一种美容养颜的中药花胶组合物及其制备方法与流程

1.本发明属于功能性食品领域，涉及一种美容养颜的中药花胶组合物及其制备方法。


背景技术：

2.精神状态可以反映出身体的健康情况，一个人如果气血充足，则神清气爽、思维敏捷、面色红润、皮肤光滑、毛发润泽、关节灵活；反之，就容易出现各种健康问题。中医理论认为气血亏虚可导致衰老，气虚则无力推动血液流动，导致血行不畅，血虚则不能充盈血脉，濡养头面，导致脸色暗哑无光。气血对皮肤的充养作用在《灵枢经
·
邪气脏腑病形篇》中有精辟的阐述：“十二经脉，三百六十五络，其血气皆上注于面而走空窍。”也就是说，经络把气血精微物质输送到皮肤，皮肤得养则红润；气血运行正常，濡养皮肤，则感觉灵敏。如气血生成不足或运行障碍，则表现为皮肤黯淡无光或萎黄、肌肤干燥、感觉异常。
3.生物体的衰老是不可抗拒的自然规律，影响衰老的因素很多，其中主要有遗传基因、饮食营养、生活方式、运动多少、心理状态、医疗条件及环境因素等。其中饮食营养是非常重要的因素，而且是可以控制的因素。
4.饮食美容，历史悠久。远在周代的时候,就有了食医(营养医生)；汉代名医张仲景的“猪肤方”指出猪蹄子上的皮肤有“和血脉，润肌肤”的作用；《神农本草经》有：常食冬瓜“令人悦泽好颜色”，认为莲子“久服轻身耐老，具有细嫩皮肤的作用
……”
；孙思邈的《备急千金要方》在论述谷、肉、果、菜等食物的药疗作用时，就论述了食物的美容和健美功效，为膳食美容和药膳美容提供了依据，奠定了基础。中医药基本理论重视人的生命美、内外兼调，且方法多样、它与生活美容相容，人本身是一个整体,人与自然、社会也是统一体,一个人身体健康,脏腑功能正常,其外在表现才能是皮肤红润、肌肉丰满、身体挺拔、动作矫健,从而给人以外形上的美感。
5.鱼加工过程中产生大约40％的副产物，其中鱼鳔约占1％，产量巨大。且鱼鳔富含胶质，胶原蛋白含量高达80％以上，且易于吸收和利用，它以水结合的形式贮存于人体组织中，从而改善组织的营养状况和新陈代谢。鱼鳔，即为花胶，具有良好的保健作用，能促进胃肠的消化吸收，提高食欲，防治厌食、消化不良、腹胀、便秘；能增加肌肉组织的韧性和弹力，增强体力，消除疲劳；还能滋润皮肤，使皮肤细腻光滑。
6.鱼胶在食品市场中常以干制品的形态出现，作为一些菜肴或是汤品成分之一要通过发制，或焗，或焖，或炒，或炖，从而烹饪成各种各样的美肴。发制鱼胶需要经过多道工序，整个过程比较麻烦、费时，且有一定的营养流失，以花胶配伍药食同源类中药，加工成即食产品的形式具有很大的市场潜力。开发一种食用携带方便味道可口，对气血不足、脾胃虚弱调理效果良好，同时可以改善由于气血不足、脾胃虚弱引起的免疫力低下、精神不振、面色不佳的状况，与此同时兼具养生保健、美容养颜功效适合女性服用的花胶产品十分必要。


技术实现要素：

7.本发明提供一种美容养颜的中药花胶组合物及其制备方法：
8.本发明提供一种美容养颜的中药花胶组合物，包括下列重量份的原料：花胶2～15份、赤小豆1～10份、薏苡仁1～9份、百合0.1～2份、人参0.1～6份、枸杞或黑枸杞0.1～12份、山楂0.1～12份、大枣1～5份。其中山楂可不入组方，枸杞为优选。
9.优选方案为花胶7份、赤小豆3.5份、薏苡仁3份、百合2份、人参0.75份、枸杞或黑枸杞0.5份、山楂0.4份、大枣2份。
10.本发明同时提供上述花胶组合物的制备方法：(1)花胶经过浸泡、脱腥处理后，备用；(2)赤小豆清洗浸泡12小时，再用沸水煮半小时，备用；(3)其他原料加水，备用；(4)将以上处理后的原料混合，于121℃流通蒸汽杀菌12～15分钟。其中人参切厚片，厚度约为2-4mm为优选方案。
11.本发明提供上述花胶组合物在口服美容品制备中的应用。
12.本发明中各原料组成特征介绍如下：本配方设计是依据中医辨证理论，在遵循传统中医药君臣佐使的方针下，结合现代医学研究，建立起独特的配方体系。中医药理论认为“由诸内而出之于外”，可以依靠食物来改善营养，然后泽及肌肤，晋代葛洪在《神仙传
