一种具有增强免疫功能壳聚糖－虾青素纳米粒子的制备方法与流程

一种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子的制备方法
技术领域
1.本发明涉及医用食品技术领域，具体为一种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子的制备方法。


背景技术：

2.我国是海洋大国，拥有丰富的海洋资源，海洋活性物质的探索与开发已成为海洋生物研究的重点方向之一。壳聚糖是由甲壳质经脱乙酰基后得到的碱性多糖，又被称为脱乙酰甲壳素，广泛存在于虾类、蟹类中的甲壳。壳聚糖是一种天然聚阳离子生物多糖，在生物学中广泛应用，研究表明，低分子壳聚糖具有多种生物学活性及药用价值，如良好生物相容性，无毒害，可抑制革兰阴性菌和阳性菌，可有效地降低肝脏和血清中的胆固醇、血压、血糖和血脂，此外壳聚糖还具有促进脾脏抗体生成、增强免疫力和抗疾病的能力，但是壳聚糖在调控机体免疫时，会诱导线粒体释放活性氧ros，后者进而激活nlrp3炎性小体。
3.虾青素(astaxanthin)作为一种天然的类胡萝卜素，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节、降低氧化损伤等多种生理活性，其在自然界中广泛分布于虾、蟹、藻等海洋动植物体内，由于结构中含有多个共轭不饱和双键，因此虾青素单质非常不稳定，极易受到光照、温度、氧、离子强度以及金属离子等因素影响，发生氧化降解，且虾青素在改善机体免疫方面存在生物利用率低、机制不明确等问题，使其在医药、食品配方中的使用受到限制。
4.纳米技术作为一项高新科学技术，已广泛应用于化工、材料、医药、通讯、能源等领域，近年来该技术在医药上的许多研究成果正逐步应用于食品行业，食品纳米颗粒制备方法有机械粉碎法、高压均质法、超声波法、乳液法、超临界流体法、分子自组装法等，生物活性成分自组装纳米技术，可改善食品的营养和风味，提高活性成分的生物利用率，促进在人体中的消化吸收，具有较好的稳定性和功能性，对增强免疫力医用食品进行研究与开发有利于功能性食品的发展。


技术实现要素：

5.针对现有的背景技术中存在的问题，本发明提供了一种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子的制备方法，通过将壳聚糖与虾青素共价结合，经自组装成为稳态化纳米粒子，随食品摄入后在机体内定向递送至肠道细胞吸收、代谢，实现海洋活性成分增强免疫力的协同增效作用，建立以科学保健理论为基础的海洋健康食品生产技术，推动医用健康食品产业高质量发展。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：将壳聚糖与虾青素共价结合，经自组装成为稳态化纳米粒子，随食品摄入后在机体内定向递送至肠道细胞吸收、代谢，实现海洋活性成分增强免疫力的协同增效作用。
7.优选的，所述制备方法，包括以下步骤：
8.s1、原料准备，取摩尔比例为1:1壳聚糖和虾青素溶于乙醇中，所述壳聚糖为低分子量壳聚糖，其分子量为0.5万道尔顿；
9.s2、催化反应，在氮气保护下加入交联剂edc的催化下，搅拌反应10小时，得到壳聚糖-虾青素溶液；
10.s3、蒸发干燥，将上述壳聚糖-虾青素溶液，通过减压旋转蒸发干燥的壳聚糖-虾青素化合物；
11.s4、形成纳米粒子，将上述合成所得的壳聚糖-虾青素化合物溶于水溶液中，二者在水溶液中因为分子间的相互作用力，发生自组装形成壳聚糖—虾青素纳米粒子。
12.优选的，所述壳聚糖为一种低分子量壳聚糖，其分子量在0.5-2万道尔顿。
13.优选的，所述壳聚糖和虾青素摩尔比例为(1～5):1。
14.优选的，所述搅拌反应为10～14小时。
15.优选的，所述壳聚糖-虾青素纳米粒子粒径大小在140nm～415nm之间，zeta电位在14.2mv～25.2mv之间。
