含有母乳低聚糖LNnT的低致敏性婴儿部分水解配方食品的制作方法

含有母乳低聚糖lnnt的低致敏性婴儿部分水解配方食品
技术领域
1.本发明是关于一种低致敏性婴儿配方食品，具体而言，是关于一种含有母乳低聚糖lnnt的低致敏性婴儿部分（适度）水解配方食品、其制备方法与相关应用，属于婴儿特医低敏食品技术领域。


背景技术：

2.近年来，食物过敏（food hypersensitivity/allergy，fh/fa）的发病率呈逐年上升趋势，成为研究关注热点。婴幼儿食物过敏中，牛乳蛋白和鸡蛋过敏最为常见。目前对于牛乳蛋白过敏的孩子均采用回避治疗作为指南性意见。过程中会用到乳蛋白深度水解配方（ehf）做诊断和治疗，用乳蛋白部分（适度）水解配方（phf）和整蛋白配方做家庭再引入试验。但是，临床研究表明，长期食用深度水解配方，规避整蛋白饮食，会导致婴儿在一定程度上生长发育缓慢。而且，长时间使用水解配方对患儿家庭的经济负担加重。临床数据表明，乳蛋白过敏群体在做再引入实验时，比整蛋白配方具有更高比例的耐受性，从而更早的从深度水解配方转到部分水解配方。婴儿尽快通过乳蛋白深度水解配方改善症状，进而尽快从乳蛋白部分水解配方转到整蛋白配方，是有意义的。
3.相比于母乳喂养的婴幼儿，未接受母乳喂养的婴幼儿肠道发育不健全。婴儿肠道中的微生物菌群可代谢产生短链脂肪酸（short chain fatty acids，scfa），短链脂肪酸可调节机体的多种生理功能，为调节肠道微环境的健康发挥了重要作用。比如，乙酸是宿主能量的重要来源。而肠道中支链短链脂肪酸（bcfa）如异丁酸和异戊酸，由肠道菌群代谢支链氨基酸如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等产生，是未消化的蛋白与多肽到达结肠后被细菌发酵的产物，主要来自于膳食或粘膜细胞的脱落，因此，异丁酸和异戊酸的降低可看作从蛋白发酵转向纤维发酵，被认为是积极的效应。一些研究报道，与未接受母乳喂养的相比，全母乳喂养的婴儿粪便中测得异丁酸和异戊酸含量较低；牛奶蛋白过敏婴儿的粪便支链短链脂肪酸的浓度和比例比健康婴儿更高。
4.此外，婴儿肠道中的微生物菌群除了可代谢产生短链脂肪酸以外，在肠粘膜的降解过程中，有害菌群可侵入肠粘膜内部，粘多糖可经过中间反应快速地降解为硫代硫酸盐和游离的硫酸根，并最终产生有毒气体硫化氢。在炎症反应中，肠道稳态被破坏，硫代硫酸盐可被氧化成连四硫酸盐，并促进有害菌的进一步侵袭。
5.因此，在婴幼儿配方食品领域，以及在3岁以上儿童、青少年及成人食品领域，需要改善肠道微健康、缓解肠道不适及提升自身抵御致病菌如etec感染能力的解决方案。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的在于提供一种可改善肠道微环境健康的低致敏性乳蛋白部分（适度）配方食品。
7.本发明的另一目的在于提供所述低致敏性乳蛋白部分（适度）配方食品的制备方法。
8.本发明的另一目的在于提供所述低致敏性乳蛋白部分（适度）配方食品的应用。
9.本案发明人在研究中发现，母乳低聚糖乳糖-n-新四糖（lacto-n-neotetraose，lnnt）有利于改善肠道微环境健康，特别是有利于改善婴幼儿肠道微环境健康，具体可表现在：提高肠道乙酸含量；减少肠道异丁酸和/或异戊酸的产生；减少肠道硫化氢的产生；和/或提升个体抵御肠道致病菌如etec感染能力。进而，本发明将包括乳糖-n-新四糖的母乳低聚糖添加到配方食品中，提供了一种可改善肠道微环境健康的低致敏性乳蛋白部分（适度）配方食品。
10.具体而言，一方面，本发明提供了一种乳蛋白部分水解配方食品，该乳蛋白部分水解配方食品中含有乳糖-n-新四糖，以乳蛋白部分水解配方食品的总干物质的量计，乳糖-n-新四糖在乳蛋白部分水解配方食品中的总含量为10-4000mg/100g；并且，所述乳蛋白部分水解配方食品中的总蛋白含量为9~20g/100g，所述总蛋白包括水解乳蛋白，且水解度8-23，分子量分布5000dal以下的蛋白占总蛋白的30%以上。
11.根据本发明的具体实施方案，本发明的乳蛋白部分水解配方食品，以该乳蛋白部分水解配方食品的总干物质的量计，脂肪含量为15~29g/100g，碳水化合物含量为50~58g/100g。
