大菱鲆复合免疫增强剂、其制备方法及应用与流程

1.本发明属于水产养殖饲料添加剂技术领域，具体涉及一种大菱鲆复合免疫增强剂、其制备方法及应用。


背景技术：

2.随着天然渔业资源的日益枯竭，水产业作为一种传统产业，在近代得到了快速，有效的发展，并在社会、经济和人们生活中突现出其重要地位。然而，由于水土资源的有限性，从提高养殖面积来增加产量难以持续发展。因此，规模化、集约化、高密度研制模式逐渐成为中国鱼类养殖业的发展主流。然而，随着渔业养殖的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，对养殖产量及成长造成严重影响。病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。
3.针对各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法对病害的控制和防治曾发挥了积极作用。但是，这种病害控制措施造成的环境污染、抗药病原的大量出现、水产品的药物残留等负面影响日趋严重。
[0004][0005]
为遏制各种环境因素和养殖密度激增等造成的养殖鱼类病害日益严重的发展趋势，推进海水养殖业的可持续发展，世界粮农组织结合发达国家渔业发展的成功经验，倡导“系统管理途径”(system management approaches， sma)养殖模式预防各种病害的发生。提高鱼类自身的免疫力也是响应这一倡导的一种方式。
[0006]
大菱鲆(scophthalmus maximus)等鱼类是海水鱼类养殖的支柱性产业之一。随着养殖规模的不断扩大，集约化程度不断提高，养殖过程中的病害问题也逐年增加，尤其是爱德华氏菌、鳗弧菌等细菌性疾病的发生率最高。同时，近年来抗生素的不当添加导致细菌的耐药性不断提高，严重危害产业的绿色健康发展。
[0007]
为提高水产动物免疫力，预防病害疾病发生，免疫增强剂的使用成为目前水产养殖业的一种重要防控策略。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的在于提供一种大菱鲆复合免疫增强剂、其制备方法及应用。
[0009]
在本发明的第一方面，提供组合物在制备大菱鲆免疫增强剂中的应用，其中所述的组合物包括以下组分：β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、卵磷脂和鱼油，较佳地还包括植酸酶；按照重量百分比，所述组合物包括：
[0010][0011]
较佳地，所述组合物还包括：
[0012]
植酸酶：1～5％。
[0013]
在一种或多种实施方式中，所述的免疫增强为抵抗杀鱼爱德华氏菌和/或杀鲑气单胞感染的能力的增强。
[0014]
在一种或多种实施方式中，所述的免疫增强剂提高大菱鲆促炎相关基因的表达，较佳地，所述促炎相关基因包括(但不限于)：il1b、il6、tnf。
[0015]
在一种或多种实施方式中，降低大菱鲆体组织的细菌数量，较佳地，降低肝脏或肠道的细菌数量。
[0016]
在一种或多种实施方式中，提高大菱鲆组织的溶菌酶活性，增强大菱鲆杀菌能力；较佳地，提高肝脏或肠道的溶菌酶活性。
[0017]
在一种或多种实施方式中，提高大菱鲆组织的过氧化氢酶活性，增强大菱鲆抗氧化应激能力；较佳地，提高肝脏或肠道的过氧化氢酶活性。
[0018]
在一种或多种实施方式中，缓解大菱鲆在受到细菌感染后的肝脏损伤。
[0019]
在一种或多种实施方式中，缓解大菱鲆在受到细菌感染后的组织损伤，较佳地，所述组织损伤包括肠道组织损伤。
[0020]
在一种或多种实施方式中，按照重量百分比，所述组合物包括：
[0021][0022]
较佳地，所述组合物还包括：
[0023]
植酸酶：1.5～4％。
[0024]
在一种或多种实施方式中，所述的大菱鲆为杀鱼爱德华氏菌(edwardsiellapiscicida)易感性鱼，或为杀鲑气单胞菌(aeromonassalmonicidas)易感性鱼。
[0025]
在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物为大菱鲆免疫增强剂，按照重量百分比，其包括：
