一种包含益生菌微胶囊和氢镁素的缓释组合物、制备方法及应用与流程

本发明属于镁基储氢材料和益生菌微胶囊，尤其涉及一种包含益生菌微胶囊和氢镁素的缓释组合物。

背景技术：

1、氢镁素(hydromg)是一种镁基储氢材料，是一款利用纳米制备技术合成的安全、高效地创新医药成分。其主要成分由负氢离子、镁离子及配合多种催化渗透剂组合而成。是一种新兴的、可食用的物理抗氧化剂。作为一种氢镁化合物，其功效囊括了氢与镁的作用。负氢离子广泛存在于各种生物的生化反应中，且在与机体能量代谢密切相关的三羧酸循环(也称作柠檬酸循环)充当重要角色。负氢离子能被运输到各种组织、包围细胞的体液等生物系统中，发挥其自由基(ros)清除的作用。氢镁素能够调节人体肠道功能，改善肠道不适。在氢镁素中添加益生菌，二者联用能够起到改善肠道功能，调节肠道菌群的功能。

2、益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。然而，必须要保证益生菌以活的状态和充足的数量定植于肠道中，才能在人体内发挥益生作用。目前的益生菌产品在生产、加工、运输、保存过程中，会因为不利环境的影响而导致益生菌活性降低，这也是导致其无法在工业生产中广泛应用的主要原因之一。此外，益生菌需要以活菌的形式存活于肠道中才可以发挥其益生的特性，但是在人体中益生菌在达到肠道之前需要经过胃酸及胆汁这类的特殊环境，这会使得益生菌的活性受到极大的损失，益生菌的存活率只有不到30％。

3、将益生菌包埋于微胶囊中对保持益生菌的活力具有重要的作用，因此，现有技术常将益生菌做成微胶囊的结构，以保持其活性。专利cn112544981a公开了一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法及其制备的沙棘益生菌微胶囊产品，具体公开一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法，步骤如下：1)向沙棘提取液中接种益生菌，发酵培养1～3d，得到沙棘益生菌发酵液；2)将海藻酸钠溶解在水中，配制成浓度为1％～10％的海藻酸钠溶液，将乳清分离蛋白用酸液溶解，配制成浓度为3％～12％的乳清分离蛋白溶液；3)将沙棘益生菌发酵液、海藻酸钠溶液、乳清分离蛋白溶液按比例混合均匀，得到混合液；4)将步骤3)得到的混合液逐滴加入氯化钙溶液中，室温下固定20～40min，过滤，除去水相，即得沙棘益生菌微胶囊。该发明制备的沙棘益生菌微胶囊营养活性高，益生菌活菌数高，环境抗逆性强。

4、专利cn110623066a公开了一种复合益生菌制品及其制备方法，复合益生菌制品包括如下重量份的原料：鲜奶100-120份、复合益生菌微胶囊2-4份、白砂糖8-10份、稀奶油1-3份、乳清分离蛋白粉1-3份和果胶2-5份，通过在培养益生菌时，向培养皿中添加抗热保护剂，使得益生菌的表面附着有抗热保护剂，提高了益生菌的耐热性，另外通过阿拉伯木聚糖和大豆蛋白对益生菌进行两次包埋，将益生菌包覆起来，减少胃液对益生菌的影响，进而提高了益生菌在经过胃液时的存活率，该复合益生菌制品的制作工艺简单，制得复合益生菌制品的益生菌含有抗热保护剂，且表面有阿拉伯木聚糖和大豆蛋白两层包覆，提高了该复合益生菌制品的储藏效果和食用效果。上述两个专利均公开了一种益生菌微胶囊，但缓释功能较差，不能满足临床的使用需求。

5、因此，如何获得一种具有缓释功能的氢镁素和益生菌组合物，在保持益生菌活性的同时实现氢气的靶向深层释放，成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种拥有缓释功能，提高益生菌活性，在肠道中充分发挥功能，氢气靶向释放，深层渗透，且释放率高的氢镁素和益生菌缓释组合物。