12.根据本发明的具体实施方案，本发明的乳蛋白部分水解配方食品，其为婴儿配方粉、幼儿配方粉、3岁以上儿童配方粉、青少调制乳粉或成人调制乳粉。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供了一种适用于0-1岁乳蛋白过敏高风险婴儿和胃肠功能不适婴儿的配方粉，该配方奶粉含有母乳低聚糖lnnt，有助于改善肠道微健康、缓解肠道不适及提升自身抵御致病菌如etec感染能力。并且，本发明的乳蛋白部分水解配方食品中的总蛋白包括水解乳蛋白，且水解度8-23，分子量分布5000dal以下的蛋白占总蛋白的30%以上，优选30%-50%，致敏性低。
13.根据本发明的具体实施方案，本发明的乳蛋白部分水解配方食品中，提供总蛋白的原料包括水解乳清蛋白粉、水解酪蛋白粉、水解牛奶蛋白粉、水解乳脂肪球膜蛋白中的一种或多种。
14.根据本发明的具体实施方案，本发明的乳蛋白部分水解配方食品中，提供脂肪的原料除含有乳脂的基础原料（如牛乳或来自牛乳的分离组分）外，还包括植物油和/或opo结构脂。所述植物油可以包括葵花籽油、玉米油、大豆油、低芥酸菜籽油、椰子油、棕榈油、核桃油中的一种或多种，优选包括葵花籽油、玉米油和大豆油，这些植物油的添加一方面为产品提供脂肪成分，另一方面提供亚油酸，同时还可提供α-亚麻酸。此外，提供脂肪的原料还可选择性包括为提供1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯而添加的原料opo结构脂。由于目前市场上所售opo结构脂原料纯度不一，即其中有效成分1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的含量不尽相同，通常在40%~70%左右，本发明中，为区分有效成分1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯及其原料，在描述有效成分时采用术语“1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯”，在描述提供有效成分1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的食品原料时采用俗称“opo结构脂”。opo结构脂的具体添加量可根据本发明奶粉产品中对1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的含量要求及opo结构脂原料纯度进行换算。更优选地，基于1000重量份的所述一种含有母乳低聚糖lnnt的配方奶粉，其原料包括：葵花籽油0~150重量份；玉米油0~40重量份；大豆油0~80重量份；opo结构脂0~140重量份。
15.根据本发明的具体实施方案，本发明的乳蛋白部分水解配方食品中，提供碳水化合物的原料来自乳糖以及非乳糖来源物质，所述非乳糖来源物质包括预糊化淀粉、麦芽糊精、固体玉米糖浆、葡萄糖浆中的一种或多种。即本发明的配方食品中，提供碳水化合物的原料除含有乳糖的基础原料（如牛乳）外，还可包括原料乳糖和预水解和糊化的淀粉类物质。优选地，基于1000重量份的所述配方粉，其原料包括：乳糖0~580重量份，非乳糖类物质0-580重量份。可在所述范围内调整乳糖的具体添加量以使本发明的含有母乳低聚糖lnnt的蛋白部分水解配方食品碳水化合物含量为50~58g/100g。
16.根据本发明的具体实施方案，本发明的乳蛋白部分水解配方食品，其还包括dha、ara、核苷酸、乳铁蛋白、2
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岩藻糖基乳糖、营养素、益生菌中的一种或多种。优选地，基于1000重量份的所述一种含有母乳低聚糖lnnt的蛋白水解配方粉，其原料包括：dha为8-15重量份，ara为14-28重量份；乳铁蛋白0~0.7重量份；包含钙粉、维生素和矿物质的复配营养素7~50重量份。