[0026][0027]
较佳地，所述组合物还包括：
[0028]
植酸酶：1～5％。
[0029]
在一种或多种实施方式中，按照重量百分比，所述组合物包括：
[0030][0031]
较佳地，所述组合物还包括：
[0032]
植酸酶：1.5～4％；
[0033]
较佳地，所述组合物中的组分混合于水中。
[0034]
在本发明的另一方面，提供一种制备组合物的方法，所述组合物为大菱鲆免疫增强剂，所述方法包括：将β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖和卵磷脂，较佳地还包括植酸酶进行混合，在混合物中加入鱼油，之后加入纯净水，均质乳化，获得组合物；其中，按照重量百分比，各组分的含量为：
[0035][0036]
在一种或多种实施方式中，使用匀浆机进行均质乳化。
[0037]
在一种或多种实施方式中，所述匀浆机以7600r/min转速搅拌5-10min，使其充分均质乳化。
[0038]
在本发明的另一方面，提供前面所述的组合物在制备鱼类饲料中的应用；较佳地，所述鱼类饲料为大菱鲆饲料。
[0039]
在本发明的另一方面，提供一种鱼类饲料，所述饲料中包括：(a)鱼基础饲料；以及
[0040]
(b)前面任一所述的组合物。
[0041]
在一种或多种实施方式中，(b)与(a)按照体积质量比3～10％(v/m)的比例混合；
较佳地，(b)与(a)按照体积质量比4～8％(v/m)的比例混合。
[0042]
在一种或多种实施方式中，(b)与(a)按照体积质量比4.5、5、5.5、6、6.5、 7或7.5％(v/m)的比例混合。
[0043]
在一种或多种实施方式中，所述“(b)与(a)按照体积质量比3～10％(v/m) 的比例混合”等同于：(b)与(a)按照体积质量比3～10:100(其中若体积以ml 计，那么质量以g计)。
[0044]
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
[0045]
图1、饲喂不同饲料组的大菱鲆组织中促炎相关基因的基因表达。
[0046]
图2、饲喂不同饲料组的大菱鲆肝脏(左)和后肠(右)中细菌定植。
[0047]
图3、饲喂不同饲料组的大菱鲆肝脏(左)和后肠(右)中溶菌酶活性。
[0048]
图4、饲喂不同饲料组的大菱鲆脾脏中过氧化氢酶活性。
[0049]
图5、饲喂不同饲料组的大菱鲆肝脏中mda含量。
[0050]
图6、饲喂不同饲料组的大菱鲆后肠病理切片。
具体实施方式
[0051]
本发明人经过深入的研究，揭示了由一系列组分构成的组合物在制备大菱鲆免疫增强剂中的应用，所述的免疫增强剂可有效提高大菱鲆促炎相关基因的表达、降低肝脏或肠道的细菌数量、增强大菱鲆杀菌能力、增强大菱鲆抗氧化应激能力、缓解大菱鲆在受到细菌感染后的肝脏损伤、缓解大菱鲆在受到细菌感染后的组织损伤。本发明的免疫增强剂组分简单易得、环境友好、成本低廉且效果理想，为提高海水鱼类的养殖水平、提高存活率提供了新的方案。
[0052]
术语
[0053]
如本文用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”；“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”和“由
……
构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0054]
如本文所用，“约”、“大约”、“大概”或“基本上”一般应指一特定数值或范围如20％以内、较佳10％以内、更佳地5％以内的上下浮动。在此所使用的数值为近似值，代表若未明示地陈述，“约”、“大约”、“大概”或“基本上”等词可以被推断适用。
[0055]
如本文所用，所述的“一级发酵”、“二级发酵”是指种子罐发酵。所述的“三级发酵”是以生产为目的的发酵。除非另外说明，本发明权利要求及说明书中所述的“发酵”、“培养”是指“三级发酵”。
[0056]
免疫增强剂
[0057]
