一种包埋生物活性物质的纳米颗粒的制备方法及其应用

1.本发明涉及纳米材料制备领域，尤其涉及一种包埋生物活性物质的纳米颗粒的制备方法及其应用。


背景技术：

2.生物活性物质如多肽、蛋白质、多糖等，因其水溶性差，或对空气、光、温度和ph等外界环境敏感，在食品加工过程中不仅会失去活性，丧失相应使用价值，而且可能对加工食品的颜色、风味和口感等产生不良影响。包封技术利用可以成膜的材料包覆在生物活性表面上，形成壁材-芯材体系，从而最大限度保持芯材原有的色香味等感官特性，特定功能的生理活性以及达到缓释效果。目前常用的微胶囊制备方法有：喷雾干燥法、乳化扩散法、界面聚合法、复合凝聚法、纳米沉淀法和逐层自组装法。
3.复合凝聚是高分子物理中的一个概念，主要是基于静电相互作用，带相反电荷聚电解质间发生去溶剂化而导致相分离，最后形成了两相体系，即富含聚电解质的凝聚相和与之平衡的稀释相。在食品体系中，研究较多的复合凝聚体系是蛋白质/多糖体系。其中，蛋白质是一种两性聚电解质，而多糖有阴阳离子多糖之分，两种物质带相反电荷时即发生静电相互作用。蛋白质/阴离子多糖的复合凝聚体系已被广泛研究。复合凝聚反应受ph值、离子强度(盐浓度)、蛋白质多糖比例、总聚合物浓度、多糖和蛋白质的分子质量等因素的影响；另外，高分子灵活性、电荷密度、搅拌速率、压力和温度等参数也会影响复合凝聚反应。复合凝聚法是一种新兴的包封技术，广泛应用于精油、维生素、乳酸菌、酶等组分的微囊化研究中，该方法制备条件温和、产率高、效率高，已逐渐成为国内外微囊化领域的研究热点。
4.目前，使用条件温和、产率高、效率高的纳米颗粒制备方法在食品体系中利用食品级蛋白质和多糖构建可保持加工食品的颜色、风味和口感，提高生物活性物质稳定性的可降解的纳米颗粒是功能食品开发的热点。
5.目前常用的纳米颗粒制备的方法主要是喷雾干燥法，但喷雾干燥法难以控制纳米颗粒的粒径，且高温的喷雾干燥的条件不适合包封对温度敏感的生物活性因子，而复合凝聚法既可以对脂溶性功能物质进行包封，又可以对亲水性物质进行包封，制备条件温和、产率高、效率高，已逐渐成为国内外微囊化领域的研究热点。但是目前常规方法仍存在一些难题，如何提供一种更好保留生物活性物质的活性，改善包封效果的包埋生物活性物质的纳米颗粒的制备及应用仍是本领域亟待解决的重要课题。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提供一种包埋生物活性物质的纳米颗粒的制备方法及其应用。
7.第一方面，本发明首先提供一种包埋生物活性物质的纳米颗粒的制备方法，包括：将乳清蛋白溶液和藻酸丙二醇酯溶液混合，得到乳清蛋白-藻酸丙二醇酯生物聚合物溶液；将生物活性物质和所述乳清蛋白-藻酸丙二醇酯生物聚合物溶液混合，调ph值至4.0～4.6，
搅拌25～35min，然后进行冻干处理；所述生物活性物质选自花青素、双歧杆菌和胰岛素中的任一种。
8.本发明方法制备的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒具有很好的包封效果，具有高生物活性物质包封效率。采用特定的复合凝聚结合冷冻干燥的方法制备能更好的保留生物活性物质的活性(尤其是对热敏感的物质)，且该方法制备得到的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯纳米颗粒，能够更好应用于对花青素、双歧杆菌和胰岛素等生物活性物质的包封，减少其包封过程中生物活性物质活性的降低。
9.为了进一步减少包封过程中生物活性物质活性的降低，制备包封效果好的包埋生物活性物质的纳米颗粒，本发明进一步进行了如下优化：
10.作为优选，所述生物活性物质在所述乳清蛋白-藻酸丙二醇酯生物聚合物溶液中的浓度为0.15～0.35mg/ml；所述ph值至4.2～4.6。本发明通过在上述条件下进行进一步减少包封过程中生物活性物质活性的降低，同时有利于提高复合凝聚效果。
11.进一步优选，包封花青素的乳清蛋白-花青素-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒的制备包括：将花青素粉末缓慢添加到乳清蛋白-藻酸丙二醇酯生物聚合物溶液中，使得样品中花青素的最终浓度为0.15～0.35mg/ml；然后将所有样品的ph值调至4.5，避光搅拌30min，然后冻干。
12.根据本发明，对乳清蛋白溶液和藻酸丙二醇酯溶液的浓度、比例进行优化，制备的包埋生物活性物质的纳米颗粒包封性能更佳，所述乳清蛋白溶液的浓度为0.05～0.3％；所述藻酸丙二醇酯溶液的浓度为0.05～0.3％。
