一种牛骨胶原肽-钙螯合固体饮料及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种牛骨胶原肽-钙螯合固体饮料及其制备方法。


背景技术：

2.钙是人体必需的矿物质营养素，同时也是人体内最丰富的二价阳离子，约占人体重的1.5-2.2％，其中99％存在与骨骼和牙齿中，另外1％分布在细胞内和细胞外液中。钙在人体骨骼生长、血液凝固、细胞内代谢、神经传导和肌肉收缩中起到非常重要的作用。钙的摄入量不足或者人体对钙的吸收不足会导致如骨质疏松、高血压、结肠癌、肥胖、肾结石等疾病。为了克服钙的缺乏，现在市场上出现各种钙强化产品和钙补充剂。
3.钙补充剂的使用过程中，如果补充钙未被人体有效快速分散吸收，在体内快速积累，会影响其他微量元素的吸收，还增加了患有骨质疏松的机率，而且钙和草酸很容易结合，从而导致人体形成结石；还会刺激胃肠道，很容易诱发高钙血症，严重的话会引起肾衰竭。在人体中钙补充剂从第一代无机钙、第二代有机钙、第三代氨基酸钙螯合物，发展至目前的第四代多肽钙螯合物，研究发现，与氨基酸相比，小分子肽吸收上更有优势，肽可以结合钙离子以防止钙在胃肠道消化过程中产生沉淀，从而改善机体对钙的吸收效果。人体对钙离子的吸收分为三步：首先是在胃里被消化成钙离子，其次是与小肠分泌的小分子量肽段或氨基酸结合形成螯合钙，最后整体被小肠吸收；吸收后，在细胞里螯合键自动断开，分别被吸收利用。因此胶原多肽螯合钙先在体外完成了消化的过程，从而提高了钙离子的吸收率，同时保持了各自的功能特性，多肽钙螯合物不仅具有补钙作用，同时还具有一些特殊的生物活性。牛骨胶原蛋白肽与钙螯合，作为钙的载体的同时，可以减少关节炎患者的疼痛，增加血液中羟脯氨酸含量，促进人成骨细胞(hob)增殖。现有技术中有采用牛骨胶原肽与牛骨中提取的钙进行螯合，其螯合率较高，但是提取钙过程不易把控，且提取量极少，为便于大规模生产，通常采用无机钙盐例如氯化钙，与牛骨胶原肽形成螯合物用于人体补钙，但是存在钙与肽螯合后，结合强度不高，在长期储存、以及摄入人体后，还未进入细胞，钙很轻易就脱离载体肽，使得不能被有效吸收的问题。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种牛骨胶原肽-钙螯合固体饮料。
5.本发明另一目的在于提供上述牛骨胶原肽-钙螯合固体饮料的制备方法。
6.本发明目的通过如下技术方案实现：
7.一种牛骨胶原肽-钙螯合物固体饮料的制备方法，其特征在于：以牛骨制备胶原蛋白肽，将牛骨胶原肽和氯化钙混合溶于纯化水中，加碳酸氢钠调节ph至8，进行加热处理，加热处理结束后加柠檬酸调节ph至5-6，加入聚乙二醇搅拌均匀后，加入聚谷氨酸进行二次加热处理，最后加入氨基-β-环糊精，加热至70-80℃，保温1-1.5h，最后进行干燥处理。
8.牛骨胶原肽和钙离子螯合后，很容易受到外界环境的影响，螯合稳定性差，很容易
发生分离，且位于钙离子外围的牛骨胶原肽容易被外界氧化，从而失活，冲调过程容易出现悬浮物、分层等现象。
9.本发明中采用牛骨胶原肽与氯化钙在碱性环境下进行螯合，牛骨胶原肽作为钙的载体包覆在钙的表面，柠檬酸调节环境下，聚乙二醇分别与牛骨胶原肽以及未被包覆的ca
2+
分别作用，在钙和牛骨胶原肽之间起到桥架的作用，此外，制备过程中加入抗氧化剂聚谷氨酸，抑制牛骨胶原肽的氧化，聚谷氨酸水解后与裸露的ca
2+
形成螯合附着在牛骨肽-钙螯合物的表面，作为第二层包覆，低聚谷氨酸由于具有带大量负电的羧基，当氨基-β-环糊精加入该体系中，在柠檬酸的作用下，氨基质子化，通过静电吸引，以及聚乙二醇的牵引作用，将螯合了低聚谷氨酸的牛骨胶原肽-钙螯合物引入氨基-β-环糊精孔洞中形成第三层包覆，聚乙二醇在高温环境下与氨基-β-环糊精作用，形成“大网”将牛骨肽-钙螯合物包合，在此过程中，由于低聚谷氨酸的二次包覆，起到了保护牛骨胶原肽的作用，防止了其在后续氨基-β-环糊精包覆过程中变性，以及在较高温度下肽-钙螯合物的分解，经多层结构的复合，在保证螯合后的牛骨肽-钙螯合物不被外界环境破坏分离，提高其结构稳定性，有效保证牛骨胶原肽-钙螯合物能被细胞有效吸收利用。
10.进一步，上述牛骨胶原肽和氯化钙按照1:1-1.5混合，混合后的总量与纯化水的质量比为2-2.5:50。
