槟榔籽纳米纤维素-槲皮素复合物的制备方法

6.5，继续搅拌0.5h后，吸取2ml 6mg/ml槲皮素qt乙醇溶液缓慢滴入上述反应体系，继续搅拌8h。
13.三、qt标曲的制备；
14.四、负载能力和包封率测定。
15.优选的，所述槟榔籽纳米纤维素cnf的制备流程如下：
16.(1)槟榔籽的前处理；
17.采用cbe-5l亚临界流体萃取系统对槟榔籽粉末进行亚临界丁烷萃取脱脂处理；
18.(3)纤维提取；
19.将脱脂的槟榔籽粉以1:20的料液比加入到6％w/v的naoh溶液中，在70℃条件下浸泡2h纤维经真空过滤回收后，用去离子水多次洗涤至接近中性状态使用1.7％w/v，ph 5.0的naclo2溶液在70℃条件下搅拌1h以去除粗纤维中的木质素，漂白过程重复两次漂白后的纤维用大量的去离子水洗涤；
20.(3)酸处理；
21.采用酸水解去除微量矿物质和无定形纤维素，在80℃条件下，用1％-15％w/v不同浓度的h2so4处理纤维1h，在冰浴中终止过程，然后用蒸馏水连续洗涤沉淀至少5-7次，上述步骤后的沉淀物在去离子水在室温下透析3d，截留分子量14kda，然后25000g离心10min得到沉淀物；
22.(4)高压均质处理；
23.首先将0.3％w/v的上述处理所得纤维素10000g高速剪切5min，先在20mpa下循环3次，然后在50mpa的压力下循环5次。
24.优选的，所述qt标曲的制备用无水乙醇将qt分别配置成浓度为10-30μg/ml的溶液，然后使用紫外可见分光光度计进行测试，绘制标准曲线，得出关于浓度与吸光度之间的线性回归方程进行分析。
25.优选的，所述负载能力测定过程如下，精确称取10mg样品于离心管，加入20ml无水乙醇振荡1h，将悬浮液通过0.22μm的聚偏二氟乙烯膜过滤器，使用紫外分光光度计在373nm处测定所得溶液，计算负载能力。
26.优选的，所述包封率测定过程如下，精确称取10mg样品于离心管中，加入20ml去离子水，将悬浮液在25000g离心10min去除没有包封的qt，去掉上清液，向沉淀物中加入20ml无水乙醇振荡1h，将悬浮液通过0.22μm的聚偏二氟乙烯膜过滤器，使用紫外分光光度计在373nm处测定所得溶液，计算包封率。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果是：该槟榔籽纳米纤维素-槲皮素复合物的制备方法，
28.1、主要以废弃物槟榔籽为原料，通过化学预处理耦合机械处理的方法制备cnfs，利用槟榔籽cnfs作为载体对活性功能成分qt进行负载包封改善qt的化学稳定性，开发出储存稳定性高、抗氧化性强、抗菌能力出色、载药率和包封率高的cnf/qt复合物的二元体系，以期为槟榔产业废弃物的高值化利用提供理论依据，对qt等其他活性成分的高效递送体系的开发提供新思路，进一步推进我国槟榔产业发展，促进其在功能食品和药品等领域开发和利用；
29.2、针对槟榔籽纤维素含量高这一特点，制备槟榔籽纳米纤维素(cnfs)并探究其用
于活性成分负载，将最佳制备条件下所获得的cnf作为qt的载体，以qt负载率和包封率为参考，探究cnf负载qt的最适条件，利用dpph自由基、abts自由基体系和抑菌圈法等对cnf/qt复合物的抗氧化性、抑菌活性、储存稳定性和缓释性能为活性物质的高效递送和利用提供理论依据，解决槲皮素等活性物质受限于水溶性和生物利用度较低、化学性质不稳定的问题同时拓宽槟榔籽纤维素的应用领域。
附图说明
30.图1为本发明纳米纤维素-槲皮素复合物主要技术示意图；
31.图2为本发明qt的标准曲线示意图；
32.图3为本发明不同zn2+浓度cnf-zn-qt复合物的负载率和包封率示意图；
33.图4为本发明不同qt浓度纳米cnf-zn-qt复合物的负载率和包封率示意图；
34.图5为本发明qt吸收光谱示意图；
35.图6为本发明cnf-qt吸收光谱示意图；