·
刘根》中提到“草木诸药，能治百病，补虚驻颜”。面貌不仅仅是仪表上的精神面貌，而且还是反映健康的寒暑表。中医将人体后天摄取的营养物质以及这些营养物质在人体生命条件下表现出来的功能都归于气血范畴，《圣济总录》所言：“血气者，人之神。又心者，生之本，神之变，其华在面，其充在血脉，服药以驻颜色，当以益血气为先，倘不如此，徒区区于膏面染髭之术，去道远矣。”气血是中医美容的基础物质，它依赖于脏腑功能活动而产生，通过经络运行到皮肤，发挥其滋润、濡养和温煦的作用，以保持皮肤的红润、细腻和匀净。
13.本配方通过对人体由内而外的的调理来宣畅气血，祛腐生新润肤从而达到美容养颜的功效。本发明的产品，原料中的的赤小豆、薏苡仁、百合、人参、枸杞、山楂等均属于“药食同源”范畴，同时具有一定的药用功能，与花胶结合在脏腑协调作用下化生为气血后，借助遍布全身的经络系统上荣于皮毛，滋润、濡养和温煦皮毛、肌表，协同花胶补血益气、健脾行气、美容养颜、延缓衰老、增强免疫力、抗疲劳的功效。
14.本发明中各原料的药性、功效以及现代药理学研究的具体成果介绍如下：
15.花胶(鱼鳔)，味甘，性平，可滋阴养血、补肾固精。花胶(鱼鳔)素有“海洋人参”之喻，鱼鳔胶原蛋白多肽具有良好的吸湿和保水性能，可减轻紫外线辐射引起的损伤，其作用主要涉及增强免疫力、减少水分和脂质损失、促进抗氧化性、抑制糖胺聚糖增加、修复内源性胶原蛋白和弹性蛋白纤维、维持ⅲ型与ⅰ型比例等。
16.赤小豆，味甘、酸，平。归心、小肠经。具有利水消肿，解毒排脓的功能，可用于水肿胀满，脚气浮肿，黄疸尿赤，风湿热痹，痈肿疮毒，肠痈腹痛。赤小豆多酚提取物具有良好的dpph自由基清除能力、羟自由基清除能力和还原能力，具有显著性的抗氧化活性。
17.薏苡仁，味甘、淡，凉。归脾、胃、肺经。能够利水渗湿，健脾止泻，除痹，排脓，解毒散结。用于水肿，脚气，小便不利，脾虚泄泻，湿痹拘挛，肺痈，肠痈，赘疣，癌肿。近年来随着国内外学者对薏苡仁研究的逐渐深入，薏苡仁抗肿瘤、镇痛抗炎、调节糖脂代谢、增强免疫、降血压、抗氧化、抗衰老、美白等药理活性的报道相继出现。研究表明。薏苡仁总多酚包括结合型和游离型，有清除自由基、抗癌、增强免疫、降血压血糖、抗炎镇痛功能。
18.人参，味甘微苦，性平。归肺脾、心、肾经，大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津益血，安神益智。现代研究表明人参既可抑制自由基产生，也可直接对抗自由基对组织和细胞的损伤作用，或直接清除自由基，还可增强机体本身抗氧化系统的功能，从多个环节阻断自由基的损伤作用。人参皂苷rb1和rg1可促进细胞的新陈代谢，加快衰老皮肤细胞核酸和蛋白质的合成，同时增加皮肤中sod含量和活性，发挥其强大的抗氧化和清除自由基作用，减少脂质过氧化产物的沉积，恢复细胞正常生理功能，且人参皂苷还可刺激皮肤成纤维细胞的活性，促进胶原蛋白合成，使皮肤趋于年轻化，延缓皮肤衰老过程。
19.百合，味甘，性寒，归心、肺经，养阴润肺，清心安神。百合鳞茎中的黄酮类、黄烷醇、酚酸、酚酸甘油酯等均具有良好的抗氧化作用，这些化合物对dpph具有较好的清除作用。
20.枸杞，味甘，性平，归肝、肾经，滋补肝肾，益精明目。枸杞多糖是枸杞的主要化学成分，它可以通过清除自由基、增强酶活性、激活抗氧化应激通道等多个途径起到抗氧化的作用。研究表明，枸杞多糖对皮肤氧化损伤具有保护作用，增强血管内皮细胞sod活性，减缓质膜流动，减弱自由基对抗氧化酶所造成的损伤。
21.山楂，味酸、甘，微温。归脾、胃、肝经。具有消食健胃，行气散瘀，化浊降脂的功效。用于肉食积滞，胃脘胀满，泻痢腹痛，瘀血经闭，产后瘀阻，心腹刺痛，胸痹心痛，疝气疼痛，高脂血症。在一些体外研究中，各种山楂提取物均具有抗氧化活性，可能与山楂中的低聚原花青素和总黄酮有关。
22.有益效果