16.优选的，所述壳聚糖-虾青素纳米粒子可以应用于医用纳米食品开发中，以混悬液、乳剂为载体，配方设计主要参考《食品安全国家标准一特殊医学配方食品通则》，通过优化配方和生产工艺，开发多系列增强免疫力医用食品。
17.优选的，所述壳聚糖-虾青素纳米粒子在37℃，ph2.0的酸性环境下分解率小于20％。
18.(三)有益效果
19.本发明提供了一种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子的制备方法，具备以下有益效果：
20.(1)该种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子的制备方法，通过将壳聚糖与虾青素共价结合，经自组装成为稳态化纳米粒子，提高壳聚糖-虾青素稳定性和生物利用率，随食品摄入后在机体内定向递送至肠道细胞吸收、代谢，实现海洋活性成分增强免疫力的协同增效作用。
21.(2)该种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子的制备方法，制备的纳米粒子对免疫器官、巨噬细胞吞噬指数、脾脏中淋巴细胞、t细胞亚群及血清中igg、igm水平、肠道菌群均有有益影响。
22.(3)该种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子，可以应用于医用纳米食品开发中，以混悬液、乳剂为载体，配方设计主要参考《食品安全国家标准一特殊医学配方食品通则》，通过优化配方和生产工艺，开发多系列增强免疫力医用食品。
具体实施方式
23.基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1
25.本发明提供一种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
26.s1、原料准备，取摩尔比例为1:1壳聚糖和虾青素溶于乙醇中，所述壳聚糖为低分子量壳聚糖，其分子量为0.5万道尔顿；
27.s2、催化反应，在氮气保护下加入交联剂edc的催化下，搅拌反应10小时，得到壳聚
糖-虾青素溶液；
28.s3、蒸发干燥，将上述壳聚糖-虾青素溶液，通过减压旋转蒸发干燥的壳聚糖-虾青素化合物；
29.s4、形成纳米粒子，将上述合成所得的壳聚糖-虾青素化合物溶于水溶液中，二者在水溶液中因为分子间的相互作用力，发生自组装形成壳聚糖—虾青素纳米粒子。
30.所述具有增强免疫功能的壳聚糖-虾青素纳米粒子可以应用于医用纳米食品开发中，以混悬液、乳剂为载体，配方设计主要参考《食品安全国家标准一特殊医学配方食品通则》，通过优化配方和生产工艺，开发多系列增强免疫力医用食品。
31.实施例2
32.本发明提供一种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
33.s1、原料准备，取摩尔比例为3:1壳聚糖和虾青素溶于乙醇中，所述壳聚糖为低分子量壳聚糖，其分子量为1万道尔顿；
34.s2、催化反应，在氮气保护下加入交联剂edc的催化下，搅拌反应12小时，得到壳聚糖-虾青素溶液；
35.s3、蒸发干燥，将上述壳聚糖-虾青素溶液，通过减压旋转蒸发干燥的壳聚糖-虾青素化合物；
36.s4、形成纳米粒子，将上述合成所得的壳聚糖-虾青素化合物溶于水溶液中，二者在水溶液中因为分子间的相互作用力，发生自组装形成壳聚糖—虾青素纳米粒子。
37.实施例3
38.本发明提供一种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
39.s1、原料准备，取摩尔比例为5:1壳聚糖和虾青素溶于乙醇中，所述壳聚糖为低分子量壳聚糖，其分子量为2万道尔顿；
40.s2、催化反应，在氮气保护下加入交联剂edc的催化下，搅拌反应14小时，得到壳聚糖-虾青素溶液；
41.s3、蒸发干燥，将上述壳聚糖-虾青素溶液，通过减压旋转蒸发干燥的壳聚糖-虾青素化合物；