11.进一步，上述加热处理温度为45-55℃，保温时间为30-40min。
12.进一步，上述聚谷氨酸和氯化钙的质量比为0.2-0.5:1，二次加热处理的温度为60-70℃，保温时间为30-60min。
13.进一步，上述氯化钙和聚乙二醇的质量比为1:0.1-0.2。
14.进一步，上述牛骨胶原肽和氨基-β-环糊精的质量比为1-1.5:0.5-0.8。
15.进一步，上述牛骨胶原肽是将牛骨头洗净粉碎后，加水高温高压蒸煮，经分离得牛骨胶原蛋白原液，再采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行分步水解，再依次进行过滤、减压浓缩和干燥处理。
16.进一步，上述高温高压蒸煮是将牛骨与水按照体积比为1:3混合，在0.2-0.3mpa、100℃下蒸煮1-2h。
17.进一步，上述分步水解是按照2500u/g蛋白质的量，往牛骨胶原蛋白原液中添加碱性蛋白酶，调节ph为9.0，温度为60℃，水解4-5h，酶解结束后，灭酶后，调节ph至7.0，按照2500u/g蛋白质的量加入风味蛋白酶，在50℃下水解0.5-1h。
18.本发明中采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶分步水解，对胶原蛋白的水解度更高，能更好的螯合钙离子。但是该水解过程中也产生大量的疏水基团，导致水解后的牛骨胶原肽有很大的苦味，影响口感。
19.本发明中采用柠檬酸和聚谷氨酸协同作用，掩盖牛骨胶原肽中的苦味，此外，通过聚谷氨酸与质子化后的氨基-β环糊精静电吸引作用，使得氨基-β环糊精对牛骨胶原肽-钙螯合物被完整包覆，进一步抑制苦味扩散。
20.最具体的，一种牛骨胶原肽-钙螯合物固体饮料的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行：
21.步骤1：制备牛骨胶原肽
22.(1)将新鲜的牛骨剔除残肉和骨髓杂质，用清水洗净，粉碎至2-5cm的小块，然后与
水体积比为1：3混合，在0.2-0.3mpa、100℃下蒸煮1-2h，得蒸煮液；
23.(2)采用重力分离法将蒸煮液进行有水分离，并将所得的水相降温至50-55℃，即为牛骨胶原蛋白原液；
24.(3)按照2500u/g蛋白质的量，往牛骨胶原蛋白原液中添加碱性蛋白酶，调节ph为9.0，温度为60℃，水解4-5h，酶解结束后，灭酶后，调节ph至7.0，按照2500u/g蛋白质的量加入风味蛋白酶，在50℃下水解0.5-1h，水解结束后，采用截留分子量为800da的超滤膜过滤，收集滤液；
25.(4)将滤液在130℃、压力为0.1mpa下处理5min得处理液，通过减压加热浓缩后进行冷冻干燥成粉末；
26.步骤2：螯合
27.(1)将步骤1制备的牛骨胶原肽粉末与氯化钙按照体积比为1-1.5:1混合后分散于总量的50倍的纯化水中，加入碳酸氢钠调节ph至8，加热至45-55℃，保温30-40min，形成溶液1；
28.(2)在溶液1中加入柠檬酸调节ph为5-6，加入聚乙二醇，混合均匀后再加入聚谷氨酸，进行二次加热，加热温度为60-70℃，加热时间为30-60min，形成溶液2，聚乙二醇、聚谷氨酸和氯化钙的质量比为0.1-0.2:0.2-0.5:1；
29.(3)在溶液2中加入氨基-β-环糊精，在加热至70-80℃，保温1-1.5h，形成溶液3，其中氨基-β-环糊精和牛骨胶原肽粉末的质量比为0.5-0.8:1-1.5；
30.(4)在溶液3中加入无水乙醇，在5℃下静置12h，过滤得沉淀，进行干燥成粉末。
31.一种牛骨胶原肽-钙螯合固体饮料，其特征在于：是将牛骨胶原肽和氯化钙混合溶于纯化水中，加碳酸氢钠调节ph至8，进行加热处理，加热处理结束后加柠檬酸调节ph至5-6，加入聚乙二醇搅拌均匀后，加入聚谷氨酸进行二次加热处理，最后加入氨基-β-环糊精，加热至70-80℃，保温1-1.5h，最后进行干燥处理制备得到。
32.进一步，上述牛骨胶原肽和氯化钙按照1:1-1.5混合，混合后的总量与纯化水的质量比为2-2.5:50。
33.进一步，上述加热处理温度为45-55℃，保温时间为30-40min。
34.进一步，上述聚谷氨酸和氯化钙的质量比为0.2-0.5:1，二次加热处理的温度为60-70℃，保温时间为30-60min。
35.进一步，上述氯化钙和聚乙二醇的质量比为1:0.2-0.5。