23.本发明提供的花胶组合物能够增强单用花胶的自由基清除能力与对hacat细胞的促进增殖，同时对h2o2损伤的hacat细胞具有较强的保护作用，人参和薏苡仁的组方能够对总方起到协同增效的作用。将花胶组合物灌胃于d-半乳糖诱导的衰老小鼠模型皮肤，小鼠血清与皮肤中的sod活力，皮肤中的hyp含量均显著增加(p＜0.01)，表征清除自由基活性与胶原蛋白含量的显著增强；同时小鼠血清与皮肤中的丙二醛含量显著下降，表明脂过氧化的显著改善。以上研究结果披露了本发明提供的花胶组合物的美容功效显著。
附图说明
24.图1体外抗氧化能力研究(n＝3)，其中a.总还原力，b.dpph自由基清除率，c.羟基自由基清除率
25.图2对hacat细胞存活率的影响(n＝5)
26.图3不同浓度h2o2对hacat细胞存活率的影响(n＝6)(与正常组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)
27.图4对h2o2诱导的hacat细胞氧化应激损伤的保护作用(n＝5)(与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)
28.图5小鼠血清及皮肤中的sod活力(n＝6)
29.图6小鼠血清及皮肤中的mda含量(n＝6)
30.图7小鼠皮肤中的hyp含量(n＝6)
31.(实施例5～7中，与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与空白组相比，
▲
p＜0.05，
▲▲
p＜0.01，
▲▲▲
p＜0.001)
具体实施方式
32.实施例1.花胶组合物的制备
33.步骤如下：按下述单方药味的重量称取原料：按下述单方药味的重量称取原料药，其中花胶即为鱼鳔：
34.(1)配方1：花胶2～15份、赤小豆1～10份、薏苡仁1～9份、百合0.1～2份、人参0.1～6份、枸杞或黑枸杞0.1～12份、山楂0.1～12份、大枣1～5份。
35.(2)配方2：花胶2～15份、赤小豆1～10份、薏苡仁1～9份、百合0.1～2份、人参0.1～6份、枸杞或黑枸杞0.1～12份、山楂0.1～12份。
36.(3)配方3：花胶7份、赤小豆3.5份、薏苡仁3份、百合2份、人参0.75份、黑枸杞0.5份、山楂0.4份、大枣2份。
37.(4)配方4：花胶7份、赤小豆3.5份、薏苡仁3份、百合2份、人参0.75份、枸杞0.5份、山楂0.4份。
38.(5)配方5：花胶7份、赤小豆3.5份、百合2份、人参0.75份、枸杞或黑枸杞0.5份、山楂0.4份。
39.(6)配方6：花胶7份、赤小豆3.5份、薏苡仁3份、百合2份、枸杞或黑枸杞0.5份、山楂0.4份、大枣2份。
40.(7)配方7：花胶7份、赤小豆3.5份、百合2份、枸杞或黑枸杞0.5份、山楂0.4份、大枣2份。
41.(8)配方8：花胶15份、人参8份、大枣8份、枸杞8份、桂圆8份。
42.实施例2.花胶组合物的制备，其步骤如下：
43.(1)按实施例1中配方称取各原料；
44.(2)花胶经过浸泡、脱腥处理后备用。
45.(3)赤小豆清洗浸泡12小时，再用沸水煮半小时，备用。
46.(4)其他原料清洗，加水，备用。
47.(5)将以上处理后的原料混合，于121℃流通蒸汽杀菌12～15分钟。
48.其中人参切厚片，厚度约为2-4mm为优选方案。
49.实施例3.供试品制备
50.本实施例为实施例4、5中体外抗氧化实验与细胞实验中供试品的制备办法，如下：按实施例1中配方称取各重量分数的原料，(1)花胶：将花胶切成1cm3×
