s101p/g157(a,r,s)/r208e/g250(n,r,s)。

28、[7]

29、根据上述方法，其中，所述变异(a)包含下述的任一个变异：

30、s101p/g157r/r208e/g250s/g275a、s101p/g157s/r208e/g250r/g275a、s101p/g157s/r208e/g250s、s101p/g157a/r208e/g250s、s101p/g157r/r208e/g250s、s101p/g157r/r208e/g250n。

31、[8]

32、根据上述方法，其中，所述变异(a)包含下述的任一个变异：

33、s101p/g157r/r208e/g250s/g275a、s101p/g157s/r208e/g250r/g275a。

34、[9]

35、根据上述方法，其中，所述变异(b)包含选自下述的一个或一个以上的变异：

36、d3c/g283c、a81c/v311c、e93c/v112c、a106c/d213c、e107c/y217c、a160c/g228c、s2c/n282c、s2c/g283c、t7c/e58c、p17c/w330c、d46c/s318c、s84c/k121c、r79c/p169c、a113c/p220c、e119c/s299c和r89c/s116c。

37、[10]

38、根据上述方法，其中，所述变异(b)为两个或两个以上的导入二硫键的变异。

39、[11]

40、根据上述方法，其中，所述变异(b)为三个或三个以上的导入二硫键的变异。

41、[12]

42、根据上述方法，其中，所述变异(b)包含d3c/g283c。

43、[13]

44、根据上述方法，其中，所述变异(b)包含d3c/g283c与选自e93c/v112c、a81c/v311c、a106c/d213c、e107c/y217c、a160c/g228c、s84c/k121c、r79c/p169c、a113c/p220c、e119c/s299c和r89c/s116c中的一个或一个以上的变异的组合。

45、[14]

46、根据上述方法，其中，所述变异(b)包含下述的任一个变异：

47、d3c/g283c/e93c/v112c、d3c/g283c/a81c/v311c、d3c/g283c/a106c/d213c、d3c/g283c/e107c/y217c、d3c/g283c/a160c/g228c、d3c/g283c/s84c/k121c、d3c/g283c/r79c/p169c、d3c/g283c/a113c/p220c、d3c/g283c/e119c/s299c、d3c/g283c/r89c/s116c、d3c/g283c/e93c/v112c/e107c/y217c、d3c/g283c/e93c/v112c/a113c/p220c、d3c/g283c/e93c/v112c/e119c/s299c、d3c/g283c/e107c/y217c/s84c/k121c、d3c/g283c/s84c/k121c/a113c/p220c。

48、[15]

49、根据上述方法，其中，所述特定变异包含所述变异(a)和(b)。

50、[16]

51、根据上述方法，其中，所述变异型谷氨酰胺转氨酶在65℃、ph6.0下进行10分钟加热处理后的残存活性为15％以上。

52、[17]

53、根据上述方法，其中，所述变异型谷氨酰胺转氨酶在75℃、ph6.0下进行10分钟加热处理后的残存活性为10％以上。

54、[18]

55、根据上述方法，其中，将所述变异型tg在ph6.0、37℃下进行4小时处理后的残存活性设为100％时，所述变异型谷氨酰胺转氨酶在ph4.0、37℃下进行4小时处理后的残存活性的相对值为60％以上。

56、[19]

57、根据上述方法，其中，所述野生型谷氨酰胺转氨酶是包含链霉菌(strepto myces)属细菌的成熟谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列的蛋白质。

58、[20]

59、根据上述方法，其中，所述链霉菌(streptomyces)属细菌为茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)。

60、[21]

61、根据上述方法，其中，所述野生型谷氨酰胺转氨酶为下述的任一种蛋白质：

62、(a)包含seq id no.2表示的氨基酸序列的蛋白质；

63、(b)包含在seq id no.2表示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质；

64、(c)包含相对于seq id no.2表示的氨基酸序列具有90％以上的相同性的氨基酸序列的蛋白质。

65、[22]