36.进一步，上述牛骨胶原肽和氨基-β-环糊精的质量比为1-1.5:0.5-0.8。
37.进一步，上述牛骨胶原肽是将牛骨头洗净粉碎后，加水高温高压蒸煮，经分离得牛骨胶原蛋白原液，再采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行分步水解，再依次进行过滤、减压浓缩和干燥处理。
38.进一步，上述高温高压蒸煮是将牛骨与水按照体积比为1:3混合，在0.2-0.3mpa、100℃下蒸煮1-2h。
39.进一步，上述分步水解是按照2500u/g蛋白质的量，往牛骨胶原蛋白原液中添加碱性蛋白酶，调节ph为9.0，温度为60℃，水解4-5h，酶解结束后，灭酶后，调节ph至7.0，按照2500u/g蛋白质的量加入风味蛋白酶，在50℃下水解0.5-1h。
40.本发明具有如下技术效果：
41.本发明制备的牛骨胶原肽-钙螯合固体饮料中，牛骨胶原肽与钙的螯合率高达90％以上，螯合结构稳定，不易发生脱离，可有效被人体吸收利用，达到有效补钙的效果，产品无苦味，长期储存稳定性优异，快速冲调，冲调时没有结块、挂壁问题。
具体实施方式
42.下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
43.实施例1
44.一种牛骨胶原肽-钙螯合物固体饮料的制备方法，按如下步骤进行：
45.步骤1：制备牛骨胶原肽
46.(1)将新鲜的牛骨剔除残肉和骨髓杂质，用清水洗净，粉碎至2-5cm的小块，然后与水体积比为1：3混合，在0.25mpa、100℃下蒸煮1.5h，得蒸煮液；
47.(2)采用重力分离法将蒸煮液进行有水分离，并将所得的水相降温至50℃，即为牛骨胶原蛋白原液；
48.(3)按照2500u/g蛋白质的量，往牛骨胶原蛋白原液中添加碱性蛋白酶，调节ph为9.0，温度为60℃，水解4.5h，酶解结束后，灭酶后，调节ph至7.0，按照2500u/g蛋白质的量加入风味蛋白酶，在50℃下水解1h，水解结束后，采用截留分子量为800da的超滤膜过滤，收集滤液；
49.(4)将滤液在130℃、压力为0.1mpa下处理5min得处理液，通过减压加热浓缩后进行冷冻干燥成粉末；
50.步骤2：螯合
51.(1)将步骤1制备的牛骨胶原肽粉末与氯化钙按照体积比为1.2:1混合后分散于总量的50倍的纯化水中，加入碳酸氢钠调节ph至8，加热至50℃，保温35min，形成溶液1；
52.(2)在溶液1中加入柠檬酸调节ph为5.5，加入聚乙二醇，混合均匀后再加入聚谷氨酸，进行二次加热，加热温度为65℃，加热时间为40min，形成溶液2，聚乙二醇、聚谷氨酸和氯化钙的质量比为0.1:0.4:1；
53.(3)在溶液2中加入氨基-β-环糊精，在加热至75℃，保温1h，形成溶液3，其中氨基-β-环糊精和牛骨胶原肽粉末的质量比为0.6:1.5；
54.(4)在溶液3中加入无水乙醇，在5℃下静置12h，过滤得沉淀，进行干燥成粉末。
55.对比例1：
56.与实施例1不同的是，在牛骨水解的过程中，依次采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行水解，其余步骤保持与实施例一致。
57.螯合率的高低可能与牛骨胶原肽平均肽链长度以及氨基酸组成种类有关，通过对成品螯合率的检测计算，以及对制备的牛骨胶原肽中氨基酸组分分析，其螯合率以及占比较多的氨基酸组分如下表1所示。
58.表1：
[0059][0060]
脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，对比例1中采用的是碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的依次水解，其胶原蛋白水解量比实施例1中略低，通过羟脯氨酸比色法测得胶原蛋白含量为50.73％，占总蛋白的74.81％，实施例1中采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶对牛骨依次水解时，牛骨中胶原蛋白被水解的占比较高，通过羟脯氨酸比色法测得胶原蛋白含量为59.86％，占总蛋白的82.26％，螯合物中氨基酸占比也相应较高，可见，牛骨胶原蛋白的大量水解，有利于提高螯合率。但是也可以看出采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶依次水解，螯合物中疏水氨基酸占比明显增加。