1cm3的小块，与水按重量比为1:60混合，浸泡30min后进行打浆处理，制得花胶浆液；花胶浆液用醋酸调至ph值为1.5，调节温度至37℃，加入胃蛋白酶酶解1h，该酶解过程模拟花胶在胃液中的消化过程，花胶浆液备用。(2)赤小豆：将赤小豆清洗后，在40℃浸泡12小时，再用沸水煮半小时，备用。(3)其他药材：将其他药材清洗后，在40℃浸泡30分钟后，备用，其中人参切厚片，厚度约为2-4mm。(4)提取：将以上(1)～(3)步骤处理后的原料药材混合，加10倍水加热回流提取1h，滤过；将药渣合并，加10倍水加热回流提取1.5h，滤过；合并两次滤液；滤液经70℃减压浓缩至生药量为0.25g固体原药材/ml。(5)将(4)中浓缩液在121℃流通蒸汽杀菌12～15分钟，随后4℃10000rpm离心10min，收集上清液，冷冻干燥得冻干粉，备用。(6)临用前将冻干粉溶于相应溶剂中制备供试液。
51.其中设置花胶对照组，供试品制备方法如下：将花胶切成1cm3×
1cm3的小块，与水
按重量比为1:60混合，浸泡30min后进行打浆处理，制得花胶浆液；花胶浆液用醋酸调至ph值为1.5，调节温度至37℃，加入胃蛋白酶酶解1h，该酶解过程模拟花胶在胃液中的消化过程，花胶浆液备用；花胶浆液在121℃流通蒸汽杀菌12～15分钟，随后4℃10000rpm离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得冻干粉，备用；临用前将冻干粉溶于相应溶剂中制备供试液。
52.以下药效实验实验组为实施例1中配方3、4、5、6、7、8，以及花胶对照组(图中列为第9组)，按照实施例2、3制备所得供试品溶液。
53.实施例4.体外抗氧化作用研究
54.1.仪器bsa124s分析天平、bt-25s分析天平均购自德国sartorius公司，台式电动离心机(金坛市科析仪器有限公司)，hh-4数显恒温水浴锅(函华电器有限公司)，uv2800ah紫外可见分光光度计(美国unico公司)，超纯水仪(美国synergy公司，synergyuv)。
55.2.试剂1，10-菲啰啉一水(批号20180413)、七水合硫酸亚铁(批号20171130)、三氯乙酸(批号20180911)、三氯化铁(批号20140305)、铁氰化钾(批号20180814)均购自上海化学试剂研究所有限公司，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(批号h21m9v60449)均购自上海源叶生物科技有限公司，上述试剂均为分析纯；甲醇均为分析纯。
56.3.实验方法和结果
57.3.1铁氰化钾还原法测定还原能力
58.该反应依据产生普鲁士蓝的最大吸收峰在700nm处定量，首先，铁氰化钾与样品中的还原性物质反应，生成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾与六水氯化高铁反应产生蓝色物质——普鲁士蓝，蓝色深浅程度或者吸光度值大小表现出样品的抗氧化能力，吸光度值越大、生成的普鲁士蓝越多，表明还原能力越强。实验方法如下：
59.3.1.1供试品溶液的制备
60.称取各实验组冻干粉用纯水配制成7.5mg冻干粉/ml的溶液，充分混匀后5000rpm/min离心20min，取上清液，逐级稀释至5、3、2、1mg/ml，待测。
61.3.1.2对照品溶液的制备
62.称取2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，bht)用无水乙醇溶液配制成7.5mg/ml的母液，无水乙醇逐级稀释得到5、3、2、1mg/ml，待测。
63.3.1.3还原能力体系反应溶液的制备
64.1％铁氰化钾溶液：称取1g ar级六氰合铁(ⅲ)酸钾，纯水完全溶解，定容至100ml容量瓶，备用；
65.10％的三氯乙酸(trichloroacetic acid solution，tca)：称取10g ar级三氯乙酸于烧杯中，纯水完全溶解后，转移并定容至100ml容量瓶，备用；
66.0.1％fecl3：称取40mg ar级fecl3·
6h2o，纯水溶解，定容至25ml容量瓶，备用。
67.3.1.4测定方法