如前所述，海洋病原菌杀鱼爱德华氏菌(edwardsiella piscicida)或杀鲑气单胞菌(aeromonas salmonicidas)能够感染鱼类，导致鱼的感染疾病。
[0058]
现有技术中，水产免疫增强剂产品的种类较为单一，以免疫多糖为主；并且产品多以粉末形式为主，产品剂型单一；也有的产品成分复杂多样化，成本高且效果不够理想。本发明人致力于水产免疫增强剂的改进，从兼顾鱼体生长性能和免疫应答能力两个角度出
发，使用β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、卵磷脂和鱼油，较佳地还添加植酸酶进行复配，并且采用乳化均质方法制备液体免疫增强剂，使其能够和饲料更好的结合，提高饲喂效果。结果表明用β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、卵磷脂和鱼油具有良好的免疫增强作用，而植酸酶的添加则进一步提高免疫增强剂的效果，使大菱鲆具有更强的抗氧化应激能力和抗感染能力。
[0059]
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种新型的用于增强海洋鱼类(尤其为大菱鲆)的免疫力的组合物，包括：β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、卵磷脂和鱼油，较佳地还包括植酸酶。
[0060]
在本发明的优选方式中，按重量百分比，所述的大菱鲆免疫增强剂包括的组分的用量如表1所示。
[0061]
表1
[0062][0063][0064]
作为本发明实施例中的一个优选的具体实例，所述免疫增强剂包括：2％β-葡聚糖、2％甘露寡糖、2％黄芪多糖、3％卵磷脂和10％鱼油，较佳地还包括2％植酸酶。
[0065]
植酸酶能够催化植物性原料中的植酸，使其水解。但是目前尚没有关于其在增强鱼类抗感染能力方面的应用。
[0066]
本发明的免疫增强剂中各个组分以合适的量相互配伍，协同作用，达到显著的免疫增强作用。
[0067]
所述免疫增强剂的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：乳液，水溶液，可乳化浓缩物，可湿粉剂，冻干剂，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。应理解，只要能够将本发明所述的组合物在保持全部或部分活性的前提递下送到所需处理的对象的剂型都是可取的。优选那些易于与饲料混合的剂型，如乳化液(乳剂)，其为均质乳化后形成的，能够与饲料良好地相混合。
[0068]
浓缩型的组合物中活性成分的含量较高，如20～90wt％，而稀释型组合物和实际使用的组合物中活性成分含量较低，通常为0.00005～0.5wt％。此外，还可以包含其他合适的化学剂、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填
剂等常用组分。本发明组合物中还可以含有其它活性成分，如促消化剂等。
[0069]
本发明的免疫增强剂，各个组分配方简单、原料易得、制备方法简单、成本低廉，但是却能由海水鱼类、尤其是大菱鲆有效且高效地利用，使得鱼类具有良好的免疫力，非常适用于作为海水鱼类、尤其是大菱鲆的饲料添加剂。
[0070]
应用
[0071]
本发明还提供了一种上述免疫增强剂的应用，应用于制备鱼类饲料(如鱼类幼苗饲料)。较佳地，可将所述液体免疫增强剂按照体积质量比3～10％ (v/m)添加于大菱鲆幼苗基础饲料中。
[0072]
本发明还提供了一种鱼类饲料，所述饲料中包括：鱼基础饲料；以及本发明所述的免疫增强剂。
[0073]
作为本发明的优选实施方式，将上述成分均质乳化后制成免疫增强剂，将该液体免疫增强剂按照5％(v/m)的比例添加于大菱鲆幼苗基础饲料中，通过4周的短期饲喂即可增强大菱鲆幼苗的免疫应答能力，有效保护期可超过 7周。
[0074]
本发明也提供了一种用于提高海洋鱼类、尤其是大菱鲆的免疫能力的试剂盒/包装盒，其中包括上述的免疫增强剂。试剂盒通常包括包装/容器。所述的试剂盒通常还包括使用说明书，其上可记载使用所述免疫增强剂的方法，也可记载例如本发明的免疫增强剂的制备方法等，以利于本领域技术人员方便地进行配制和施用。