13.作为优选，所述乳清蛋白溶液和所述藻酸丙二醇酯溶液的体积比为2～6:1～2。进一步优选，所述乳清蛋白储备液的质量浓度(w/v)优选为10％；藻酸丙二醇酯储备液的质量浓度(w/v)优选为1％。
14.进一步优选，还包括制备质量浓度为6～14％的乳清蛋白储备液和质量浓度为0.1～5％的藻酸丙二醇酯储备液，然后将所述乳清蛋白储备液和所述藻酸丙二醇酯储备液稀释，得到所述乳清蛋白溶液和所述藻酸丙二醇酯溶液。
15.进一步优选，所述乳清蛋白储备液的质量浓度(w/v)优选为10％；藻酸丙二醇酯储备液的质量浓度(w/v)优选为1％。
16.本发明中，采用以上优选的储备液原料，进一步提高包封效果。
17.进一步优选，所述乳清蛋白储备液的制备包括：将乳清蛋白粉与水混合，以200～400r/min的速度搅拌3～5h。
18.进一步优选，所述藻酸丙二醇酯储备液的制备包括所述生物活性物质在所述乳清蛋白-藻酸丙二醇酯生物聚合物溶液中的浓度为0.15～0.35mg/ml，优选为0.20mg/ml。尤其是选择0.20mg/ml为包封时花青素添加量时，包封效率达到最大，高达95.34
±
0.73％。
19.本发明利用采用特定原料参数的阳离子蛋白质和阴离子多糖进行复合凝聚，结合特定方法制备纳米颗粒，实现对生物活性物质的包封，构建复杂的食品体系，所制备的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒具有更优的包封效果，用于包封生物活性物质如花青素包封效率高，还能够实现对花青素稳定性的提高，同时达到提高其颜色稳定性和缓释的效果。
20.根据本发明提供的包埋生物活性物质的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒的
制备方法，优选所述乳清蛋白储备液的制备包括：将乳清蛋白粉与水混合，以200～400r/min的速度缓慢搅拌3～5h。
21.进一步优选，所述藻酸丙二醇酯储备液的制备包括：将藻酸丙二醇酯粉末与水混合，以700～900r/min的速度搅拌至溶解。
22.本发明中，经研究发现，乳清蛋白储备液制备更佳搅拌条件为以300r/min的速度缓慢搅拌4h，藻酸丙二醇酯储备液制备最佳的搅拌条件为：将藻酸丙二醇酯粉末与水混合，以800r/min的速度搅拌。本发明中搅拌的温度可以是室温条件，例如20℃、23℃、25℃，本发明选用25℃。
23.进一步优选，所述冻干处理采用：预冷1h后将样品进行冻干处理，冻干时间为1天。采用上述冻干处理能够有助于包埋生物活性物质的纳米颗粒更好制备。
24.另一方面，本发明提供一种包埋生物活性物质的纳米颗粒，根据上述的包埋生物活性物质的纳米颗粒的制备方法得到。
25.进一步优选，所述包埋生物活性物质的纳米颗粒的粒径小于1000nm。
26.本发明提供的纳米颗粒具有对ph4-6处有小而稳定的粒径，显著提高ph稳定性。
27.第三方面，本发明提供所述的包埋生物活性物质的纳米颗粒的制备方法在包封花青素、双歧杆菌、胰岛素中的应用。
28.本发明的有益效果至少在于：本发明利用阳离子蛋白质和阴离子多糖进行复合凝聚制备纳米颗粒，实现对生物活性物质的包封，构建复杂的食品体系。通过采用特定复合凝聚结合冷冻干燥的方法制备的具有很好包封作用的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯纳米颗粒，对花青素的包封效率高，可以应用于双歧杆菌和胰岛素的包封。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中需要使用的附图作简单介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明实施例提供的纳米颗粒的tga曲线图；
31.图2为本发明实施例提供的ph对纳米颗粒粒径的影响图。
具体实施方式
32.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
33.实施例1
34.本实施例提供包封花青素的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒的制备过程如下：
35.将乳清蛋白粉溶解在去离子水中，以300r/min的速度在25℃下缓慢搅拌4小时，制