36.图7为本发明cnf-zn-qt吸收光谱示意图；
37.图8为本发明qt、cnf/qt复合物中间产物、cnf/qt复合物的红外光谱示意图；
38.图9为本发明qt、cnf/qt复合物的x衍射图谱示意图；
39.图10为本发明cnf和cnf/qt复合物的xps光谱示意图；
40.图11为本发明cnf和cnf/qt复合物的zn2p光谱示意图；
41.图12为本发明cnf和cnf/qt复合物的c1s光谱示意图；
42.图13为本发明qt和cnf/qt复合物的tg曲线示意图；
43.图14为本发明qt和cnf/qt复合物的dtg曲线示意图；
44.图15为本发明不同浓度qt和cnf/qt复合物的dpph自由基清除能力示意图；
45.图16为本发明不同ph条件下qt和cnf/qt复合物的dpph自由基清除能力示意图；
46.图17为本发明不同浓度qt和cnf/qt复合物的abts自由基清除能力示意图；
47.图18为本发明qt和cnf/qt复合物的释放曲线示意图；
48.图19为本发明不同浓度qt和cnf/qt复合物处理大肠杆菌的抑菌圈直径示意图；
49.图20为本发明不同浓度qt和cnf/qt复合物处理金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径示意图；
50.图21为本发明qt和cnf/qt的储存稳定性分析示意图。
具体实施方式
51.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
52.请参阅图1-21，本发明提供以下技术方案：一种槟榔籽纳米纤维素-槲皮素复合物的制备方法；
53.所述制备方法具体如下：
54.槟榔籽纳米纤维素cnf的制备；
55.(1)槟榔籽的前处理；
56.采用cbe-5l亚临界流体萃取系统对槟榔籽粉末进行亚临界丁烷萃取脱脂处理；
57.(4)纤维提取；
58.将脱脂的槟榔籽粉以1:20的料液比加入到6％w/v的naoh溶液中，在70℃条件下浸泡2h纤维经真空过滤回收后，用去离子水多次洗涤至接近中性状态使用1.7％w/v，ph 5.0的naclo2溶液在70℃条件下搅拌1h以去除粗纤维中的木质素，漂白过程重复两次漂白后的纤维用大量的去离子水洗涤；
59.(3)酸处理；
60.采用酸水解去除微量矿物质和无定形纤维素，在80℃条件下，用1％-15％w/v不同浓度的h2so4处理纤维1h，在冰浴中终止过程，然后用蒸馏水连续洗涤沉淀至少5-7次，上述步骤后的沉淀物在去离子水在室温下透析3d，截留分子量14kda，然后25000g离心10min得到沉淀物；
61.(4)高压均质处理；
62.首先将0.3％w/v的上述处理所得纤维素10000g高速剪切5min，先在20mpa下循环3次，然后在50mpa的压力下循环5次；
63.槟榔籽纳米纤维素/槲皮素复合物(cnf/qt)复合物的制备；
64.cnf-zn-qt复合物:10ml样品溶液(0.3％w/v)和1.5ml七水合硫酸锌(10、20、30、40mm)在室温下磁力搅拌0.5h；然后，吸取1.5ml 3-吗啉丙磺酸(mops)缓冲液(50mm，ph 6.5)加入反应体系，继续搅拌0.5h后，吸取2ml qt乙醇溶液(2、4、6、8mg/ml)缓慢滴入上述反应体系，继续搅拌8h；
65.cnf-qt复合物:10ml样品溶液(0.3％w/v)和1.5ml去离子水在室温下磁力搅拌0.5h；然后，吸取1.5ml mops缓冲液(50mm，ph 6.5)加入反应体系，继续搅拌0.5h后，吸取2ml 6mg/ml qt乙醇溶液缓慢滴入上述反应体系，继续搅拌8h；
66.qt标曲的制备：
67.用无水乙醇将qt分别配置成浓度为10、15、20、25和30μg/ml的溶液，然后使用紫外可见分光光度计进行测试，绘制标准曲线，得出关于浓度与吸光度之间的线性回归方程：y＝0.0666x+0.0893，r2＝0.9985，结合图2所示，由线性回归方程可知qt线性关系良好；