[0075]
本发明也提供了一种用于提高海洋鱼类、尤其是大菱鲆的免疫能力的试剂盒，其中包括上述的鱼类饲料。试剂盒通常包括包装/容器。所述的试剂盒通常还包括使用说明书，其上可记载使用所述免疫增强剂的方法，也可记载例如本发明的免疫增强剂的制备方法等，以利于本领域技术人员方便地进行配制和施用。
[0076]
与现有技术相比，本发明的主要有益效果是：
[0077]
本发明的免疫增强剂为组合制剂，发挥免疫增强作用方面效果显著。本发明采用的β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、卵磷脂和鱼油相互组合、协同作用，相较于只使用多糖或寡糖而言，能够明显提高大菱鲆幼鱼免疫应答能力并缓解组织损伤。
[0078]
本发明的免疫增强剂具有制备简单、使用方便、安全无毒、无耐药性、无污染等特点，兼具抑菌、抗菌，可提高水产动物免疫力的功效。
[0079]
本发明的免疫增强剂的原料廉价易得，无毒无公害，不会对鱼体产生耐药性，不会对水体造成污染，并且具有非特异保护效果。
[0080]
本发明的免疫增强剂的制备方法和应用简单、操作方便，适合大量生产和应用。
[0081]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0082]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0083]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0084]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
[0085]
材料和方法
[0086]
试验试剂
[0087]
trizol，异丙醇，all-in-one first-strand cdna synthesis supermix， monamp sybr green qpcr mix(low rox)，过氧化氢酶检测试剂盒，溶壁微球菌，脂质氧化(mda)检测试剂盒，苏木素伊红(he)染色试剂盒，无水乙醇，二甲苯。
[0088]
试验器材
[0089]
组织破碎仪，quantstudio3，多功能酶标仪，电子称，石蜡切片机，研磨器，研磨棒。
[0090]
试验饲料
[0091]
对照组：基础饲料(购自山东正合饲料有限公司)。
[0092]
试验组a：向基础饲料中添加免疫增强剂(实施例1)，免疫增强剂与基础饲料的体积质量比为5％(v/m)。
[0093]
试验组b：向基础饲料中添加免疫增强剂(实施例2)，免疫增强剂与基础饲料的体积质量比为5％(v/m)。
[0094]
试验大菱鲆
[0095]
健康、外表无损伤、大小均一、规格为3-5g/尾大菱鲆。
[0096]
试验饲喂
[0097]
在养殖基地选取3-5g大菱鲆进行基础饲料、含有活性物质(实施例1或实施例2的复合免疫增强剂)的试验饲料进行饲喂4周。
[0098]
饲喂结束后各实验组选取100尾运至实验室进行暂养3周后，进行细菌攻毒和免疫应答指标检测。
[0099]
攻毒试验
[0100]
使用杀鱼爱德华氏菌(edwardsiella piscicida)和杀鲑气单胞菌(aeromonassalmonicidas)对停止饲喂复合免疫增强剂3周后的鱼进行攻毒试验。将 edwardsiella piscicida菌液按1％的接种量接种到含有50μg/ml多粘菌素的 tsb培养基中，28℃、220rpm培养12h。将一级种子液以1％的接种量接种到含有50μg/ml多粘菌素的tsb培养基中，28℃、220rpm过夜培养。将 aeromonas salmonicidas按1％的接种量接种到tsb培养基中，22℃、220rpm 培养24h。将一级种子液以1％的接种量接种到tsb培养基中，22℃、220rpm 过夜培养。
[0101]