66、根据上述方法，其中，其满足以下的(1)～(3)中的任一项：

67、(1)在加热条件下实施所述工序，并且所述食品是乳加工食品、蛋加工食品、植物加工食品、肉食加工食品、海鲜加工食品或明胶加工食品；

68、(2)在酸性条件下实施所述工序，并且所述食品为谷物、薯类、豆类、坚果、肉食、海鲜、乳制品、油脂、调味料、饮料、果汁或它们的加工品；

69、(3)在碱性条件下实施所述工序，并且所述食品为植物性饮料、海藻提取物或它们的加工品。

70、[23]

71、根据上述方法，其中，其满足以下的(1)～(3)中的任一项：

72、(1)在加热条件下实施所述工序，并且所述食品为加工奶酪、预孵酸奶(pr e-incubated yogurt)、煎蛋、蒸蛋羹、蛋豆腐、豆腐、豆腐皮、面条类、面包、火腿、香肠、汉堡包、冰淇淋、小麦面团、果冻、软糖(gummy)、人造黄油或捏合制品(kneaded product)；

73、(2)在酸性条件下实施所述工序，并且所述食品为白米、糙米、醋饭、燕麦片、米粉、小麦粉、荞麦粉、糠、年糕、水揉制品(水練り)、面包、面条类、面筋、荞麦、土豆类、豆浆、巧克力、油炸豆腐皮、豌豆蛋白、肉食、明胶、虾、螃蟹、瑶柱、鲱鱼子、酸奶、黄油、奶酪、冰淇淋、蛋黄酱、番茄酱、芥末酱、酱油、味噌、咖啡类饮料、能量饮料、果汁饮料、可可、啤酒、酒糟、果汁软糖或它们的加工品；

74、(3)在碱性条件下实施所述工序，并且所述食品为豆浆、海带汤(昆布出汁)或它们的加工品。

75、[24]

76、根据上述方法，其中，所述工序中的加热温度为60℃以上。

77、[25]

78、一种用于食品的制造的组合物，其含有变异型谷氨酰胺转氨酶，

79、所述食品为制造时实施加热的食品或低ph或高ph的食品，

80、所述变异型谷氨酰胺转氨酶是在野生型谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列中具有特定变异并且具有谷氨酰胺转氨酶活性的蛋白质，

81、所述特定变异为提高耐热性和/或ph稳定性的变异。

82、[26]

83、根据上述组合物，其中，所述特定变异包含下述变异(a)和/或(b)：

84、变异(a)：选自下述的一个或一个以上的氨基酸残基中的变异：

85、g275、d1、y24、r48、s101、g102、n139、d142、l147、k152、g157、r167、n176、k181、e182、h188、d189、r208、t245、s246、g250、s284、h289、g301、k327；

86、变异(b)：导入二硫键的变异。

87、[27]

88、根据上述组合物，其中，所述变异(a)包含选自下述的一个或一个以上的氨基酸残基中的变异：

89、g275、s101、g157、r208、g250。

90、[28]

91、根据上述组合物，其中，所述变异(a)包含选自下述的一个或一个以上的变异：

92、g275a、d1f、y24(g,n)、r48(i,k)、s101(g,a,v,i,p,f,n,q,y,k,r,e)、g102n、n139s、d142a、l147w、k152t、g157(a,v,i,s,n,k,r,h,d,e)、r167g、n176d、k181r、e182d、h188y、d189i、r208(l,a,e)、t245a、s246(k,n,r)、g250(a,v,l,m,p,f,w,s,t,n,q,y,k,r,h,d)、s284p、h289i、g301w、k327f。

93、[29]

94、根据上述组合物，其中，所述变异(a)包含选自下述的一个或一个以上的变异：

95、g275a、s101p、g157(a,r,s)、r208e和g250(n,r,s)。

96、[30]

97、根据上述组合物，其中，所述变异(a)包含下述的任一个变异：

98、s101p/g157(a,r,s)/r208e/g250(n,r,s)/g275a、s101p/g157(a,r,s)/g250(n,r,s)、s101p/g157(a,r,s)/r208e/g250(n,r,s)。

99、[31]