68.以负载率和包封率作为评价指标，制备纳米纤维素-zn-槲皮素(cnf-zn-qt)二元体系较适合的条件是：20mm zn2+和6mg/ml槲皮素(qt)。在该条件下，cnf-zn-qt复合物的负载率为17.48
±
1.77％，包封率为90.42
±
5.41％。
69.通过紫外可见光谱(uv-vis)、ftir、xrd、x射线光电子能谱(xps)对cnf/qt复合物结构表征，再评价复合物的抗氧化性、抑菌活性、储存稳定性和缓释性能。ftir、xps、xrd的结果表明cnfs基质通过氢键包封qt，包封的qt的结晶度下降，cnf-zn-qt复合物中qt上的羟基发生红移。从性质评价的结果显示，cnf/qt复合物比游离qt对dpph自由基、abts自由基产生更强的清除作用，并且抗氧化能力受ph影响较小；在浓度为800μg/ml时，cnf-zn-qt复合物对大肠杆菌的抑菌圈直径13.15
±
0.59mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌直径为16.98
±
0.36mm，储存22d后cnf-zn-qt的qt保留指数(40％)是游离qt的2倍左右；cnf-zn-qt复合物的释放速率大幅度减缓。
70.负载能力和包封率测定：
71.精确称取10mg样品于离心管，加入20ml无水乙醇振荡1h，将悬浮液通过0.22μm的聚偏二氟乙烯膜过滤器，使用紫外分光光度计在373nm处测定所得溶液，按照以下公式计算负载能力：
[0072][0073]
精确称取10mg样品于离心管中，加入20ml去离子水，将悬浮液在离心10min(25000g)去除没有包封的qt，去掉上清液，向沉淀物中加入20ml无水乙醇振荡1h，将悬浮液通过0.22μm的聚偏二氟乙烯膜过滤器，使用紫外分光光度计在373nm处测定所得溶液，按照以下公式计算负包封率：
[0074][0075]
高负载能力和包埋效率是递送体系的先决条件，如图3所示，cnf-zn-qt复合物的负载能力和包封率在zn2+浓度大于10mm后，随着离子浓度的增大，包封率和负载率没有显著变化，这是因为主要是qt上a环的羟基和zn2+发生分子间相互作用，例如配位键，反应主要受活性羟基的的数量控制；
[0076]
如图4所示，cnf-zn-qt复合物的负载率随qt浓度的增大而升高，但是包封率在qt浓度6mg/ml时最佳，可能是因为cnf、qt、zn2+之间形成的氢键有限，当qt浓度进一步提高时空间位阻增大，导致了包封率下降；
[0077]
综合考虑，cnf负载qt较适合的条件是：zn2+浓度20mm，qt浓度6mg/ml；
[0078]
槟榔籽纳米纤维素/槲皮素复合物的紫外可见光谱分析：
[0079]
图5-7分别对应qt及其cnf/qt复合物从300到500nm的紫外-可见光谱扫描；在该波长范围内，在372nm处显示吸收带与π
→
π*跃迁相关并归属于qt的b环吸收，255nm吸收带归因于qt a环的π
→
π*、n
→
π*和n
→
σ*跃迁，可以看到cnf-zn-qt在370nm处的吸收带移动到更高的波长，而cnf-qt没有发现变化，可能是由于zn2+和qt分子之间的电子重新分布导致的，这种向更长波长移动的红移现象可归因于qt分子上的3-羟基和4-羰基，qt的3位的羟基具有较多的酸性质子，因此该3-羟基和4-羰基更容易金属离子发生反应；
[0080]
槟榔籽纳米纤维素/槲皮素复合物的傅里叶红外光谱分析：
[0081]