42.s4、形成纳米粒子，将上述合成所得的壳聚糖-虾青素化合物溶于水溶液中，二者在水溶液中因为分子间的相互作用力，发生自组装形成壳聚糖—虾青素纳米粒子。
43.本发明通过下列实验例1，检验实施例1-3中的壳聚糖-虾青素纳米粒子结构表征，包括：壳聚糖-虾青素纳米粒子的化学键；表面形态、分散性和粒径大小；在水溶液中的水合粒径、zeta电位和分散系数。
44.本发明通过下列实验例2检验实施例1-3中的壳聚糖-虾青素纳米粒子稳定性，包括纳米粒酸稳定性、温度稳定性、储存稳定性。
45.本发明通过下列实验例3，验证实施例1-3中的壳聚糖-虾青素纳米粒子在体外消化过程中的变化情况。
46.本发明通过下列实验例4，检测实施例1-3中的壳寡糖-虾青素纳米粒子在小鼠体内消化吸收情况。
47.本发明通过下列实验例5，研究壳聚糖-虾青素纳米粒子对巨噬细胞的免疫调节作用机制。
48.本发明通过下列实验例6，研究壳聚糖-虾青素纳米粒子对免疫抑制小鼠免疫功能的影响机制。
49.实验例1
50.本实验例通过核磁共振波谱、扫描电镜、纳米粒度仪对所述壳聚糖-虾青素纳米粒子结构表征，具体操作如下：
51.101、使用核磁共振波谱进行结构表征，将一定量减压干燥的壳聚糖、虾青素和壳聚糖-虾青素化合物分别溶于氘代的甲醇中，室温进行核磁共振波谱(氢谱和碳谱)检测，通过图谱对比，对壳聚糖-虾青素化合物中新生成的化学键进行表征，确定新化合物的生成；
52.102、使用有纳米粒子形态学及粒径分析功能的扫描电镜进行结构表征，将壳聚糖—虾青素纳米粒子分散于无水乙醇中，涂于硅片减压干燥48h，经导电处理后进行扫描电镜检测，观察壳聚糖—虾青素纳米粒子的表面形态、分散性和粒径大小等；
53.103、使用纳米粒度仪进行结构表征，将壳聚糖—虾青素纳米粒分散于磷酸缓冲盐溶液中，采用纳米粒度仪对纳米粒子在水溶液中的水合粒径、zeta电位和分散系数进行检测。
54.通过以上得到实验结果如下表：
[0055][0056]
实验例2
[0057]
本实验例通过对壳聚糖—虾青素纳米粒子在不同ph(ph 2.0胃液、6.8肠液、7.4正常生理条件)、不同温度(4、25、37℃)不同保存时间(30d内)的粒径进行检测，表征纳米粒子的在体外的酸稳定性、温度稳定性、储存稳定性。
[0058]
通过以上得到如下实验结果：在溶液中壳聚糖-虾青素纳米粒子有较高稳定性，在37℃，ph2.0的酸性环境下分解率小于20％，ph2.0时的分解速度大于ph6.8，p6.8时的分解速度大于7.4，分解速度随温度升高而升高，在室温情况下可稳定保存30d。
[0059]
实验例3
[0060]
本实验例通过体外模拟消化、建立caco-2单层细胞模型、壳聚糖-虾青素细胞纳米颗粒吸收试验检测壳寡糖-虾青素在体外消化过程中的变化情况，具体步骤如下：
[0061]
201、体外模拟消化：取15ml模拟胃液与5ml壳聚糖-虾青素纳米粒子，混合均匀，37℃100rpm消化2.0h；用1.0mnahco3将胃模拟消化后的消化液的ph调至7.5，然后加入5.0ml肠道消化液，37℃100rpm消化2.0h，最后取部分样品过0.22μm尼龙膜，20℃保存，得到肠道
消化样品(c)，模拟小肠消化期间，每隔30min利用hplc-ms、红外光谱、核磁等方法检测壳聚糖-虾青素纳米粒子在体外消化过程中的变化情况。
[0062]
202、caco-2单层细胞模型的建立：将caco-2细胞置于含20％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％双抗的dmem培养基中，37℃、5％co2恒温培养箱环境下培养，隔天换液。当细胞生长至培养瓶面积的90％左右，胰酶消化后收集并计数。按照3
×
105个/cm2接种至12孔transwell板上，前7天隔天换培养液，之后每天更换培养液，连续培养17-21天，每隔1天测定teer值。通过考察caco-2细胞结构、teer值，验证caco-2细胞单层膜是否完整。