100、根据上述组合物，其中，所述变异(a)包含下述的任一个变异：

101、s101p/g157r/r208e/g250s/g275a、s101p/g157s/r208e/g250r/g275a、s101p/g157s/r208e/g250s、s101p/g157a/r208e/g250s、s101p/g157r/r208e/g250s、s101p/g157r/r208e/g250n。

102、[32]

103、根据上述组合物，其中，所述变异(a)包含下述的任一个变异：

104、s101p/g157r/r208e/g250s/g275a、s101p/g157s/r208e/g250r/g275a。

105、[33]

106、根据上述组合物，其中，所述变异(b)包含选自下述的一个或一个以上的变异：

107、d3c/g283c、a81c/v311c、e93c/v112c、a106c/d213c、e107c/y217c、a160c/g228c、s2c/n282c、s2c/g283c、t7c/e58c、p17c/w330c、d46c/s318c、s84c/k121c、r79c/p169c、a113c/p220c、e119c/s299c和r89c/s116c。

108、[34]

109、根据上述组合物，其中，所述变异(b)为两个或两个以上的导入二硫键的变异。

110、[35]

111、根据上述组合物，其中，所述变异(b)为三个或三个以上的导入二硫键的变异。

112、[36]

113、根据上述组合物，其中，所述变异(b)包含d3c/g283c。

114、[37]

115、根据上述组合物，其中，所述变异(b)包含d3c/g283c与选自e93c/v112c、a81c/v311c、a106c/d213c、e107c/y217c、a160c/g228c、s84c/k121c、r79c/p169c、a113c/p220c、e119c/s299c和r89c/s116c中的一个或一个以上的变异的组合。

116、[38]

117、根据上述组合物，其中，所述变异(b)包含下述的任一个变异：

118、d3c/g283c/e93c/v112c、d3c/g283c/a81c/v311c、d3c/g283c/a106c/d213c、d3c/g283c/e107c/y217c、d3c/g283c/a160c/g228c、d3c/g283c/s84c/k121c、d3c/g283c/r79c/p169c、d3c/g283c/a113c/p220c、d3c/g283c/e119c/s299c、d3c/g283c/r89c/s116c、d3c/g283c/e93c/v112c/e107c/y217c、d3c/g283c/e93c/v112c/a113c/p220c、d3c/g283c/e93c/v112c/e119c/s299c、d3c/g283c/e107c/y217c/s84c/k121c、d3c/g283c/s84c/k121c/a113c/p220c。

119、[39]

120、根据上述组合物，其中，所述特定变异包含所述变异(a)和(b)。

121、[40]

122、根据上述组合物，其中，所述变异型谷氨酰胺转氨酶在65℃、ph6.0下进行10分钟加热处理后的残存活性为15％以上。

123、[41]

124、根据上述组合物，其中，所述变异型谷氨酰胺转氨酶在75℃、ph6.0下进行10分钟加热处理后的残存活性为10％以上。

125、[42]

126、根据上述组合物，其中，将所述变异型tg在ph6.0、37℃下进行4小时处理后的残存活性设为100％时，所述变异型谷氨酰胺转氨酶在ph4.0、37℃下进行4小时处理后的残存活性的相对值为60％以上。

127、[43]

128、根据上述组合物，其中，所述野生型谷氨酰胺转氨酶是包含链霉菌(streptomyces)属细菌的成熟谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列的蛋白质。

129、[44]

130、根据上述组合物，其中，所述链霉菌(streptomyces)属细菌为茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)。

131、[45]

132、根据上述组合物，其中，所述野生型谷氨酰胺转氨酶为下述的任一种蛋白质：

133、(a)包含seq id no.2表示的氨基酸序列的蛋白质；

134、(b)包含在seq id no.2表示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质；

135、(c)包含相对于seq id no.2表示的氨基酸序列具有90％以上的相同性的氨基酸序列的蛋白质。

136、[46]