如图8所示，ftir光谱显示，与qt相比cnf/qt复合物会引起振动光谱的重要变化；在下图的光谱中1643cm-1和1509cm-1处的尖锐吸收带被分配给＝co的拉伸振动；与游离qt相比，观察到该峰强度的下降表明该基团参与了zn2+离子的配位；1417cm-1处下移的强吸收带可归因于-oh振动模式，表明该基团参与了zn2+离子的配位；与游离qt位于1262cm-1左右的c-o-c相比，发现特征吸收峰(c-o-c)振动略有偏移，表明由于金属配位导致键序增加；复合物中qt的特征峰强度显著减弱，这可能是由于qt被cnfs基质通过氢键包封；
[0082]
槟榔籽纳米纤维素/槲皮素复合物的x衍射分析：
[0083]
如图9所示，qt在11.18
°
、12.75
°
、16.75
°
、21.82
°
、25.17
°
和26.27
°
处有明显的、强度相对较大的衍射峰，表明qt本质上是高度结晶的；在qt复合物中，cnf的衍射峰占主导，qt的尖锐特征峰在cnf/qt复合物中的消失或者减弱，表明结晶度降低，qt将保持无定形状态，封装在纤维素分子中时qt的结晶度会降低；这些结果与pralhad等人的报道相似，此外，在14.0
°
和26.4
°
观察到属于qt弱的衍射峰，特别是cnf-zn-qt，表明qt在在cnf载体负载过程
中存在低结晶度-组装过程；
[0084]
槟榔籽纳米纤维素/槲皮素复合物的x射线光电子能谱分析；
[0085]
图10显示所有样品中存在o1s和c1s，分别对应于531.75、284.77ev的结合能，与qt和cnf-qt相比，从图11可以看到cnf-zn-qt中zn2p的存在，可以说明zn2+参与cnf-zn-qt的合成；图12可以清晰的看到，所有样品存在2个典型峰，与cnf相比，复合物的两个峰的相对强度发生变化，说明c1s中包含的典型峰c-o(286.3ev)、o-c-o或＝co(287.8ev)、c-c(284.6ev)的相对含量发生了变化，这可能是qt上的苯环结构导致的；
[0086]
槟榔籽纳米纤维素/槲皮素复合物的热稳定性分析：
[0087]
样品的热重曲线(tg)和微熵热重分析曲线(dtg)热分析图如图13-14所示，tg图表示加热过程中复合物的重量损失与温度的关系；复合物的热分解模式取决于它们的成分，qt的初始降解温度较高(345℃)，cnf-qt和cnf-zn-qt的初始分解温度大概在318℃和297℃左右；qt在100℃由一个尖锐的小峰，可能时qt受潮导致的；qt、cnf-qt和cnf-zn-qt在600℃时质量损失约为60％、80％、93％；与qt相比，cnf/qt复合物每个阶段的最大热分解速率降低；这是因为cnf具有较好的耐热性，导致复合物的热稳定性有所提升；
[0088]
槟榔籽纳米纤维素/槲皮素复合物抗氧化能力分析：
[0089]
抗氧化活性由稳定的自由基疏水自由基dpph和亲水自由基abts+决定，dpph自由基的反应涉及h原子转移，abts+自由基的反应涉及电子过程；
[0090]
如图15所示，评估了qt和cnf/qt复合物在不同浓度下的dpph自由基清除活性，dpph是一种稳定的自由基，可通过氢原子或电子的转移被抗氧化化合物还原；qt通过提供氢原子来稳定自由基，在其结构的芳环中存在活性羟基，从而显示出高效的自由基消除效率(souza et al.,2014)，qt和cnf/qt复合物随着浓度的增大，dpph自由基清除能力增强；与qt相比，cnf-qt和cnf-zn-qt的dpph自由基清除能力显著增强，尤其是zn2+参与制备的复合物；结果表明，cnf/qt复合物可以有效增强qt的生物活性，可能是qt被cnfs负载后，其结晶性发生改变，qt的水溶性提高导致的；
[0091]
如图16所示，评估了qt和cnf/qt复合物在不同ph条件下的，结果表明，所用样品均在中性和弱酸性环境下显示更强的dpph自由基清除活性，cnf/qt复合物无论是在强酸性环境还是微酸性或近中性环境下对自由基的清除能力都要优于纯qt，受环境变化影响较小；
[0092]