17.本发明的一种含有母乳低聚糖lnnt的蛋白部分水解配方食品中，所述的营养素为符合国家标准的营养成分的组合，按照不同配方使用不同添加量。本发明的配方食品根据需要若添加营养素可选择性采用下述复配营养素成分中的任一或任意组合。优选地，所述复配营养素至少包括复配维生素、钙粉、矿物质营养包，各组分用量为：1）复配维生素，每克复配维生素中：牛磺酸：140~340mg维生素a：1700~5800μgre维生素d：25~70μg维生素b1：2000~6800μg维生素b2：3000~6900μg维生素b6：1700~4000μg维生素b
12
：8~20μg维生素k1：200~700μg维生素c：0~700mg维生素e：10~70mg α-te烟酰胺：10000~41550μg叶酸：350~920μg生物素：70~245μg泛酸：7100~25230μg肌醇：0-250mg左旋肉碱：0-60mg。
18.2）矿物质一，每克矿物质一中：铁：20~110mg锌：23~90mg铜：2000~4180μg碘：500~995μg硒：0~200μg
锰：0~579μg。
19.3）矿物质二，每克矿物质二中：钠：40~100mg钾：200~500mg。
20.4）矿物质三，每克矿物质三中：钙：200~500mg磷：75~300mg。
21.5）复配氯化镁，每克氯化镁包中：镁：80~170mg。
22.6）氯化胆碱，每克氯化胆碱包中：胆碱：300~950mg。
23.上述复配营养素的基料优选为乳糖、固体玉米糖浆或l-抗坏血酸钠。基于1000重量份的所述一种含有母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方粉，复配营养素的添加量为7~52重量份，其中，复配维生素营养包优选为2~4重量份，矿物质一营养包优选为0.5~3重量份，矿物质二营养包优选为2~16重量份，矿物质三营养包优选为0.5~20重量份，氯化镁0~3.5重量份，氯化胆碱0~4.5重量份，各营养包的基料优选为乳糖或l-抗坏血酸钠。
24.营养素包中提供各营养素所使用的化合物原料，可能有相互作用。比如硫酸盐可加快维生素的氧化破坏过程，使其利用率降低。因为硫酸盐在水溶液中以离子形式出现，在氧化反应中作为氧化剂诱导维生素的氧化，而破坏维生素的结构。微量元素在氧化还原反应上的能力不同，以铜、锌和铁的活性最强，锰、硒次之。b族维生素和维生素c易受铜离子的影响，维生素b2易受铁离子的影响。
25.为保证营养素的利用效率，本发明选择稳定的营养素剂型，例如：维生素a选用醋酸视黄酯，视黄醇含有1个羟基和5个双键，非常容易氧化，但是视黄醇以醋酸酯的形式下，稳定性会提高很多；维生素e选择醋酸生育酚，生育酚也是非常的不稳定，但是生育酚醋酸酯稳定性提高很多；维生素b1选择硝酸硫胺素，硫胺素的存在形式中，硝酸硫胺素比盐酸硫胺素稳定；维生素c选用l-抗坏血酸钠。
26.上述复配营养素的各组分含量，是指为强化所述营养素物质的添加量，不包括奶粉其他原料中的营养素组分含量。
27.根据本发明的具体实施方案，本发明的配方食品中，所述益生菌为双歧杆菌。优选地，基于1000重量份的所述配方食品，双歧杆菌的添加量为0.1~0.2重量份；再优选为0.18~0.2重量份。更优选地，每重量份双歧杆菌粉含双歧杆菌为3
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10
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cfu以上。更优选地，所述益生菌选自：动物双歧杆菌乳亚种bb-12、婴儿双歧杆菌ylgb-1496、动物双歧杆菌乳亚种hn019和乳双岐杆菌bl-99中的一种或多种。
28.根据本发明的一优选的具体实施方案，本发明的一种配方食品，其原料包括：水解乳清蛋白粉，90~150重量份；乳糖，0~580重量份；固体玉米糖浆，0~580重量份；葵花籽油，0~150重量份；玉米油，0~40重量份；
大豆油，20~80重量份；opo结构脂，0~140重量份；母乳低聚糖lnnt，0.1~40重量份；包含钙粉、维生素和矿物质的复配营养素，7~50重量份；dha，2~15重量份；ara，3~22重量份；2
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岩藻糖基乳糖，0.1~40重量份。