137、根据上述组合物，其中，其满足以下的(1)～(3)中的任一项：

138、(1)在加热条件下实施所述工序，并且所述食品是乳加工食品、蛋加工食品、植物加工食品、肉食加工食品、海鲜加工食品或明胶加工食品；

139、(2)在酸性条件下实施所述工序，并且所述食品为谷物、薯类、豆类、坚果、肉食、海鲜、乳制品、油脂、调味料、饮料、果汁或它们的加工品；

140、(3)在碱性条件下实施所述工序，并且所述食品为植物性饮料、海藻提取物或它们的加工品。

141、[47]

142、根据上述组合物，其中，其满足以下的(1)～(3)中的任一项：

143、(1)在加热条件下实施所述工序，并且所述食品为加工奶酪、预孵酸奶、煎蛋、蒸蛋羹、蛋豆腐、豆腐、豆腐皮、面条类、面包、火腿、香肠、汉堡包、冰淇淋、小麦面团、果冻、软糖、人造黄油或捏合制品；

144、(2)在酸性条件下实施所述工序，并且所述食品为白米、糙米、醋饭、燕麦片、米粉、小麦粉、荞麦粉、糠、年糕、水揉制品、面包、面条类、面筋、荞麦、土豆类、豆浆、巧克力、油炸豆腐皮、豌豆蛋白、肉食、明胶、虾、螃蟹、瑶柱、鲱鱼子、酸奶、黄油、奶酪、冰淇淋、蛋黄酱、番茄酱、芥末酱、酱油、味噌、咖啡类饮料、能量饮料、果汁饮料、可可、啤酒、酒糟、果汁软糖或它们的加工品；

145、(3)在碱性条件下实施所述工序，并且所述食品为豆浆、海带汤或它们的加工品。

146、[48]

147、根据上述组合物，其中，所述制造中的加热温度为60℃以上。

148、[49]

149、一种变异型谷氨酰胺转氨酶，其在野生型谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列中具有特定变异，并且具有谷氨酰胺转氨酶活性，

150、所述特定变异为提高耐热性和/或ph稳定性的变异，

151、所述特定变异包含下述变异(a)和/或(b)：

152、变异(a)：选自下述的一个或一个以上的氨基酸残基中的变异：

153、g275、d1、y24、r48、s101、g102、n139、d142、l147、k152、g157、r167、n176、k181、e182、h188、d189、r208、t245、s246、g250、s284、h289、g301、k327；

154、变异(b)：导入二硫键的变异

155、所述变异型谷氨酰胺转氨酶满足以下的(b1)和/或(a1)：

156、(a1)所述特定变异包含所述变异(a)，并且，该变异(a)包含选自下述的一个或一个以上的氨基酸残基中的变异，

157、d1、r48、g102、n139、d142、l147、k152、r167、n176、k181、e182、d189、s246、h289、g301、k327；

158、其中，单独选择r48中的变异的情况下，r48中的变异为r48i，

159、其中，单独选择s246中的变异的情况下，s246中的变异为s246n；

160、(b1)所述特定变异包含所述变异(b)，并且，该变异(b)包含d3c/g283c与选自e93c/v112c、a81c/v311c、a106c/d213c、e107c/y217c、a160c/g228c、s84c/k121c、r79c/p169c、a113c/p220c、e119c/s299c和r89c/s116c中的一个或一个以上的变异的组合。

161、[50]

162、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异(a)包含选自下述的一个或一个以上的氨基酸残基中的变异：

163、g275、s101、g157、r208、g250。

164、[51]

165、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异(a)包含选自下述的一个或一个以上的变异：

166、g275a、d1f、y24(g,n)、r48(i,k)、s101(g,a,v,i,p,f,n,q,y,k,r,e)、g102n、n139s、d142a、l147w、k152t、g157(a,v,i,s,n,k,r,h,d,e)、r167g、n176d、k181r、e182d、h188y、d189i、r208(l,a,e)、t245a、s246(k,n,r)、g250(a,v,l,m,p,f,w,s,t,n,q,y,k,r,h,d)、s284p、h289i、g301w、k327f。

167、[52]