用nanodrop测定菌浓，待od增长至3时，5000rpm离心5min收集细菌。每组随机选取40条大菱鲆进行浸泡攻毒，浸泡体积为60l，菌浓为 2*108cfu/ml，浸泡时间为1h，浸泡结束后用海水洗涤并放置在鱼缸中进行后续观察。
[0102]
样本采集与检测
[0103]
在攻毒后第3天进行采样，用于检测组织中促炎因子相关基因的表达。采样步骤具
体如下：每一组随机取9条鱼，分成三份，取后肠、鳃、肝脏、脾脏和头肾置于装有破碎珠的提取管中，加入1ml trizol，在组织破碎仪中研磨，提取组织rna并逆转录成cdna，通过qpcr检测il1b、il6、tnf等促炎相关基因的基因表达。
[0104]
在攻毒后第7天进行采样，用于检测组织中细菌定植情况。采样步骤具体如下：每一组随机取9条鱼，分成三份，取肝脏和后肠置于研磨管中，加入400μl 1％triton x-100浸没，用研磨器进行研磨，研磨液用pbs进行梯度稀释后取5μl进行滴板计数。
[0105]
在攻毒后第7天进行采样，用于检测组织中溶菌酶活性。采样步骤具体如下：每一组随机取9条鱼，分成三份，取肝脏和后肠置于研磨管中，加入裂解液，用研磨器进行研磨，离心后取上清检测溶菌酶活力。
[0106]
在攻毒后第7天进行采样，用于检测组织中抗氧化应激酶活性。采样具体步骤如下：每一组随机取9条鱼，分成三份，取脾脏置于1.5ml ep管中，加入裂解液，用研磨器进行研磨，离心后取上清检测过氧化氢酶活性。
[0107]
在攻毒后第7天进行采样，用于检测组织中丙二醛的含量，采样具体步骤如下：每一组随机取9条鱼，分成三份，取肝脏置于1.5ml ep管中，加入裂解液，用研磨器进行研磨，离心后取上清检测肝脏中丙二醛含量。
[0108]
在攻毒后第21天进行采样，用于检测肠道病理情况，采样具体步骤如下：每组取2条鱼，剖取鱼的后肠部位于组织固定液中浸没，用于后续的石蜡切片样本制备，he染色和组织形态观察。
[0109]
实施例1、复合免疫增强剂1和1’的制备
[0110]
制备一种用于鱼类的复合免疫增强剂1和1’，按重量百分比包括表2所示的组分。
[0111]
表2
[0112]
组分增强剂1增强剂1’β-葡聚糖2％1.8％甘露寡糖2％2.3％黄芪多糖2％1.7％植酸酶2％2.5％卵磷脂3％2.6％鱼油10％12％余量纯净水纯净水
[0113]
上述鱼类的复合免疫增强剂的制备包括以下步骤：分别将β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、植酸酶和卵磷脂按照所需重量称好后加入鱼油，并且补充纯净水，之后使用匀浆机以7600r/min转速搅拌5-10min，使其充分混匀。
[0114]
将制备好的液体免疫增强剂按照体积质量比5％(v/m)添加于鱼类(如后续为大菱鲆)幼苗基础饲料中。
[0115]
实施例2、复合免疫增强剂2和2’的制备
[0116]
制备一种用于鱼类的复合免疫增强剂2和2’，按重量百分比包括表3所示的组分。
[0117]
表3
[0118]
组分增强剂2增强剂2’β-葡聚糖2％2.2％
甘露寡糖2％1.8％黄芪多糖2％2.5％卵磷脂3％3.5％鱼油10％8.5％余量纯净水纯净水
[0119] 上述鱼类的复合免疫增强剂的制备方法，其包括以下步骤：分别将β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖和卵磷脂按照所需重量称好后加入鱼油，并且补充纯净水，使用匀浆机以7600r/min转速搅拌5-10min，使其充分混匀。
[0120]
将制备好的液体免疫增强剂按照体积质量比5％(v/m)添加于大菱鲆幼苗基础饲料中。
[0121]
实施例3、免疫增强剂对于鱼类促炎相关基因的基因表达的影响
[0122]
对大菱鲆饲喂基础饲料和不同免疫增强剂后(饲喂4周)，之后停止饲喂3 周后攻毒，感染3天后，测定大菱鲆肝脏、脾脏、头肾、后肠、鳃等各个组织中il1b、il6、tnf等促炎相关基因的基因表达情况。
[0123]
结果如图1所示。由图1可知：试验组a和试验组b相较于饲喂普通饲料的的对照组来说，il1b、il6、tnf等基因表达均明显提高，并且添加了植酸酶的试验组a中il1b、il6、tnf等基因在脾脏、头肾、鳃中的表达显著高于只含有多糖和寡糖的试验组b。