如图17所示，abts+自由基的自由基清除活性是最常用的自由基链式反应体系(yan-ru et al.,2014)，abts+自由基阳离子测定可用于研究抗氧化剂的总抗氧化活性；qt的抗氧化活性是通过abts+自由基阳离子的脱色(还原)来确定的；qt的abts+清除能力归因于环b中的一些羟基提供h+离子的能力；总体而言cnf/qt复合物的abts+清除能力强于游离qt；综合来说，cnf/qt的抗氧化能力优于qt；
[0093]
槟榔籽纳米纤维素/槲皮素复合物体外释放率测定：
[0094]
图18显示了使用透析法在35％无水乙醇和65％去离子水的混合溶液中研究了槲皮素的体外释放；游离qt在前5h内表现出相对较快的释放，随后是缓慢释放；与前5h内qt的累积释放率为77.24％；cnf/qt复合物的释放速率缓慢，25h后释放率不足40％；与cnf-qt相比，cnf-zn-qt的释放速率更为缓慢，可能是因为qt主要是松散的附着在cnf-qt表面，包封紧密的qt分子较少；zn2+与qt的表观形成常数为4.8左右，亲和力较高，所以qt从cnf-zn-qt释放出来的速率更为缓慢；
[0095]
槟榔籽纳米纤维素/槲皮素复合物抑菌性分析：
[0096]
qt和cnf/qt复合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径如图19-20所示，从图上可以清晰地看到，无论是大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌cnf/qt复合物尤其是cnf-zn-qt的抑菌能力菌活性优于游离的qt，可能归因于它们的缓释特性，纳米cnf/qt复合物的缓慢释放可以有效地持续抑制细菌的生长；由于细胞膜通常是负电荷的，cnf-zn-qt表面正电荷可能促进qt与大多数细菌的细胞膜的相互作用；在浓度为800μg/ml时，cnf-zn-qt对大肠杆菌的抑菌圈直径13.15
±
0.59mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌直径为16.98
±
0.36mm，说明该复合物对革兰氏阳性菌的抑菌作用强于革兰氏阴性，这和qt本身的特性有关；综上，cnf/qt复合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有令人满意的抗菌性能；
[0097]
槟榔籽纳米纤维素/槲皮素复合物储存稳定性分析：
[0098]
图21显示了qt和cnf/qt复合物在室温下长达22d的储存稳定性，如图所示，随着储存时间的增加，qt保留指数逐渐下降，这归因于qt对光和氧气十分敏感；qt的保留指数在22d内呈递减顺序：cnf-zn-qt》cnf-qt》qt，因此，可以推断cnf-zn-qt复合物的稳定性优于cnf-qt，其次是qt；游离qt保留指数在前5d迅速下降，22d以后qt溶液中仅保留约20％的qt；该结果表明将qt负载到cnf中可保护qt免于降解；
[0099]
以负载率和包封率作为参考指标，cnf-zn-qt较适合的条件是：zn2+浓度20mm；qt浓度6mg/ml；结构分析显示qt被cnfs基质通过氢键包封，cnf-zn-qt复合物的中qt的结晶度下降；cnf/qt复合物的抗氧化性能优于qt，cnf-zn-qt(800μg/ml)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为13.15
±
0.59mm、16.98
±
0.36mm、储存22天后qt保留指数为40％，且qt释放速率明显减缓。
[0100]
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术，尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。