[0063]
203、壳聚糖-虾青素细胞纳米颗粒吸收试验：取符合吸收条件且细胞生长形态完好的膜，用缓冲溶液清洗三遍，洗去细胞单分子层表面的杂质。最后一次在转速为50r/min的恒温空气摇床上孵育1h后，在apcial侧(肠腔侧)加入不同浓度壳聚糖-虾青素纳米粒子及空白组供试溶液作为供给液，在basolateral侧(基底侧)加入空白缓冲液作为接收液。每组3个复孔，分别于0.5、1.0、1.5、2h后，于bl侧采集0.5ml接收液，同时补加0.5ml空白缓冲液。hplc-ms、红外光谱、核磁等方法检测壳寡糖-虾青素在体外消化过程中的变化情况。
[0064]
本实验例，以人工胃液和肠液模拟体外消化状态，考察在消化液中的稳定性；采用caco2细胞模型对纳米粒子的跨膜吸收进行研究；进而通过小鼠模型，探究壳聚糖-虾青素在消化道内、肠壁及血液中的时间关系，阐明壳聚糖-虾青素体内消化吸收特征，得到如下结论：壳聚糖-虾青素纳米粒子在消化道中的胃液中分解，进入肠道后65％壳的聚糖-虾青素可通过肠壁被吸收，进入肠道0.5小时后血液中可检测到壳聚糖-虾青素，其浓度在3小时达到峰值。
[0065]
实验例4
[0066]
本实验例通过生物实验来检测壳寡糖-虾青素纳米粒子在小鼠体内消化吸收情况。
[0067]
实验设计：购买8周龄babl/c小鼠，适应性喂养7天，随机分为对照组，虾青素组、壳寡糖-虾青素纳米粒子组、壳寡糖+虾青素复配组、壳寡糖组。小鼠禁食10h，各试验组小鼠按照200mg/kg体重灌胃乳剂，对照组小鼠每个时间节点灌胃等量生理盐水。在灌胃2h、3h、5h、8h、12h、16h、24h后，小鼠眼球取血(每个时间节点6只)，处死后取十二指肠、空肠、回肠和大肠，用4ml pbs冲洗消化道内容物置于10ml离心管中，-20℃冻存备用。洗净的消化道器官置于-80℃保存，血液室温放置30min待血清析出后，离心取上清，分装备用。收集不同时间节点的粪便。
[0068]
利用hplc-ms、红外光谱等方法检测小鼠消化道内容物、小肠及血清中壳聚糖-虾青素及其衍生物组成，探究壳聚糖-虾青素在消化道内、肠壁及血液中的时间关系，阐明壳聚糖-虾青素体内消化吸收特征。
[0069]
通过以上得到如下实验结果：以raw264.7小鼠单核巨噬细胞为模型，考察纳米粒子对细胞增殖活性、吞噬能力及相关细胞因子表达量的影响；同时采用western blot初步分析纳米粒子对信号通路的影响。
[0070]
实验例5
[0071]
本实验例包括：cck8法检测壳聚糖-虾青素纳米粒子对巨噬细胞的增值作用、中性红法检测壳聚糖-虾青素纳米粒子巨噬细胞的吞噬作用、壳聚糖-虾青素纳米粒子对巨噬细胞炎症因子分泌的影响、研究壳聚糖-虾青素纳米粒子对巨噬细胞的免疫调节作用机制。
[0072]
301、cck8法检测壳聚糖-虾青素纳米粒子对巨噬细胞的增值作用。
[0073]
raw264.7巨噬细胞培养同前期的培养方法(food and function,2018,9,643)。经0.25％胰酶消化后制成浓度为5
×
104个/ml细胞悬液，100μl/孔接种于96孔培养板，培养至细胞贴壁，孵育不同浓度壳聚糖-虾青素纳米颗粒(0-80μg/ml)，每组5个复孔，孵育24h与48h后。以cck8试剂测定细胞的增值率。
[0074]
302、中性红法检测壳聚糖-虾青素纳米粒子巨噬细胞的吞噬作用。
[0075]
raw264.7巨噬细胞经0.25％胰酶消化后制成浓度为5
×
104个/ml细胞悬液，100μl/孔接种于96孔培养板，培养至细胞贴壁，孵育不同浓度壳聚糖-虾青素纳米颗粒(0-80μg/ml)，阳性对照组加入lps溶液，每组5个复孔，孵育24h与48h后，弃去上清。加入100μl浓度0.1％的中性红溶液，培养1h然后将中性红溶液弃去，使用pbs进行清洗，甩干，每孔加100μl冰醋酸-无水乙醇(1:1)细胞裂解液，室温条件下静止过夜，570nm测定od值。