29.可以理解，本发明的一种含有母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方食品中，各原料的具体用量应在满足对配方奶粉产品指标要求的前提下进行调整而确定。本发明的含有母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方食品中，未详细说明或列出的产品性能指标均应按照婴幼儿配方食品或调制乳粉的国家标准及相关标准和法规的规定执行。
30.本发明的含有母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方食品中，各原料均可商购获得，各原料的选用应符合相关标准要求，其中所述母乳低聚糖lnnt应满足本发明所述要求。此外，所述复配营养素也可自行复配。本发明中仅是为方便表述而采用“复配”，并不意味着复配物中各组分必须先混合在一起再应用。各原料均应在满足相关法规前提下添加使用。
31.另一方面，本发明还提供了一种制备所述的母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方粉的方法，其制备的工艺流程主要包括：配料、均质、浓缩杀菌、喷雾干燥、干混得到成品。具体而言，本发明的制备所述的含有母乳低聚糖lnnt的低敏性乳蛋白部分水解配方粉的方法包括：采用湿法或干法生产工艺，将乳糖-n-新四糖与乳蛋白部分水解配方食品中的其他原料混合，制备所述乳蛋白部分水解配方食品。
32.根据本发明的具体实施方案，本发明的含有母乳低聚糖lnnt的部分水解配方粉的制备方法包括：1）粉类添加：各种粉类原料按配方经计量后通过风送系统统一加入到配粉罐中贮存。
33.2）真空吸粉：配粉罐中的各种粉类原料通过真空系统吸入真空混料罐中。
34.3）溶化配油：按配方要求将配方中规定的油脂放入化油间，化油间的温度应保持在50~90℃，待油溶化后，按配方比例要求通过油泵和流量计打入混合油贮罐中。
35.4）混合油料贮存：混合油在油贮存罐中保温贮存，温度40~50℃，贮存时间小于12小时防止脂肪氧化。
36.5）称重：按配方要求将混合油经油泵打入混料罐。
37.6）营养素溶解添加：钙粉、矿物质、维生素等分别添加，用100~200kg纯净水，分别溶解后，打入湿混缸，每打完一种用100kg纯净水冲洗添加罐和管线。
38.7）母乳低聚糖lnnt溶解添加：将母乳低聚糖lnnt原料用步骤6中部分混合料液溶解后，添加到混料罐中，得到含母乳低聚糖lnnt的混合料液。
39.8）过滤：经混合的料液经滤网过滤，去除原料中可能带入的物理杂质。
40.9）均质：混合后的料液通过均质机进行均质，均质一级压力为105
±
5bar，一级压力为32
±
3bar，将脂肪球进行机械处理，把它们分散成均匀一致的脂肪球。
41.10）冷却与贮存：均质后的料液进入板式换热器进行冷却：冷却至20℃以下，暂存
在预存缸中，6小时内进入下道工序，搅拌器按设定需求开启。
42.11）浓缩杀菌：生产时使用双效浓缩，杀菌温度≥83℃，杀菌时间25秒。出料浓度均为48%~52%干物质。
43.12）浓奶贮存、预热过滤、喷雾干燥：浓缩后的奶暂存在浓奶平衡罐。经刮板预热器预热到60~70℃，预热后物料经1mm孔径的过滤器过滤后，用高压泵打入干燥塔喷雾干燥，细粉按要求在塔顶或流化床附聚。进风温度：165~180℃，排风温度75-90℃，高压泵压力160~210bar，塔负压-4~-2mbar。
44.13）流化床干燥冷却：从干燥塔出来的粉再经流化床（一级）二次干燥后，经流化床（二级）冷却到25~30℃。同时母乳低聚糖lnnt与载体混合后加热至60~65℃，在压缩空气作用下，均匀分散到粉表面，使粉颗粒附聚增加其颗粒度和速溶性。
45.14）分装：制粉车间人员按照配方要求，将dha、ara、乳铁蛋白、2
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岩藻糖基乳糖称量封袋分装。
46.15）干混：将称量好的dha、ara、乳铁蛋白、2
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岩藻糖基乳糖与奶粉在干混机内混均。
47.16）筛粉：通过振动筛，使奶粉的颗粒度均匀，粉渣报废处理。
