一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性蛋白的方法

1.本发明涉及食品加工技术领域，特别是涉及一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性蛋白的方法。


背景技术：

2.牛乳制品是婴幼儿重要的食物蛋白来源，酪蛋白(casein，cn)作为牛乳中一种主要蛋白，占牛乳蛋白的80％，酪蛋白由αs1-cn、αs2-cn、β-cn、κ-cn组成，是一种全价蛋白(包含人体无法合成的8种必需氨基酸)，是天然的氨基酸宝库，具有极高的营养价值，目前已经被发现可以广泛防治骨质疏松与佝偻病，调节血压，作为液体稳定剂等，同时，由于其能促进常量元素(ca、mg)与微量元素(fe、z、cu、cr、se等)的高效吸收而被称为“矿物质载体”。
3.然而，牛乳被联合国粮农组织列为八大过敏原之一，调查显示多数婴幼儿对酪蛋白过敏，过敏人群食用可能诱发疾病，轻者红肿诱发疾病，严重时引起过敏性休克，危及生命。其中，αs1-cn被认为是引起牛乳过敏的主要过敏原之一。
4.现有技术主要是通过物理、化学、酶、基因工程等方法，修饰酪蛋白结构，进而达到改变酪蛋白致敏性的目的。cn 105211294 a发明专利中公开了一种利用高静压降低牛乳中酪蛋白致敏性的方法，仍然使用纯物理工艺，具有真空包装难度高、效率低、成本高等缺点。cn 114504051 a发明专利中公开了一种基于分子模拟的凝乳酶预处理高效降解酪蛋白抗原性的方法，使用的是酶法工艺，专一性强，但存在成本高、灭酶操作影响酪蛋白品质等缺点。因此，本领域急需一种既能有效降低致敏性，又能加速反应进程促进工业化生产，同时高效、绿色、低品质损失、风味更好更易被消费者接受的低致敏性酪蛋白粉制备方法。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供了一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性蛋白的方法。本发明提供的方法不仅有效降低致敏性，而且反应时间短，可促进工业化生产，是一种高效、绿色、低品质损失、风味更好更易被消费者接受的制备低致敏性酪蛋白的工艺方式。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供了一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性蛋白的方法，包括以下步骤：
8.将蛋白粉与水混合，得到蛋白液；
9.将所述蛋白液经冷等离子体处理，得到处理后的蛋白液；
10.将所述处理后的蛋白液和糖混合，得到混合液；
11.将所述混合液进行水浴加热30～60min，得到低致敏性蛋白。
12.优选的，所述冷等离子体处理的条件包括：采用介质阻挡放电技术的冷等离子体发生器，气源采用空气，电压为50～80v，功率为50～100w，处理时间为1～5min。
13.优选的，所述水浴加热的温度为50～80℃。
14.优选的，冷等离子体处理前蛋白液中蛋白粉的质量分数为1％～4％。
15.优选的，所述蛋白粉与糖的质量比为1:(1～2)。
16.优选的，所述蛋白粉包括酪蛋白粉。
17.优选的，所述水浴加热结束后还包括干燥处理；所述干燥处理包括冷冻干燥。
18.优选的，所述糖包括葡萄糖、半乳糖、果糖、乳糖和葡聚糖中的一种或多种。
19.有益效果：