68.各取1ml供试品溶液和对照品溶液和2.5ml pbs于试管中，加入铁氰化钾1ml，50℃水浴20min，急速冷却，再加入2.5ml tca于台式电动离心机中离心10min，转速为3500r/min，取上清液2.5ml于新的离心管，依次加入2.5ml纯水和0.5ml fecl3，静置10min，测定700nm波长下的吸光度值为a1，纯水代替fecl3溶液测得的吸光度值为a2，每个样本平行3份。
按式1计算样品的还原能力。
69.还原能力＝a
1-a2ꢀꢀꢀ
(式1)
70.3.2dpph法测定dpph自由基清除率
71.dpph
·
是一种稳定的以氮为中心的自由基，其不同浓度的乙醇溶液呈现不同程度的紫色，在517nm处表现出不同的吸收强度。所以当向dpph
·
的乙醇溶液中加入待测物后，若待测物能清除dpph
·
，则表现为在517nm处的吸收强度不断减弱，直至稳定。因此，加入待测物后，在517nm处可以动态检测其对dpph
·
的清除效果。
72.3.2.1供试品溶液制备
73.称取各实验组冻干粉用纯水配制成7.5mg冻干粉/ml的溶液，充分混匀后5000rpm/min离心20min，取上清液，逐级稀释至5、3、2、1、0.6、0.3mg/ml，待测。
74.3.2.2对照品溶液制备
75.称取bht用无水乙醇配制，得到0.3、0.6、1、2、3、5、7.5mg/ml不同浓度的bht溶液，待测。
76.3.2.3测定方法
77.将2ml待测液与2ml 0.08mg/ml的dpph无水乙醇溶液混合均匀，室温条件下，避光反应30min。3000r/min离心10min，在517nm波长处测定吸光度值。dpph自由基的清除率公式如下：
78.dpph自由基清除率＝1-(a
i-aj)/a0×
100％
ꢀꢀꢀ
(式2)
79.式中：ai——2ml样品溶液+2ml dpph无水乙醇溶液的吸光度值；
80.aj——2ml样品溶液+2ml无水乙醇的吸光度值；
81.a0——2ml样品溶剂+2ml dpph无水乙醇溶液的吸光度值
82.3.3邻二氮菲-铁氧化法测定羟基自由基清除率
83.邻二氮菲与硫酸亚铁中fe
2+
络合产生红色络合物，该络合物在536nm左右有最大吸收峰。双氧水在该体系中提供羟基自由基，后者与邻二氮菲-二价铁反应生成邻二氮菲-三价铁，使得吸光度值降低。当存在抗氧化物质时，将会阻止体系吸光度值的降低，吸光度值增加。因此吸光度值越大
·
oh的清除能力越强。
84.3.3.1供试品溶液的制备
85.称取各实验组冻干粉用纯水配制成4mg冻干粉/ml的溶液，充分混匀后5000rpm/min离心20min，取上清液，逐级稀释至2、1、0.5、0.25mg/ml，待测。
86.3.3.2对照品溶液制备
87.称取bht用无水乙醇配制，得到0.25、0.5、1、2mg/ml不同浓度的bht溶液，待测。3.3.3羟基自由基反应体系溶液的制备
88.0.75mmol/l硫酸亚铁：称取20.85mg的feso4
·
7h2o加纯水完全溶解后定容至100ml容量瓶，备用；
89.0.75mmol/l邻二氮菲溶液：称取14.87mg的1,10-菲啰啉,一水加无水乙醇充分溶解后定容至100ml容量瓶，备用；
90.0.01％的双氧水：30％双氧水稀释3000倍即得。冰水中避光放置，备用，现配现用。
91.3.3.4测定方法
92.在10ml离心管中依次加入1ml邻二氮菲溶液、2ml pbs(ph 7.40)、1ml去离子水、
1ml硫酸亚铁和1ml双氧水混匀，37℃水浴60min，用紫外分光光度计在190-800nm波长范围内(以样品溶剂作为参比溶液调零)扫描，观察最大吸收峰的波长，该波长下的吸光度值为a2；用样品溶剂代替1ml纯水扫描，观察吸收峰是否消失，若消失，则该波长处的吸光度值为a3；用样品溶液代替1ml纯水测得的吸光度值为a1，每个样本平行3份。按下式计算羟基自由基清除率：