备乳清蛋白(10％，w/v)储备液。藻酸丙二醇酯(1％，w/v)储备液的制备通过将粉末状藻酸丙二醇酯溶解在去离子水，在25℃下以800r/min的速度用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。将乳清蛋白(10％，w/v)储备液和藻酸丙二醇酯(1％，w/v)储备液稀释至0.1％，得到乳清蛋白(0.1％，w/v)溶液和藻酸丙二醇酯(0.1％，w/v)溶液。取30ml乳清蛋白(0.1％，w/v)溶液和10ml藻酸丙二醇酯(0.1％，w/v)溶液进行混合，得到乳清蛋白-藻酸丙二醇酯生物聚合物溶液；将花青素粉末缓慢添加到乳清蛋白-藻酸丙二醇酯生物聚合物溶液中，使得样品中花青素的最终浓度为0.15mg/ml，0.20mg/ml，0.25mg/ml，0.30mg/ml和0.35mg/ml。然后将所有样品的ph值调至4.5，避光搅拌30min。预冷1h后将样品进行冻干处理，冻干时间为1天，样品冻干后，在-20℃冰箱中保存备用。
36.包封花青素的乳清蛋白-花青素-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒花青素包封效率的测定具体如下：
37.配制ph 1.0和ph 4.5缓冲液，将氯化钾和乙酸钠溶于去离子水并用1m盐酸和1m氢氧化钠调节ph，制备0.20m，ph 1.0的氯化钾缓冲液和0.15m，ph 4.5的乙酸钠缓冲液。
38.总花青素和表面花青素的提取：总花青素的提取如下，取10mg冻干样品，加1ml去离子水研磨，再加入9ml无水乙醇萃取5min，萃取后使用0.45μm膜过滤。表面花青素的提取：取10mg冻干样品，加入10ml无水乙醇涡旋萃取30s，以3000r/min的速度离心，上清液用0.45μm膜过滤。
39.测定乳清蛋白-花青素-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒花青素包封效率：取1ml提取液加3ml缓冲液，使用紫外分光光度计测量510nm和700nm处的吸光度。根据下面的公式计算花青素的浓度，并表示为矢车菊素-3-o-葡萄糖苷当量。计算方法参照邹文洁等人的方法。由表1可知，花青素浓度为0.15mg/ml，0.20mg/ml，0.25mg/ml，0.30mg/ml和0.35mg/ml时，不同浓度花青素的包封效率之间无显著差异，都具有较高的包封效率。花青素浓度为0.20mg/ml时包封效率达到最大，为95.34
±
0.73％，因此选择0.20mg/ml为包封时花青素添加量。
40.表1花青素浓度对花青素包封效率的影响
[0041][0042]
不同字母表示组间差异显著(p＜0.05)。
[0043]
实验例1
[0044]
对乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒的性能参数进行分析：
[0045]
1制备乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒，步骤如下：
[0046]
1.1乳清蛋白和藻酸丙二醇酯储备液的制备
[0047]
制备步骤如下：乳清蛋白(10％，w/v)储备液通过以下方法制备。将乳清蛋白粉溶解在去离子水中，以300r/min的速度在25℃下缓慢搅拌4小时。藻酸丙二醇酯(1％，w/v)储备液是通过将粉末状藻酸丙二醇酯溶解在去离子水，在25℃下以800r/min的速度用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。
[0048]
1.2乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒的制备。
[0049]
1)将乳清蛋白(10％，w/v)储备液和藻酸丙二醇酯(1％，w/v)储备液稀释至0.1％。
[0050]
2)乳清蛋白纳米颗粒：取30ml稀释后的乳清蛋白(0.1％，w/v)溶液，用1m naoh将ph值调至7.0，将其置于在80℃的恒温水浴锅中加热30min后，在冰水浴中迅速冷却至室温。
[0051]
3)乳清蛋白-藻酸丙二醇酯纳米颗粒：取30ml乳清蛋白(0.1％，w/v)溶液和10ml藻酸丙二醇酯(0.1％，w/v)溶液进行混合，然后将混合体系的ph值调4.5，得到乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合物，然后将其置于在80℃的恒温水浴锅中加热30min后，在冰水浴中迅速冷却至室温，得到乳清蛋白-藻酸丙二醇酯纳米颗粒。
[0052]
2乳清蛋白-藻酸丙二醇酯纳米颗粒特性
[0053]
2.1乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒平均粒径的测定
[0054]
表2纳米颗粒的平均粒径表
[0055][0056]
不同字母表示组间差异显著(p＜0.05)。
[0057]