168、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异(a)包含选自下述的一个或一个以上的变异：

169、g275a、s101p、g157(a,r,s)、r208e和g250(n,r,s)。

170、[53]

171、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异(a)包含下述的任一个变异：

172、s101p/g157(a,r,s)/r208e/g250(n,r,s)/g275a、s101p/g157(a,r,s)/g250(n,r,s)、s101p/g157(a,r,s)/r208e/g250(n,r,s)。

173、[54]

174、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异(a)包含下述的任一个变异：

175、s101p/g157r/r208e/g250s/g275a、s101p/g157s/r208e/g250r/g275a、s101p/g157s/r208e/g250s、s101p/g157a/r208e/g250s、s101p/g157r/r208e/g250s、s101p/g157r/r208e/g250n。

176、[55]

177、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异(a)包含下述的任一个变异：

178、s101p/g157r/r208e/g250s/g275a、s101p/g157s/r208e/g250r/g275a。

179、[56]

180、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异(b)包含选自下述的一个或一个以上的变异：

181、d3c/g283c、a81c/v311c、e93c/v112c、a106c/d213c、e107c/y217c、a160c/g228c、s2c/n282c、s2c/g283c、t7c/e58c、p17c/w330c、d46c/s318c、s84c/k121c、r79c/p169c、a113c/p220c、e119c/s299c和r89c/s116c。

182、[57]

183、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异(b)是导入二硫键的三个或三个以上的变异。

184、[58]

185、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异(b)包含下述的任一个变异：

186、d3c/g283c/e93c/v112c、d3c/g283c/a81c/v311c、d3c/g283c/a106c/d213c、d3c/g283c/e107c/y217c、d3c/g283c/a160c/g228c、d3c/g283c/s84c/k121c、d3c/g283c/r79c/p169c、d3c/g283c/a113c/p220c、d3c/g283c/e119c/s299c、d3c/g283c/r89c/s116c、d3c/g283c/e93c/v112c/e107c/y217c、d3c/g283c/e93c/v112c/a113c/p220c、d3c/g283c/e93c/v112c/e119c/s299c、d3c/g283c/e107c/y217c/s84c/k121c、d3c/g283c/s84c/k121c/a113c/p220c。

187、[59]

188、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述特定变异包含所述变异(a)和(b)。

189、[60]

190、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异型谷氨酰胺转氨酶在65℃、ph6.0下进行10分钟加热处理后的残存活性为15％以上。

191、[61]

192、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述变异型谷氨酰胺转氨酶在75℃、ph6.0下进行10分钟加热处理后的残存活性为10％以上。

193、[62]

194、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，将所述变异型tg在ph6.0、37℃下进行4小时处理后的残存活性设为100％时，所述变异型谷氨酰胺转氨酶在ph4.0、37℃下进行4小时处理后的残存活性的相对值为60％以上。

195、[63]

196、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述野生型谷氨酰胺转氨酶是包含链霉菌(streptomyces)属细菌的成熟谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列的蛋白质。

197、[64]

198、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述链霉菌(streptomyces)属细菌为茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)。

199、[65]

200、根据上述变异型谷氨酰胺转氨酶，其中，所述野生型谷氨酰胺转氨酶为下述的任一种蛋白质：

201、(a)包含seq id no.2表示的氨基酸序列的蛋白质；

202、(b)包含在seq id no.2表示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质；

203、(c)包含相对于seq id no.2表示的氨基酸序列具有90％以上的相同性的氨基酸序列的蛋白质。

204、[66]

205、一种基因，其编码上述变异型谷氨酰胺转氨酶。

206、[67]

207、一种载体，其搭载上述基因。

208、[68]

209、一种微生物，其具有上述基因。

210、[69]

211、根据上述微生物，其为细菌或酵母。

212、[70]

213、根据上述微生物，其为棒状细菌或肠杆菌科(enterobacteriaceae)的细菌。

214、[71]

215、根据上述微生物，其为棒状杆菌属(corynebacterium)细菌或埃希菌属(escherichia)细菌。

216、[72]

217、根据上述微生物，其为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(escherichia coli)。