93.羟基自由基清除率＝(a
1-a3)/(a
2-a3)
×
100％
ꢀꢀꢀ
(式3)
94.结果见图1，各实验组均具体外自由基清除能力且呈剂量依赖，配方3和4的自由基清除能力强于其他实验组，也优于花胶对照组与已公开的配方组(配方8)，其中尤以配方4为更优，表明配方3和4的组方能够增强单用花胶的自由基清除能力，也表明人参和薏苡仁的组方能够对总方起到协同增效的作用。
95.实施例5.对皮肤细胞的保护作用研究
96.1.仪器
97.bsa124s分析天平、bt-25s分析天平均购自德国sartorius公司，台式电动离心机(金坛市科析仪器有限公司)，hh-4数显恒温水浴锅(函华电器有限公司)，sw-cj-if超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，二氧化碳培养箱(德国memmert公司，inco108)，xd-202倒置光学显微镜(南京江南永新光学有限公司)，sx-500型高压蒸汽灭菌锅(日本tomy公司)，synergy
tm
h1全功能酶标仪(美国biotek公司)，超纯水仪(美国synergy公司，synergyuv)。
98.2.试剂
99.30％双氧水(批号20160325，国药集团化学试剂有限公司)，十二烷基硫酸钠sds(批号l0091fn0802d09)，维生素c(批号j21s9r70775)，dmem培养液(批号8118399)、磷酸盐缓冲液(pbs，批号8118147)、胰酶(批号2008319)、胎牛血清(批号42q3180k)均购自美国gibco公司，青霉素-链霉素(批号c0222，上海beyotime公司)，二甲基亚砜(dmso，批号c0222wxbc6681v，美国sigma-aldrich公司)，cell couting kit-8(批号k10183133ef5e，美国apexbio生物科技有限公司)
100.3.细胞株
101.人永生化角质形成细胞(hacat细胞)，购自江苏凯基生物股份有限公司。
102.4.实验方法和结果
103.4.1对hacat细胞存活率的影响
104.4.1.1溶液的配制
105.不完全培养液：dmem培养液加入1％的青霉素-链霉素溶液，混匀；
106.完全培养液：上述不完全培养液加入10％胎牛血清，混匀；
107.pbs加入1％的青霉素-链霉素溶液，混匀；
108.供试品溶液：称取各实验组冻干粉用含0.1％dmso的不完全培养液完全溶解，过0.22μm滤膜，即得；
109.对照品溶液：阳性药物vc和sds母液均用含有0.1％dmso的不完全培养液配制；
110.cck-8溶液：取不完全培养液，cck-8体积比为10:1的比例混合。
111.4.1.2hacat细胞培养和传代
112.hacat细胞装在含有完全培养液的培养瓶中，放入二氧化碳培养箱培养48h，待细
胞生长密度达到80-90％时用细胞消化液消化并传代继续培养，待细胞状态良好并呈指数增长时用来做后续实验，细胞复苏后至少传代两次方可进行实验。
113.4.1.3种板
114.收集对数期细胞，吹打混匀，取10μl在细胞计数板上，在倒置显微镜下计数，计算所需的细胞悬液，取细胞悬液加入完全培养液稀释至每孔含有10000个细胞，吹打均匀，每孔加入100μl细胞悬液(调零组不加)，96孔板外围每孔加100μl的pbs，在二氧化碳培养箱中孵育24h。
115.4.1.4给药
116.hacat细胞培养至细胞贴壁后，用移液枪将各孔内的培养基吸出，每孔各加入100μl不同的样品溶液，同时设正常组(加样品溶剂)，于二氧化碳培养箱中孵育24h。
117.4.1.5cck-8法检测细胞活力
118.弃去旧培养基，每孔加入100μl单培洗2次，避光条件下，每孔快速加入110μl cck-8溶液，外围用100μl的pbs补足，反应1h后，用酶标仪于450nm(参比630nm)处检测各孔的吸光度a，按(公式4)计算细胞存活率。细胞相对存活率＝(a