2、具体的，本发明提供一种包含益生菌微胶囊和氢镁素的缓释组合物，

3、所述氢镁素以氧化镁为原料，在高温下通过与氢氩混合气体的氢化反应制备得到；

4、所述益生菌微胶囊以益生菌为芯材，以改性乳清分离蛋白和壳聚糖为复合壁材，所述改性乳清分离蛋白为经过儿茶素改性的乳清分离蛋白；

5、所述组合物中益生菌微胶囊和氢镁素的质量百分比比例为1：(0.8-1.2)。

6、本发明使用的益生菌有三大类：(1)乳杆菌类如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌；(2)双歧杆菌类如婴儿双歧杆菌、嗜热双歧杆菌；(3)中介链球菌、乳球菌等。

7、微胶囊(microcapsules)，也被称为微囊，是一种覆盖层，该覆盖层可以由一种物质或者多种物质组成，可以是半透性也可以是密封性的，对其中包裹的物质具有一定的保护作用。微胶囊主要由芯材和壁材构成，其中芯材一般是目的物，壁材具有密封保护的作用。本发明的益生菌微胶囊可以包埋活菌，阻止外界不良环境对益生菌的破坏，并于肠道中发挥保健功能。

8、壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，天然存在于甲壳类动物的外骨骼、昆虫的表皮和一些真菌的细胞壁中，具有来源广泛、无毒、易化学修饰性、较高生物相容性，以及具有良好的吸附性、成膜性和可生物降解性等特点。由于其优越的功能性质和独特的分子结构，壳聚糖作为可生物降解材料用于新型给药系统，通过改变给药途径可大大提高药物疗效，具有控制释放、增加靶向性、减少刺激和降低毒副作用，以及提高疏水性药物通过细胞膜、增加药物稳定性等作用特点。利用壳聚糖可制备出多种具有负载、靶向、缓释等作用的微胶囊。壳聚糖也是一种具有抗菌、抗真菌、粘接和胶凝性能的生物聚合物，它能被黏膜上一定浓度的溶菌酶和结肠微生物产生的酶所特异性降解，由于其无毒性、生物降解性和生物相容性，且能增强活性物质的稳定性，维持包封材料的释放速度，使其在活性物质的包封和缓释方面具有重要的应用价值，在组织工程和药物给药领域也具有广阔的应用前景。

9、乳清分离蛋白均具有优异乳化性、发泡性、成膜性、胶凝性和两亲性等特性，具备包封芯材的能力，乳清分离蛋白具有较高的蛋白含量，具有很强的乳化能力。以乳清分离蛋白为壁材制备的微胶囊在氧化条件下，具备有效保护芯材免受氧化的能力。此外，乳清分离蛋白水溶液经加热后形成不溶性凝胶，有助于开发无化学交联剂不溶性微胶囊。相对于多糖类和脂类壁材，乳清分离蛋白有更好乳化性、成膜性以及胶凝能力。因此，以乳清分离蛋白为壁材制备的微胶囊结构稳定性更好、抗氧化的能力更强、包封效率更高以及负载量更大。乳清分离蛋白壁材的特性主要与蛋白质分子在油水界面的排列方式有关，亲水性氨基酸链从油水界面延伸到水相中，产生空间位阻，降低界面张力，在油水界面形成大量微小油滴，进而吸附在油水界面并形成稳定的乳液，最终实现最大的包封效率和氧化稳定性。在ph较低的情况下，微胶囊的释放通过蛋白变性与在胃肠蠕动以及酶的作用下释放出益生菌。乳清蛋白微胶囊在ph值偏中性的环境中具有较高的缓冲能力；在外观形态上，由高浓度乳清蛋白溶液制备而来的微胶囊具有较好的呈球性和致密度，这些可能是乳清蛋白微胶囊具有较高保护效果的原因。

10、因此，本发明将上述两种材料联用，共同形成的复合壁材，充分结合了几种材料的优势，避免了单一壁材产生的弊端，使其有更好的包埋性和稳定性。乳清分离蛋白能够促进乳状液的形成，减少界面张力，形成保护膜。乳清分离蛋白的蛋白含量通常高于90％，这就使得暴露的氨基酸上的负电基团与壳聚糖分子上的氨基发生相互作用形成界面复合膜。壳聚糖和乳清分离蛋白两者相互作用能共同形成较稳定的乳液，增强微胶囊的稳定性。

11、因此，本发明的微胶囊也能用于包裹益生菌等，对益生菌起到保护作用，可以有效防止氧对益生菌的伤害等微生物感染，并且在冷冻干燥的工艺中存活率较高，有很好的保护作用。