20.本发明提供了一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性蛋白的方法，包括以下步骤：将蛋白粉与水混合，得到蛋白液；将所述蛋白液经冷等离子体处理，得到处理后的蛋白液；将所述处理后的蛋白液和糖混合，得到混合液；将所述混合液进行水浴加热30～60min，得到低致敏性蛋白。本发明提供了一种具有效果叠加的新型物理协同双改性方法，通过利用冷等离子体处理蛋白质后与多糖进行糖基化反应，实现物理手段与化学手段的叠加改性，不仅致敏性降低超过80％，效果显著，而且显著提升接枝率，加速了糖基化过程，缩短了反应时间促进工业化生产，操作简便符合未来大规模工业生产的需要，同时生产的低致敏性蛋白品质佳，风味好更易被消费者接受，生产过程无添加无污染，对食品品质无损失，是一种新型物理协同双改性的新方法，可应用于各类产品中，有利于提升过敏人群的酪蛋白摄入，有着巨大的应用前景。
具体实施方式
21.本发明提供了一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性蛋白的方法，包括以下步骤：
22.将蛋白粉与水混合，得到蛋白液；
23.将所述蛋白液经冷等离子体处理，得到处理后的蛋白液；
24.将所述处理后的蛋白液和糖混合，得到混合液；
25.将所述混合液进行水浴加热30～60min，得到低致敏性蛋白。
26.本发明将蛋白粉与水混合，得到蛋白液。在本发明中，所述蛋白粉优选包括酪蛋白粉；所述蛋白液中蛋白粉的质量分数优选为1％～4％，进一步优选为2％～4％，更优选为2％或4％。本发明将适宜质量的蛋白粉与水混合，可以使蛋白粉充分溶解在水中。
27.得到蛋白液后，本发明将所述蛋白液经冷等离子体处理，得到处理后的蛋白液。在本发明中，所述冷等离子体处理的条件优选包括：采用介质阻挡放电技术的冷等离子体发生器，气源采用空气，电压为50～80v，功率为50～100w，处理时间为1～5min；所述电压进一步优选为50v、60v、70v或80v，更优选为80v；所述功率进一步优选为80w；所述冷等离子体处理的时间进一步优选为2～5min，更优选为3min。本发明采用冷等离子体对蛋白液进行处理，绿色安全无污染，处理条件温和(大气条件下即可进行)，冷等离子体处理后的溶液因存在大量活性物质而处于高活性状态，使得该反应速度较快，加工成本低，并且不会影响酪蛋白的营养价值，符合现代绿色加工理念；且经过处理后的蛋白液在后续与糖发生糖基化反应时，因结构已经被活性物质催化氧化，而发生一定程度的展开，可以进一步加快糖基化进程、缩短反应时间、促进蛋白致敏性的进一步降低。本发明对所述介质阻挡放电技术的等离子体发生器的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。本发明实施例所使用的介质阻挡放电技术的冷等离子体发生器优选购自南京苏曼等离子体科技有
限公司，型号为dbd-50。
28.得到处理后的蛋白液后，本发明将所述处理后的蛋白液和糖混合，得到混合液。在本发明中，所述糖与所述蛋白粉的质量比优选为(1～2)：1，更优选为1:1；所述糖优选包括葡萄糖、半乳糖、果糖、乳糖和葡聚糖中的一种或多种，更优选为乳糖或果糖。本发明选择适宜量的糖与处理后的蛋白液混合，可以避免糖含量过低导致后续糖基化不充分，制得的低致敏性蛋白较未处理的蛋白致敏性降低不明显，也可以避免多糖质量分数过高导致多糖残留，影响低致敏性蛋白的品质。
29.得到混合液后，本发明将所述混合液进行水浴加热30～60min，得到低敏蛋白。在本发明中，所述水浴加热的时间优选为35～50min，更优选为40min；所述水浴加热的温度优选为50～80℃，进一步优选为55～70℃，更优选为60℃。本发明通过适宜的加热温度解决了温度过高，糖基化带来的颜色加深损伤酪蛋白粉品质，以及温度太低无法有效发生糖基化反应，致敏性降低效果不好的缺点。
30.在本发明中，所述水浴加热结束后优选还包括干燥处理；所述干燥处理优选包括冷冻干燥。本发明对所述冷冻干燥的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方法即可。