给药组-a
调零组
)/(a
正常组-a
调零组
)
×
100％(公式4)
119.由图2可知各配方样品组均对hacat细胞具有促进增殖的作用，其中以配方4对hacat细胞的促进增殖作用最为显著。
120.4.2对h2o2诱导的hacat细胞氧化应激损伤的保护作用
121.4.2.1h2o2浓度的筛选
122.设置9个不同浓度梯度的h2o2，并设置正常组和调零组，每个浓度设定5个复孔放置于co2培养箱中培养24h。由图3中结果可知随着h2o2浓度的上升，hacat细胞的存活率呈下降趋势，鉴于此，本实验选择0.95mm的h2o2诱导hacat细胞的氧化应激损伤进行建模。
123.4.2.2对h2o2诱导的hacat细胞氧化应激损伤的保护作用
124.hacat细胞给药24h后各孔加入50μlh2o2共孵育4h进行建模(正常组不建模，加不完全培养液)。由图4中结果可知，配方3～6给药组在各个样品均表现为对模型组显著的差异(p＜0.05)，其中配方4组作用于损伤的hacat细胞存活率最高，可见对h2o2损伤的hacat细胞具有较强的保护作用。
125.实施例6.抗衰老功效评价
126.1.仪器与材料
127.1.1仪器
128.酶标仪(德国synergy公司)，高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，冷冻离心机(上海宝赛生物科技有限公司)，hh-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)，bt25s电子天平(德国赛多利斯公司)，超声波清洗机(南京以马内利公司)，组织匀浆机(凯杰有限公司)，uv2800ah紫外可见分光光度计(美国unico公司)，涡旋仪，孵育箱(南京科尔仪器设备有限公司)，手术刀、手术镊、移液器、纱布、1ml注射器。
129.1.2试剂
130.水，医用酒精(山东利尔康医疗科技股份有限公司)，硫化钠(上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20180820)，d-半乳糖(北京索莱宝科技有限公司,批号：1013g051)，0.9％氯化钠注射液辰欣药业有限公司，批号：1801160723)，bca蛋白浓度测定试剂盒(批号：
20190423)、超氧化物歧化酶(sod)试剂盒(批号：20190420)、丙二醛(mda)试剂盒(批号：20190328)、羟脯氨酸(hyp)试剂盒(批号：20190420)均购于南京建成生物工研究所。
131.1.3动物
132.洁净级雌性的昆明种小鼠(体重18-22g)，购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可证编号scxk(沪)2018-0004；小鼠饲养环境舒适安静,室温(25
±
1)℃，小鼠能自在饮水摄食、无其余任何不良因素影响。
133.1.4动物分组
134.洁净级昆明种小鼠适应性饲养一周后，先用手术剪剪去小鼠背部的毛发，再10％硫化钠涂在小鼠背部进行脱毛处理，随机分为7组：空白组、模型组、配方3、4、7、花胶对照组(列为第9组配方)，其中阳性为维生素c。
135.1.5d-半乳糖诱导的衰老小鼠模型构建及给药
136.脱毛处理后的小鼠需观察其皮肤状态，适应性饲养三天无特殊反应后建立小鼠衰老模型，具体方法：每天给小鼠颈背部皮下注射剂量为1000mg/kg的d-半乳糖，连续注射42天。空白组每天皮下注射等剂量的生理盐水。从造模第一天开始，进行灌胃给药，按表1中方案给药。
137.实验42天后，给小鼠禁食12h后眼眶取血或摘小鼠眼球取血，取血完后处死；用手术剪快速取下背部脱毛处的皮肤，去除皮下脂肪，用生理盐水冲洗后再用滤纸吸去残余的水分，-20℃冰箱保存，用于制备皮肤组织匀浆。
138.表1给药方案