48.17）出粉：用经过消毒的集粉箱接粉，并由出粉间运至上粉间。
49.18）上粉：将奶粉按包装要求倒入大小包装机上的储粉罐中。
50.19）包装：800克自动包装机充氮包装。充氮时含氧量低于1%。900克铁听自动充氮包装含氧量低于5%。
51.20）装箱：将已包装的小袋装入纸箱中同时加入粉勺，用封箱机封口。
52.21）成品检验：对包装完后的产品按检验计划进行抽样检验。
53.22）入库贮存：经检验合格的产品入库贮存，要求在常温下贮存，湿度≤65%。
54.另一方面，本发明还提供了所述的乳蛋白部分水解配方食品在制备改善肠道微环境健康以及增加产品耐受性的食品中的应用。根据本发明的具体实施方案，所述改善肠道微环境健康包括：提高肠道乙酸含量；降低肠道异丁酸和/或异戊酸的量；降低肠道硫化氢的量；和/或提升个体抵御肠道致病菌如etec感染能力。
55.综合而言，本发明提供了一种含有母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方食品及其制备方法与应用，该配方食品有利于改善乳蛋白过敏高风险和胃肠功能不适人群特别是婴儿肠道健康，特别是促进肠道微环境健康。此外，本发明的含有母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方食品，可增加产品耐受性，同时可缩短婴儿对水解配方的使用时间，尽快使用整蛋白配方。
附图说明
56.图1显示模拟婴儿肠道环境下各hmo单体小批量发酵产生乙酸的检测结果。
57.图2显示模拟婴儿肠道环境下各hmo单体小批量发酵产生乙酸占总短链脂肪酸的百分比的结果。
58.图3显示模拟婴儿肠道环境下lnnt和四种hmo单体产生异丁酸的结果。
59.图4显示模拟婴儿肠道环境下lnnt对比其他hmo单体小批量发酵产生异丁酸占总短链脂肪酸的百分比的结果。
60.图5显示模拟婴儿肠道环境下lnnt对比其他hmo小批量发酵产生异戊酸的结果。
61.图6显示模拟婴儿肠道环境下lnnt和四种hmo单体产生硫化氢占总产气的百分比的结果。
62.图7为模拟婴儿肠道环境下lnnt与益生菌的组合小批量发酵产生异戊酸占总酸的百分比。
63.图8为模拟婴儿肠道环境下lnnt与益生菌的组合小批量发酵产生异戊酸的结果。
64.图9为模拟婴儿肠道环境下lnnt与益生菌的组合小批量发酵产生总短链脂肪酸的结果。
65.图10为模拟婴儿肠道环境下lnnt与益生菌的组合小批量发酵产生硫化氢占总产气的百分比的结果。
具体实施方式
66.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
67.除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。实施例中各母乳低聚糖原料来自供应商jennewein，母乳低聚糖的含量检测采用所属领域中的常规方法。实施例中未详细注明的操作条件，按照所属领域的常规操作进行。各实施例中所用水解乳清蛋白粉，分子量分布5000dal以下的蛋白占总蛋白的30%-50%。
68.实施例1本实施例提供了一种含有母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方粉，其原料组成如下（制备1000kg）：水解乳清蛋白粉（水解度8）80% 120kg，乳糖115kg，固体玉米糖浆435kg，高油酸葵花籽油120kg，玉米油40kg，大豆油50kg，opo结构脂80kg，母乳低聚糖lnnt 0.1kg，复配营养素38kg，dha9kg，ara 18kg，核苷酸0.65kg，2
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岩藻糖基乳糖5.4千克。
69.其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0kg、氯化胆碱营养包约2.0kg、钙粉营养包约12kg、钠钾营养素包16kg、矿物质营养包约2kg、氯化镁营养包约3.0kg，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