31.本发明提供的是一种具有效果叠加的新型物理协同双改性方法，不仅显著降低酪蛋白的致敏性，而且显著提升糖基化效率，加速糖基化进程，符合未来大规模工业生产的需要，同时处理过程无化学添加无食品污染，天然绿色，对酪蛋白品质无不良影响，蛋白粉品质好，风味更佳更易被消费者接受，可有效应用于各类产品中，有利于提高酪蛋白过敏人群的营养摄入，有着巨大的应用前景和社会价值。
32.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性蛋白的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
33.实施例1
34.一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性酪蛋白粉的方法，由以下步骤组成：
35.(1)将酪蛋白粉充分溶于蒸馏水中后，经冷等离子体处理；其中，等离子体采用介质阻挡放电技术的冷等离子体发生器，气源采用空气，电压为70v，功率为70w，处理时间为2min；酪蛋白粉溶于蒸馏水后的质量分数为2％；
36.(2)向步骤(1)预处理后的溶液中加入半乳糖，半乳糖与步骤(1)中的酪蛋白粉的质量比为1：1，并且使用磁力搅拌器搅拌均匀，得到混合液；
37.(3)将步骤(2)所得的混合液水浴加热40min，加热温度为60℃，后迅速冷冻干燥，即制得低致敏性酪蛋白粉。
38.实施例2
39.一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性酪蛋白粉的方法，由以下步骤组成：
40.(1)将酪蛋白粉充分溶于蒸馏水中后，经冷等离子体处理；其中，等离子体采用介质阻挡放电技术的冷等离子体发生器，气源采用空气，电压为80v，功率为60w，处理时间为3min；酪蛋白粉溶于蒸馏水后的质量分数为4％；
41.(2)向步骤(1)预处理后的溶液中加入乳糖，乳糖与步骤(1)中的酪蛋白粉的质量比为1：1.5，并且使用磁力搅拌器搅拌均匀，得到混合液；
42.(3)将步骤(2)所得的混合液水浴加热30min，加热温度为70℃，后迅速冷冻干燥，即制得低致敏性酪蛋白粉。
43.实施例3
44.一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性酪蛋白粉的方法，由以下步骤组成：
45.(1)将酪蛋白粉充分溶于蒸馏水中后，经冷等离子体处理；其中，等离子体采用介质阻挡放电技术的冷等离子体发生器，气源采用空气，电压为60v，功率为90w，处理时间为5min；酪蛋白粉溶于蒸馏水后的质量分数为1％；
46.(2)向步骤(1)预处理后的溶液中加入果糖，果糖与步骤(1)中的酪蛋白粉的质量比为1：2，并且使用磁力搅拌器搅拌均匀，得到混合液；
47.(3)将步骤(2)所得的混合液水浴加热60min，加热温度为50℃，后迅速冷冻干燥，即制得低致敏性酪蛋白粉。
48.实施例4
49.一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性酪蛋白粉的方法，由以下步骤组成：
50.(1)将酪蛋白粉充分溶于蒸馏水中后，经冷等离子体处理；其中，等离子体采用介质阻挡放电技术的冷等离子体发生器，气源采用空气，电压为80v，功率为100w，处理时间为1min；酪蛋白粉溶于蒸馏水后的质量分数为2％；
51.(2)向步骤(1)预处理后的溶液中加入葡聚糖，葡聚糖与步骤(1)中的酪蛋白粉的质量比为1：1，并且使用磁力搅拌器搅拌均匀，得到混合液；
52.(3)将步骤(2)所得的混合液水浴加热35min，加热温度为60℃，后迅速冷冻干燥，即制得低致敏性酪蛋白粉。
53.对比例1
54.一种与实施例1相似的方法，区别在于，经冷等离子体处理后的蛋白液直接冷冻干燥，得到低致敏性酪蛋白粉。