[0124]
因此，本发明复合免疫增强剂可以显著提高大菱鲆促炎相关基因的表达，添加植酸酶更有助于这一提高作用。
[0125]
实施例4、免疫增强剂对于鱼类杀菌能力的作用分析
[0126]
1、鱼类肝脏、肠道细菌定值分析
[0127]
饲喂基础饲料和不同免疫增强剂后(饲喂4周)，之后停止饲喂3周后攻毒，在分别用edwardsiella piscicida和aeromonas salmonicidas感染7天后，分别测定大菱鲆肝脏(图2左图)和后肠(图2右图)中细菌定植情况。
[0128]
由图2可知：试验组a和试验组b相较于饲喂普通饲料的的对照组来说，在aeromonas salmonicidas感染后7天后肝脏细菌数量明显降低，在 edwardsiella piscicida感染后7天后肠道细菌数量明显降低，和对照组差异显著。
[0129]
并且，试验组a各个组织中细菌数量明显低于试验组b。
[0130]
同时，以试验组a’(含有复合免疫增强剂1’，其与基础饲料的体积质量比为5％)和试验组b’(含有复合免疫增强剂2’，其与基础饲料的体积质量比为5％)进行细菌定植分析，同样地，edwardsiella piscicida感染后7天后肠道细菌数量明显降低，且试验组a’各个组织中细菌数量明显低于试验组b’。
[0131]
2、鱼类肝脏、肠道溶菌酶活性分析
[0132]
饲喂基础饲料和不同免疫增强剂后(饲喂4周)，之后停止饲喂3周后攻毒，在edwardsiella piscicida感染7天后大菱鲆肝脏(左)和后肠(右)中溶菌酶活性情况。
[0133]
由图3可知，在饲喂含有免疫增强剂的饲料4周，edwardsiella piscicida 攻毒7天后，试验组a和试验组b肝脏和后肠溶菌酶活性显著提高，并且试验组a明显高于试验组b。
[0134]
因此，本发明的鱼类复合免疫增强剂可以非常显著地增强大菱鲆杀菌能力。
[0135]
实施例5、免疫增强剂对于鱼类抗氧化应激能力的作用分析
[0136]
图4是饲喂基础饲料和不同免疫增强剂后(饲喂4周)，之后停止饲喂3 周后攻毒，在edwardsiella piscicida感染7天后大菱鲆脾脏中过氧化氢酶活性情况。
[0137]
由图4可知，在饲喂含有免疫增强剂的饲料4周，之后停止饲喂3周后攻毒，edwardsiella piscicida攻毒7天后试验组a和试验组b肝脏和后肠过氧化氢酶活性显著提高，并且试验组a高于试验组b。
[0138]
因此，本发明的鱼类复合免疫增强剂可以显著地增强大菱鲆抗氧化应激能力。
[0139]
实施例6、免疫增强剂对于鱼类肝脏损伤的作用分析
[0140]
饲喂基础饲料和不同免疫增强剂后(饲喂4周)，之后停止饲喂3周后攻毒，在edwardsiella piscicida感染7天后，测定大菱鲆肝脏中丙二醛(mda) 含量情况。
[0141]
由图5可知，在饲喂含有免疫增强剂的饲料4周，edwardsiella piscicida 攻毒7天后，对照组肝脏中mda含量明显高于试验组a和试验组b，并且试验组b高于试验组a，mda含量与肝脏损伤程度正相关。
[0142]
因此，本发明的鱼类复合免疫增强剂可以非常显著地缓解鱼类在受到细菌感染后的肝脏损伤。
[0143]
实施例7、免疫增强剂对于鱼类肠道组织损伤的作用分析
[0144]
饲喂基础饲料和不同免疫增强剂后(饲喂4周)，之后停止饲喂3周后攻毒，在edwardsiella piscicida感染21天后获取大菱鲆后肠，制备病理切片并观测。
[0145]
由图6可知：饲喂含有免疫增强剂的饲料4周，edwardsiella piscicida 攻毒、感染21天后，对照组肠绒毛脱落严重，而试验组a和试验组b肠道结构屏障、感染后完整，缓解作用非常显著，且试验组a最佳。
[0146]
因此，本发明的鱼类免疫增强剂可以极为显著地缓解攻毒后大菱鲆组织损伤。
[0147]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。