139.组别造模物受试物给药量/天空白组0.9％的氯化钠溶液纯化水300ml/kg模型组d-半乳糖纯化水300ml/kg阳性对照组d-半乳糖vc450mg/kg配方3d-半乳糖配方3冻干粉300ml/kg配方4d-半乳糖配方4冻干粉300ml/kg配方7d-半乳糖配方7冻干粉300ml/kg配方9d-半乳糖花胶对照组冻干粉300ml/kg
140.1.6血清及皮肤生化指标
141.血清的制备：眼眶取血或摘眼球取血，静置30min使其自然凝结，之后冷冻低速离心机4000r/min离心10min，使血清和红细胞分层后，小心的取上面一层血清放入-20℃冰箱备用。
142.皮肤组织匀浆的制备：疾速取脱毛后小鼠背部皮肤组织，用预冷的生理盐水轻轻漂洗后，去除皮下脂肪和其余结缔组织，再称取皮肤组织约0.5g，用移液管量取皮肤组织块重量的9倍量(约4.5ml)预冷生理盐水，然后迅速小心地剪碎组织块后放入离心管中，将量取准确的生理盐水倒入离心管中摇匀，用组织匀浆机(5000r/min、共匀浆1h)进行匀浆(制作时注意样品始终保持低温状态)，匀浆完成后重复冻融3次,使皮肤细胞破碎，内容物全都游离在液相中。之后再将制备好的10％的皮肤组织匀浆用低温低速离心机以转速4000r/min离心10min，取上清液放入-20℃冰箱以便后续稀释备用。
143.血清及皮肤生化指标的测定：测定皮肤组织匀浆中sod活力、mda和hyp含量，各个
指标所用的方法及计算公式都严格按照试剂盒说明书。
144.统计学分析：采用excel统计软件进行数据分析，数据资料结果采用表示，多组间的均数的比较采用单因素方差分析的方法，组间的两两组数据比较采用t检验。p＜0.05为差异具有一定的统计学意义。
145.1.6.1血清及皮肤组织的超氧化物歧化酶(sod)活力
146.目前国际上被大家所接受的有关衰老机制的学说是自由基学说。而sod作为机体内消除多余自由基的一系列酶类，也是在抗衰老研究中的公认的参考的指标中的一个。我们通过测定小鼠血清与皮肤中的sod活力(结果见图5)，发现与空白组相比，模型组小鼠皮肤和血清中的sod活力值显著降低(p＜0.001，p＜0.01)，表明造模成功；与模型组相比，vc阳性对照组和配方9给药组(花胶对照组)小鼠血清和皮肤中的sod有些许的上升；配方3和4给药组小鼠的sod活力都有有较大的提高，sod含量显著高于模型组(p＜0.01)。
147.1.6.2血清及皮肤组织的丙二醛(mda)含量测定
148.mda是体内自由基反应后氧化的产物，堆积于皮肤中会呈现老年斑、色斑或者产生皱纹，因而自由基反应中自由基的累积损伤是导致皮肤衰老的非常重要的缘由之一。因此，抑制自由基的产生和消除自由基代谢产物mda，增强抗氧化酶的活性已经成为目前缓解皮肤衰老的最有效方法。我们通过测定小鼠血清与皮肤中的丙二醛的含量(结果见图6)，发现与空白组相比，模型组小鼠血清和皮肤中的mda含量均升高，且都有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)，即说明了小鼠衰老模型的成功建立。各给药组组以及阳性组与模型组相比，小鼠血清与皮肤中的mda含量均下降；其中，配方4给药皮肤和血清中mda含量均显著低于模型组(p＜0.05)。
149.1.6.3皮肤组织羟脯氨酸(hyp)含量测定
150.hyp是皮肤中胶原蛋白特有的的氨基酸，也是皮肤真皮层内含量丰厚而且非常稳定的氨基酸。随着年，龄渐渐增长，皮肤中的hyp含量也会随着年龄的增长而减少。因此hyp含量的高低可以间接反映小鼠皮肤是否衰老和衰老的程度。我们通过测定小鼠皮肤中的hyp含量(结果见图7)，发现与空白组相比，模型组小鼠皮肤的hyp含量减少，且有显著性差异(p＜0.01)，也证明了小鼠衰老模型的成功建立；与模型组相比，各给药组与阳性组与模型组相比都增加了hyp含量，其中配方4的hyp含量具有显著性增加(p＜0.01)。