55.对比例2
56.一种冷等离子体协同糖基化修饰制备低致敏性蛋白粉的方法，由以下步骤组成：
57.(1)将酪蛋白粉和半乳糖充分溶于蒸馏水中后，得到混合液；酪蛋白粉溶于蒸馏水后的质量分数为2％，半乳糖溶于蒸馏水后的质量分数为5％；
58.(2)将步骤(1)所得的混合液水浴加热40min(水浴加热温度为60℃)，后迅速冷冻干燥，即制得低致敏性酪蛋白粉。
59.应用例1
60.致敏性降低表征：
61.采用间接竞争酶联免疫法分别测定实施例1～4和对比例1～2中低致敏性酪蛋白粉抗原量，并且换算成具体下降比例，具体操作步骤如下：
62.(1)间接竞争酶联免疫法：
63.具体操作方法参见【刘晓宇,李铮,张颖,布冠好,罗永康.酶解对牛乳酪蛋白抗原
性的影响[j].中国乳品工业,2011,39(02):27-30.】；
[0064]
(2)致敏性降低率计算：
[0065]
抗原抑制率＝(b
0-b)/b0×
100％
[0066]
式中：b与b0分别为被测样品与无竞争体系的吸光值。抗原抑制率与被测物的抗原量成正比，抗原抑制率越大，被测物的抗原量越大，致敏性降低效果越差。
[0067]
检测结果见表1。
[0068]
表1不同实施例制备的低致敏性酪蛋白中α-酪蛋白抗原性抑制率
[0069][0070]
由表1可知，本发明提供的方法制备得到的酪蛋白致敏性降低效果显著，α-酪蛋白抗原性抑制率均降低70％以上，效果优于单独使用冷等离子处理(对比例1)或糖基化修饰制备的酪蛋白粉(对比例2)，该结果表明开发的酪蛋白粉可有效降低致敏性，利于过敏人群的营养摄入，有着巨大的应用前景和社会价值。
[0071]
应用例2
[0072]
对实施例1～4和对比例1～2中低致敏性酪蛋白粉反应速率进行表征，具体如下：
[0073]
其反应速率大幅度提升采用糖基化度(dg)来进行表征，具体通过邻苯二醛(opa)测定游离氨基来进行表征，具体操作方法参见【许彩虹.大豆球蛋白糖基化接枝改性及其热聚集行为研究[d].华南理工大学,2010.】，检测结果见表2。
[0074]
表2不同实施例制备的低致敏性酪蛋白接枝度
[0075]
组别实施例1实施例2实施例3实施例4对比例1对比例2dg14.5％17.9％11.2％9.1％-6.1％
[0076]
由表2可知，本发明提供的方法制备得到的酪蛋白粉，同样的处理时间，酪蛋白粉糖基化程度更高，同时为达到相同糖基化程度，本方法所用时间大幅度短于单独使用糖基化修饰，进而促进致敏性大幅度降低，并且所使用的冷等离子体是一种高效、绿色、无添加、低能耗、简便的新兴技术，符合未来食品加工发展趋势，有利于未来大规模工业生产。
[0077]
应用例3
[0078]
由10名评价员从风味和口感方面两个方面对将实施例1～4和对比例1～2制备的低致敏性酪蛋白奶粉分别进行测评。风味和口感评分标准如表3所示，评分结果如表4所示。
[0079]
表3风味和口感评分标准
[0080]
风味口感评分无异味，奶香味浓绵软，适口，微甜a无异味，淡奶香味绵软，较适口，微甜b无异味，无奶香味发硬，较适口，微苦c无异味，无奶香味发硬，不适口，苦d
[0081]
表4风味和口感评分结果
[0082]
组别实施例1实施例2实施例3实施例4对比例1对比例2评分aabbdc
[0083]
由表4可知，本方法生产的酪蛋白粉风味好，口感佳，更易被消费者接受。
[0084]
综上所述，本发明提供的方法能显著降低酪蛋白致敏性，并且有效加速糖基化过程，提升效率，促进工业化生产，符合未来食品工业技术发展趋势，同时使用的冷等离子体技术绿色无化学添加无食品污染，对食品品质无损失，生产的蛋白粉品质好，风味更佳更易被消费者接受，是一种新型物理协同双改性的方法。
[0085]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。