70.本实施例的含有母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方粉的制备工艺如下：1）粉类添加：各种粉类原料按配方经计量后通过风送系统统一加入到配粉罐中贮存。
71.2）真空吸粉：配粉罐中的各种粉类原料通过真空系统吸入真空混料罐中。
72.3）溶化配油：按配方要求将配方中规定的油脂放入化油间，化油间的温度应保持在50~90℃，待油溶化后，按配方比例要求通过油泵和流量计打入混合油贮罐中。
73.4）混合油料贮存：混合油在油贮存罐中保温贮存，温度40~50℃，贮存时间小于12小时防止脂肪氧化。
74.5）称重：按配方要求将混合油经油泵打入混料罐。
75.6）营养素溶解添加：钙粉、矿物质、维生素等分别添加，用100~200kg纯净水，分别
溶解后，打入湿混缸，每打完一种用100kg纯净水冲洗添加罐和管线。
76.7）母乳低聚糖lnnt溶解添加：将母乳低聚糖lnnt用步骤6中部分混合料液溶解后，添加到混料罐中，得到含母乳低聚糖lnnt的混合料液。
77.8）过滤：经混合的料液经滤网过滤，去除原料中可能带入的物理杂质。
78.9）均质：混合后的料液通过均质机进行均质，均质一级压力为105
±
5bar，一级压力为32
±
3bar，将脂肪球进行机械处理，把它们分散成均匀一致的脂肪球。
79.10）冷却与贮存：均质后的料液进入板式换热器进行冷却：冷却至20℃以下，暂存在预存缸中，6小时内进入下道工序，搅拌器按设定需求开启。
80.11）浓缩杀菌：生产时使用双效浓缩，杀菌温度≥83℃，杀菌时间25秒。出料浓度均为48%~52%干物质。
81.12）浓奶贮存、预热过滤、喷雾干燥：浓缩后的奶暂存在浓奶平衡罐。经刮板预热器预热到60~70℃，预热后物料经1mm孔径的过滤器过滤后，用高压泵打入干燥塔喷雾干燥，细粉按要求在塔顶或流化床附聚。进风温度：165~180℃，排风温度75-90℃，高压泵压力160~210bar，塔负压-4~-2mbar。
82.13）流化床干燥冷却：从干燥塔出来的粉再经流化床（一级）二次干燥后，经流化床（二级）冷却到25~30℃。同时母乳低聚糖lnnt与载体混合后加热至60~65℃，在压缩空气作用下，均匀分散到粉表面，使粉颗粒附聚增加其颗粒度和速溶性。
83.14）分装：制粉车间人员按照配方要求，将dha、ara、乳铁蛋白、2
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岩藻糖基乳糖称量封袋分装。
84.15）干混：将称量好的dha、ara、乳铁蛋白、2
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岩藻糖基乳糖与奶粉在干混机内混均。
85.16）筛粉：通过振动筛，使奶粉的颗粒度均匀，粉渣报废处理。
86.17）出粉：用经过消毒的集粉箱接粉，并由出粉间运至上粉间。
87.18）上粉：将奶粉按包装要求倒入大小包装机上的储粉罐中。
88.19）包装：800克自动包装机充氮包装。充氮时含氧量低于1%。900克铁听自动充氮包装含氧量低于5%。
89.20）装箱：将已包装的小袋装入纸箱中同时加入粉勺，用封箱机封口。
90.21）成品检验：对包装完后的产品按检验计划进行抽样检验。
91.22）入库贮存：经检验合格的产品入库贮存，要求在常温下贮存，湿度≤65%。
92.经检测，本实施例的产品，蛋白质含量9.6g/100g，脂肪含量29g/100g，碳水化合物含量55g/100g，母乳低聚糖lnnt的含量为10mg/100g粉。
93.实施例2含有母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方粉（制备1000kg）：水解乳清蛋白粉（水解度15）80% 200kg，乳糖500kg，高油酸葵花籽油90kg，玉米油10kg，大豆油50kg，opo结构脂110kg，母乳低聚糖lnnt 2.7kg，复配营养素38kg，dha3kg，ara 6kg，核苷酸0.65kg，2
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岩藻糖基乳糖5.4千克。