使用纳米粒度电位仪测定三个样品的平均粒径。从表2可以看出，所制样品(wp-pga)粒径明显小于1000nm，表明所制样品为乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒。藻酸丙二醇酯的添加显著降低了乳清蛋白在ph 4.5处的粒径，提高了乳清蛋白在ph 4.5处的稳定性。
[0058]
2.2乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒的热重分析
[0059]
使用热重分析仪测定样品的tga曲线。从图1可以看出，纳米颗粒均有三个失重阶段。第ⅰ阶段，在30-100℃范围内发生了最初的重量损失，这主要是由于结合水的损失和无热解相变。第ⅱ阶段，在240-440℃的温度范围内，样品在高温和氮气保护下分解成co2，co和水，此时纳米颗粒发生降解变性。第iii阶段，重量减轻持续，545℃之后残余化合物发生不发生明显的分解，大多数官能团消失。乳清蛋白的热变性温度为76℃左右，自组装制备的纳米颗粒增强了天然乳清蛋白的热稳定性高。
[0060]
2.3乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒的ph稳定性比较
[0061]
使用纳米粒度电位仪测定在ph 4-10时纳米颗粒粒径随ph的变化，比较纳米颗粒的ph稳定性。从图2可以看出，在ph 4-10之间，随着ph变化，添加了藻酸丙二醇酯的纳米颗粒(wp-pga)粒径的变化幅度显著小于乳清蛋白纳米颗粒(wnp)粒径的变化幅度，本发明提供的制备方法使乳清蛋白尤其在ph 4.5处有较小的粒径，说明提高了乳清蛋白在ph 4.5处的稳定性。
[0062]
实施例2
[0063]
本实施例提供复合纳米颗粒在酸奶中的应用，具体应用在包封酸奶中的双歧杆菌。
[0064]
(1)双歧杆菌浓缩菌液的制备。
[0065]
将双歧杆菌冻干粉在无菌mrs培养液中培养并离心收集，用生理盐水洗涤后，加入生理盐水制成双歧杆菌的浓度为9logcfug-1
双歧杆菌浓缩菌液。
[0066]
(2)包封双歧杆菌的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒的在酸奶中的应用。
[0067]
将双歧杆菌浓缩菌液缓慢添加到发明的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯生物聚合物溶液
中，按本发明中纳米颗粒的制备方法开发包封双歧杆菌的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒，并将所有样品冻干。将冻干后的包封双歧杆菌的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒按1：10的比例缓慢倒入液体酸奶中，搅拌30min至纳米颗粒在酸奶中混合均匀。
[0068]
本实施例能实现对双歧杆菌的包封，提高其稳定性。本实施例能有效起到缓释的效果，保证双歧杆菌的活性，达到调节宿主黏膜与系统免疫功能的目的，或通过调节肠道内菌群平衡，发挥促进营养吸收，保持肠道健康的作用。
[0069]
实施例3
[0070]
本实施例提供复合纳米颗粒在药品中的应用，具体应用在包封胰岛素冲剂。
[0071]
(1)制备胰岛素浓度为1mg/ml的胰岛素盐酸溶液。
[0072]
(2)包封胰岛素的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯冲剂。
[0073]
将胰岛素盐酸溶液缓慢添加到本发明的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯生物聚合物溶液中，按本发明中纳米颗粒的制备方法开发包封胰岛素的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒，将所有样品冻干后，即得包封胰岛素的乳清蛋白-藻酸丙二醇酯冲剂。
[0074]
液体状态的胰岛素不稳定，易发生交联和降解，本实施例包封胰岛素并将其制备成固体冲剂，提高了胰岛素的稳定性。胰岛素是一种最有效和可靠的控制血糖的药物，目前胰岛素的给药方式主要是腹部皮下注射。这种方式操作不便，而且会引起一定的痛苦。口服给药是大部分患者更加容易接受的一种给药方式，但是对于胰岛素来说，直接口服后面临胃酸的强酸作用和蛋白酶的降解作用，无法产生降血糖的生物活性。本实施例通过实现对降血糖激素胰岛素的包封，起到缓释的作用，防止或减少胰岛素在胃部的释放，使其在小肠加速释放或者透过小肠上皮细胞被血液吸收，达到较好的降血糖的效果。
[0075]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。