12、进一步的，改性乳清分离蛋白的改性方式为：将乳清分离蛋白溶液加入过氧化氢和抗坏血酸混合溶液中，振荡后加入儿茶素反应18-24h，将反应后的溶液透析，冷冻干燥，制备得到改性乳清分离蛋白。

13、本发明可以用儿茶素类化合物对乳清蛋白进行进一步改性，优选表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)，乳清分离蛋白自由基接枝egcg后，乳清分离蛋白的球状结构消失并转变为片状结构，吸附性能有所改进，表现出相对较好的抗絮凝和聚结性能及乳化稳定性，因此，对乳清蛋白进行的改性可以提高蛋白的界面及流变特性，有效提高载运体系的稳定性及负载物的保护效果，也即，使用改性后的乳清分离蛋白能够提高微胶囊的稳定性和包埋率。

14、进一步的，益生菌微胶囊中芯材与壁材的质量百分比比例为1：(2.5-4)；所述壁材中壳聚糖和改性乳清分离蛋白的质量百分比比例为1：(0.8-2)。

15、第二方面，提供一种包含益生菌微胶囊和氢镁素的缓释组合物的制备方法，包括以下步骤：

16、步骤1：制备氢镁素；

17、步骤2：制备益生菌微胶囊；

18、步骤3：将益生菌微胶囊和氢镁素充分混合，干燥后制备得到所述缓释组合物。

19、进一步的，益生菌微胶囊的制备方法包括以下步骤：

20、s1：取聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠溶于水中，加热搅拌下使之充分溶解，作为基底介质；

21、s2：制备改性乳清分离蛋白溶液，将ph值调至4.0-4.5，加入壳聚糖，搅拌均匀得到壁材溶液；

22、s3：制备益生菌悬浮液；

23、s4：将益生菌悬浊液和壁材溶液加入二氯甲烷得到混合溶液，将混合溶液滴入基底介质中，恒温持续搅拌5-7h；

24、s5：离心收集微胶囊颗粒，用无菌水反复清洗，将微胶囊在-35℃至-45℃下冷冻2-4h后置于冷冻干燥机中冷冻干燥16-24h。

25、采用冷冻干燥法能够最大保持益生菌的活性，提高益生菌的包埋率，益生菌微胶囊包埋率的计算公式为：

26、

27、其中，e为益生菌包埋率，m为微胶囊中的活菌总数，n为加入的活菌总数。利用现有技术中常用的活菌数量测试手段测定益生菌活菌数量即可。

28、进一步的，聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠的质量百分比比例为(8-10)：1。

29、进一步的，氢镁素的制备方法包括以下步骤：

30、步骤1：将氧化镁粉末放入反应釜中，超高温加热得到熔融态氧化镁，冷却后得到氧化镁晶体；

31、步骤2：将氧化镁晶体与中空介孔二氧化硅加入有机溶液中搅拌均匀，得到的混合悬浊液离心分离，将离心后的产物清洗干燥研磨，得到中间体；

32、步骤3：将中间体粉末放入反应炉中，通入氢氩混合气体，加热反应后得到氢镁素。

33、本发明制备的固态储氢镁化合物氢镁素是一种经过特有的工艺将氢气储存镁化合物的一系列物理化学氢化过程，制备得到的氢镁素是微纳米尺寸级别，是一种氢镁素微纳米马达，利用释放氢气的气体推动作用，协助药物定向运输、局部治疗，本发明的氢镁素微纳米马达作为一种内源性驱动马达，能够智能响应微环境而自主到达靶部位，实现目标部位局部精准给药，增强疗效。同时，本发明的氢镁素合成后表面被氧化物覆盖，状态稳定，遇水缓慢释放氢气，进一步实现氢气的缓释释放。

34、氢气能减少氧化损伤，也是非常理想的抗炎症物质，对各类氧化损伤和炎症性疾病具有理想的治疗效果。氢气是典型的生物分子，生物能制造氢气，也能利用氢气，着氢气参与代谢的地位非常高。氢气作为一种结构非常简单的分子，能进入许多分子内部，由于氢气具有一定还原性，在充满氧化还原过程的细胞生化代谢过程中，氢气可能会发挥催化和负催化效应，干扰生化反应速度，发挥生物学效应。氢气是肠道内主要的气体成分，胃肠道不仅能消化食物，也会产生气体或非营养成分，这些气体和非营养成分可能对身体健康具有举足轻重的作用。氢气溶于水后是非常好的抗氧化剂，可以自由进出细胞，到达细胞内有超氧自由基的部位发生抗氧化反应，清除坏的自由基。