[0061]
实施例2
[0062]
一种牛骨胶原肽-钙螯合物固体饮料的制备方法，按如下步骤进行：
[0063]
步骤1：制备牛骨胶原肽
[0064]
(1)将新鲜的牛骨剔除残肉和骨髓杂质，用清水洗净，粉碎至2-5cm的小块，然后与水体积比为1：3混合，在0.2mpa、100℃下蒸煮2h，得蒸煮液；
[0065]
(2)采用重力分离法将蒸煮液进行有水分离，并将所得的水相降温至55℃，即为牛骨胶原蛋白原液；
[0066]
(3)按照2500u/g蛋白质的量，往牛骨胶原蛋白原液中添加碱性蛋白酶，调节ph为9.0，温度为60℃，水解4h，酶解结束后，灭酶后，调节ph至7.0，按照2500u/g蛋白质的量加入风味蛋白酶，在50℃下水解1h，水解结束后，采用截留分子量为800da的超滤膜过滤，收集滤液；
[0067]
(4)将滤液在130℃、压力为0.1mpa下处理5min得处理液，通过减压加热浓缩后进行冷冻干燥成粉末；
[0068]
步骤2：螯合
[0069]
(1)将步骤1制备的牛骨胶原肽粉末与氯化钙按照体积比为1:1混合后分散于总量的50倍的纯化水中，加入碳酸氢钠调节ph至8，加热至45℃，保温40min，形成溶液1；
[0070]
(2)在溶液1中加入柠檬酸调节ph为5，加入聚乙二醇，混合均匀后再加入聚谷氨
酸，进行二次加热，加热温度为70℃，加热时间为30min，形成溶液2，聚乙二醇、聚谷氨酸和氯化钙的质量比为0.2:0.5:1；
[0071]
(3)在溶液2中加入氨基-β-环糊精，在加热至70℃，保温1.5h，形成溶液3，其中氨基-β-环糊精和牛骨胶原肽粉末的质量比为0.5:1；
[0072]
(4)在溶液3中加入无水乙醇，在5℃下静置12h，过滤得沉淀，进行干燥成粉末。
[0073]
实施例3
[0074]
一种牛骨胶原肽-钙螯合物固体饮料的制备方法，按如下步骤进行：
[0075]
步骤1：制备牛骨胶原肽
[0076]
(1)将新鲜的牛骨剔除残肉和骨髓杂质，用清水洗净，粉碎至2-5cm的小块，然后与水体积比为1：3混合，在0.3mpa、100℃下蒸煮1h，得蒸煮液；
[0077]
(2)采用重力分离法将蒸煮液进行有水分离，并将所得的水相降温至50℃，即为牛骨胶原蛋白原液；
[0078]
(3)按照2500u/g蛋白质的量，往牛骨胶原蛋白原液中添加碱性蛋白酶，调节ph为9.0，温度为60℃，水解5h，酶解结束后，灭酶后，调节ph至7.0，按照2500u/g蛋白质的量加入风味蛋白酶，在50℃下水解0.5h，水解结束后，采用截留分子量为800da的超滤膜过滤，收集滤液；
[0079]
(4)将滤液在130℃、压力为0.1mpa下处理5min得处理液，通过减压加热浓缩后进行冷冻干燥成粉末；
[0080]
步骤2：螯合
[0081]
(1)将步骤1制备的牛骨胶原肽粉末与氯化钙按照体积比为1.5:1混合后分散于总量的50倍的纯化水中，加入碳酸氢钠调节ph至8，加热至55℃，保温30min，形成溶液1；
[0082]
(2)在溶液1中加入柠檬酸调节ph为6，加入聚乙二醇，混合均匀后再加入聚谷氨酸，进行二次加热，加热温度为60℃，加热时间为60min，形成溶液2，聚乙二醇、聚谷氨酸和氯化钙的质量比为0.1:0.2:1；
[0083]
(3)在溶液2中加入氨基-β-环糊精，在加热至80℃，保温1h，形成溶液3，其中氨基-β-环糊精和牛骨胶原肽粉末的质量比为0.8:1.5；
[0084]
(4)在溶液3中加入无水乙醇，在5℃下静置12h，过滤得沉淀，进行干燥成粉末。
[0085]
对比例2
[0086]
与实施例1不同的是，该方案中将实施例1中的抗氧化剂聚谷氨酸更换成甲硫氨酸，其余步骤不变。
[0087]
对比例3
[0088]
与实施例1相比，不同点在于，将聚乙二醇更换为聚丙二醇，其余步骤不变。
[0089]
效果验证：
[0090]
1.螯合稳定性检测：
[0091]
经室温下放置、经过12个月后，按照相同钙含量螯合后，分别取实施例1-3和对比例1-3制备的牛骨胶原肽-钙螯合固体饮料配制成溶液，采用edta络合滴定法测定经胃消化酶消化后的游离钙离子的含量。并计算钙离子的释放率，具体如表2所示。