[0076]
303、壳聚糖-虾青素纳米粒子对巨噬细胞炎症因子分泌的影响。
[0077]
选择对数生长期细胞进行接种，调整密度为5
×
105个/ml细胞悬液，100μl/孔接种于96孔培养板，培养至细胞贴壁。将实验分成四个组，分别为：lps组，壳聚糖-虾青素纳米颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组以及正常组，培养24h。回收上清利用elisa试剂盒测定il-1β、tnf-α、il-6、il-10的炎症因子水平。
[0078]
304、壳聚糖-虾青素纳米粒子对巨噬细胞免疫作用的机制。
[0079]
选择对数生长期细胞进行接种，调整密度为2
×
105个/ml细胞悬液，2ml/孔接种于6孔培养板，培养至细胞贴壁。将实验分成四个组，分别为：lps组，壳聚糖-虾青素纳米颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组以及正常组，培养24h。弃去收上清，回收细胞，使用dna/rna/蛋白共提试剂盒提取rna与蛋白，借助rt-pcr与western blot方法检测mapk信号通路关键基因与蛋白的表达量。
[0080]
通过以上得到如下实验结果：本发明壳聚糖-虾青素纳米颗粒浓度越高越有利于巨噬细胞的增值，越有利于降低巨噬细胞炎症因子分泌。
[0081]
实验例6
[0082]
本实验例通过研究壳聚糖-虾青素纳米粒子对免疫抑制小鼠免疫功能的影响机制，具体操作如下：ctx致免疫抑制模型建立，对60只小鼠进行随机分组，一共分成6组，每组10只。分别是注射ctx浓度为100mg/kg的模型组、正常组、阳性对照组、低剂量纳米粒子组(10mg/kg)、中剂量纳米粒子组(20mg/kg)与高剂量纳米粒子组(30mg/kg)。除正常组外，其余各组实验第1-3天，每日腹腔注射1次ctx建立免疫低下小鼠模型。实验第4-13天，阳性对照组腹腔注射香菇多糖(20mg/kg)，各实验组分别灌胃不同剂量的壳聚糖-虾青素纳米粒子。正常对照组、模型组第4-13天给予等体积的生理盐水。每天观察小鼠生活状态并记录各组小鼠的体重。至第14天小鼠空腹24h，称量体重，颈椎脱臼处死小鼠。无菌条件下完成脾脏、胸腺的分离，并对多余的筋膜和组织进行剔除，然后称重，计算相关指数。
[0083]
除上述实验外还通过以下验证所述纳米粒子免疫增强效果：通过脾脏淋巴细胞增值实验和cck-8试剂盒在570nm进行吸光度值的检测；通过巨噬细胞吞噬实验，计算吞噬百分率(％)和吞噬指数(％)；通过elisa法检测小鼠血清中ig g、ig m含量；通过肠道菌群及其代谢检测。
[0084]
通过以上得到如下实验结果：小鼠免疫力强弱顺序从弱至强为，模型组、低剂量纳
米粒子组、阳性对照组、中剂量纳米粒子组与高剂量纳米粒子组，中高剂量壳聚糖-虾青素纳米粒子的增强免疫的功能优于阳性对照组，壳聚糖-虾青素纳米粒子的增强免疫能力随浓度升高而升高，但是在浓度大于20mg/kg以后增强免疫效果不明显。
[0085]
综上所述，该壳聚糖-虾青素纳米粒子，通过良好的酸稳定性、温度稳定性和易吸收特性，解决了壳聚糖在调控机体免疫时，会诱导线粒体释放活性氧ros，进而激活nlrp3炎性小体的问题和虾青素单质不稳定，极易受到光照、温度、氧、离子强度以及金属离子等因素影响，发生氧化降解的问题，具有优异的增强免疫的效果。
[0086]
该种具有增强免疫功能壳聚糖-虾青素纳米粒子，可以应用于医用纳米食品开发中，开发针对老年人群的全营养配方的壳聚糖-虾青素医用食品，以混悬液、乳剂为载体，配方设计主要参考《食品安全国家标准一特殊医学配方食品通则》，优化配方和生产工艺，开发多系列增强免疫力医用食品。
[0087]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。