35、进一步的，步骤1中超高温加热的温度为2800-3500℃。步骤3中反应炉内的温度为450-500℃，压强为0.1-0.4mpa，通入的氢氩混合气体中氢气与氩气的体积比为1：(1.5-5)，所述步骤3的反应时长为20-27h。

36、进一步的，中空介孔二氧化硅的制备方法包括以下步骤：

37、(1)将十六烷基三甲基溴化铵加入浓度为2-5mol/l的氢氧化钠溶液中，70-80℃下磁力搅拌30-45min，加入正硅酸乙酯，十六烷基三甲基溴化铵和正硅酸乙酯的体积比为(0.6-0.8)：1；

38、(2)在80-90℃下搅拌2-3h后离心，反复冲洗离心后的沉淀物，烘干研磨，得到白色粉末；

39、(3)将白色粉末加入酸性甲醇溶液中，75-90℃下磁力搅拌，冷凝回流6-8h；

40、(4)超声分散20-30min，离心后将沉淀物干燥，得到中空介孔二氧化硅。

41、本发明的酸性甲醇溶液为盐酸和甲醇混合溶液，其中，盐酸和甲醇的体积比为1：(17-18)。

42、介孔二氧化硅纳米颗粒具有许多独特的性质,如孔道均匀、粒径与孔径尺寸可调、比表面积大、生物相容性好,以及表面容易功能化,使得介孔二氧化硅成为最具潜力的载体材料。然而,传统的介孔二氧化硅小球具有孔容积小、孔道深等特点,使得其负载量较少,而且其负载的分子扩散需要很长的时间,本文采用模板法,以聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物微球为模板,十六烷基三甲基溴化铵(十六烷基三甲基溴化铵)为造孔剂,通过加入适量的正硅酸四乙酯(正硅酸乙酯),在一定量的聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物微球外面生长介孔二氧化硅来合成聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物微球,然后通过高温煅烧除去聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物微球模板,得到粒径与壳厚度可控的中空介孔二氧化硅小球。本发明制备的具有特殊空心结构的介孔二氧化硅，具有较大的比表面积和孔容积,相对于传统介孔氧化硅材料可以负载更多的分子,在缓释和负载领域具有优良的性能。

43、第三方面，提供一种包含益生菌微胶囊和氢镁素的缓释组合物在食品领域的应用。

44、本发明，优点具体在于：

45、1)本发明制备的氢镁素是一种微纳米马达，利用释放氢气的气体推动作用，协助药物定向运输、局部治疗，本发明的氢镁素微纳米马达作为一种内源性驱动马达，能够智能响应微环境而自主到达靶部位，实现目标部位局部精准给药，增强疗效。本发明制备的氢镁素遇水缓慢释放氢气，作为负氢离子载体共同作用于人体，同时，借助镁基微马达的推动作用，实现深层渗透，提高了氢气的释放率和利用率。

46、2)本发明的壁材使用壳聚糖-乳清分离蛋白复合壁材。壳聚糖具有良好的吸附性、成膜性和可生物降解性等特点，具有控制释放、增加靶向性、减少刺激和降低毒副作用，能够提高疏水性药物通过细胞膜、增加药物稳定性等作用特点；经过改性的乳清分离蛋白包封芯材的能力进一步提高，包封效率更高以及负载量更大。本发明将上述两种材料联用，共同形成的复合壁材，使微胶囊具有优良的包埋性和稳定性，同时实现了益生菌微胶囊的缓释。

47、3)本发明制备的具有特殊空心结构的介孔二氧化硅，具有较大的比表面积和孔容积,相对于传统介孔氧化硅材料可以负载更多的分子,在缓释和负载领域具有优良的性能。

48、4)本发明采用益生菌微胶囊包埋率较高，提高了益生菌的存活率，防止益生菌在消化道中被胃酸或胆汁破坏而失活；氢镁素释放的氢气能够作为益生菌能量代谢的物质基础，同时，氢镁素能够促进益生菌在肠道内发挥功能，提高了益生菌的利用率和存活率，相较于现有技术中单独服用益生菌的效果显著增强。