[0092]
表2：
[0093][0094]
苦味值的统计中，将苦味值分为3个等级，1：无苦味、2：有不明显苦味、3：苦味较重。
[0095]
2.以小鼠骨钙检测、抗体生成细胞检测(计算溶血空斑数)、nk细胞活性测定：受试物加蒸馏水至100ml溶解均匀，作为受试液，小鼠经口给予每日一次，灌胃量为20ml/kg，连续灌胃30天后进行小鼠骨钙检测、抗体生成细胞检测(计算溶血空斑数)、nk细胞活性测定。
[0096]
骨钙：完整的取出小鼠的两侧股骨和胫骨，剔净附着的软组织和软骨。丙酮脱脂数小时后，80℃烘干至恒重。用3mol/l hcl脱钙液脱钙24小时，取适量，用原子吸收法测钙，计算单位骨质量内所含钙的量。
[0097]
抗体生成细胞检测(jerne改良载片法)：将压积srbc用生理盐水配成2％的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫，5天后，将小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有hank’s液的研磨器内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，用hank’s液洗2遍，每次离心(1000转/分)10分钟，最后将细胞悬浮在8ml rpmi 1640培养液中：将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100ml)加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量ph7.2-7.4、2倍浓度的hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50ul 10％srbc(v/v,用sa液配制)，25ul脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5小时，然后用sa缓冲液稀释的补体(1:6)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5小时，计算溶血空斑数。
[0098]
nk细胞活性测定：无菌取脾，置于盛有适量无菌hank’s液的研磨器内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，用hank’s液洗2遍，每次离心(1000转/分)10分钟，最后用rpmi 1640完全培养液调整细胞浓度为2x107个/ml，取靶细胞和效应细胞各100ul(效靶比50:1)，加入u型96孔培养板；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100ul，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％np40各100ul；上述三项均设3个复孔，于37℃、5％co2培养箱中培养4小时，然后将96孔板以1500转/分下离心5分钟，每孔吸取上清液100ul置平底96孔培养板，同时加ldh基质液100ul，反应3分钟，每孔加入1mol/l的盐酸30ul，在酶标仪490nm处测定光密度值od；然后按照公式计算：nk细胞活性％＝(反应孔od-自然释放孔od)/(最大释放孔od-自然释放孔od)x100％血清尿素测定：另取末次给予受试液30分钟后的小鼠，在水深30cm、水温30℃的游泳箱中游泳90分钟，休息60分钟，拔眼球采全血约0.5ml；待血液凝固后离心，取血清测定尿素含量。
[0099]
肝糖原测定：另取末次给予受试液30分钟后的小鼠，立即颈椎脱臼处死取出肝脏，经生理盐水漂洗，滤纸吸干，精确称取肝脏50mg于试管内，加入4ml三氯醋酸匀浆1min，3000
转/分下离心15分钟，取上清液用蒽醌法测定肝糖原含量上述检测结果如表3所示：
[0100]
表3：
[0101][0102]
与各对比例相比，本发明牛骨胶原肽-钙螯合物更能有效渗入细胞，被有效吸收利用，从而发挥作用。对抗体生成细胞的生成有促进作用，对nk细胞活性有增强作用，即对机体有增强免疫力作用；能降低运动时血清尿素的产生，能增加小鼠肝糖原的含量，即具有缓解体力疲劳功能的作用。