94.其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0kg、氯化胆碱营养包约2.0kg、钙粉营养包约12kg、钠钾营养素包16kg、矿物质营养包约2kg、氯化镁营养包约3.0kg，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
95.产品制备工艺如实施例1。
96.其中本产品中蛋白质含量16g/100g，脂肪含量26g/100g，碳水化合物含量50g/100g，母乳低聚糖lnnt的含量为270mg/100g粉。
97.实施例3含有母乳低聚糖lnnt的乳蛋白部分水解配方粉（制备1000kg）：水解乳清蛋白粉（水解度15）80% 140kg，固体玉米糖浆530kg，高油酸葵花籽油60kg，玉米油20kg，大豆油70kg，opo结构脂140kg，母乳低聚糖lnnt 30kg，复配营养素38kg，dha9kg，ara 18kg，核苷酸0.65kg，2
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岩藻糖基乳糖5.4千克。
98.其中复配营养素包括复配维生素营养包约3.0kg、氯化胆碱营养包约2.0kg、钙粉营养包约12kg、钠钾营养素包16kg、矿物质营养包约2kg、氯化镁营养包约3.0kg，各营养包的基料为固体玉米糖浆。
99.产品制备工艺如实施例1。
100.其中本产品中蛋白质含量11.2g/100g，脂肪含量29g/100g，碳水化合物含量53g/100g，母乳低聚糖lnnt含量为3000mg/100g粉。
101.母乳低聚糖lnnt调控肠道产酸、产气功效实验一本发明中，通过模拟婴儿肠道环境下发酵实验，测定发酵后产物的气压、气体成分、短链脂肪酸含量，考察了母乳低聚糖lnnt调控肠道产酸、产气功效。
102.样本采集：选取3-6月龄母乳或配方粉喂养的婴儿粪便样本。在上述月龄期间，采集母乳喂养组中每位母亲的口腔拭子一份、新鲜母乳一份、对应的婴儿粪便一份；采集配方粉人工喂养组中每位婴儿的粪便一份。从捐献者处获得新鲜粪便，用冰袋在4小时内运送至实验室，进行发酵，并对发酵产物的气压、气体成分、短链脂肪酸进行测定。
103.1. 培养基配制（1）配制ycfa厌氧基础培养基，每30ml分装于总容积为50ml的厌氧西林瓶中备用。
104.ycfa厌氧基础培养基配方如下（g/l）：胰蛋白胨10，酵母提取物2.5，l-半胱氨酸盐酸盐1，nacl 0.9，cacl2·
6h2o 0.009，kh2po
4 0.45，k2hpo
4 0.45，mgso4·
7h2o 0.09；还包括以下成分：刃天青（1mg/ml）1ml，血红素（5mg/ml）2ml，维生素ⅰ溶液200μl；其中，维生素ⅰ溶液包含（mg/ml）：生物素（vh）0.05，钴胺素（vb12）0.05，对氨基苯甲酸0.15，叶酸0.25，吡哆胺（vb6）0.75。
105.（2）配制本发明实施例所需培养基。
106.发酵实验前，向ycfa厌氧基础培养基中按需添加母乳低聚糖（益生元），构成本发明实施例所需的培养基。本发明实施例中添加的各母乳低聚糖在培养基中的终浓度均为4
‰
。
107.发酵实验中所涉及添加的母乳低聚糖（益生元）如表1所示。其中每种培养基又分为添加etec组和不添加etec组，其中，添加etec组的培养基中所添加的etec终浓度为10
10 cfu/ml。
108.表1、发酵条件列表
2. 体外发酵（1）样本发酵前的准备：准确称取0.800
±
0.010g新鲜粪便，放入粪便前处理盒的搅拌勺一侧，按照质量体积比10%计算并补充相应体积的pbs缓冲液。涡旋约5-10分钟，充分打散粪便残渣，和pbs缓冲液均匀混合，以制备成均匀的10%粪便悬浊液（w/v）。将粪便前处理盒静置于桌面，经两层过滤网过滤之后，得到悬浊液待用。
109.（2）接种：在厌氧工作站中，用1ml注射器配5号针头吸取悬浊液（前处理盒中澄清一侧）0.5ml，穿刺西林瓶丁基胶塞，注入培养基。
110.其中，接种及动态取样均在厌氧工作站中完成，母乳喂养组和人工喂养组每种培养基分别设置5个生物学重复。
111.剩余的粪便原样、粪便悬浊液可按需求分装，做好标记并进行冻存，以备其他检测使用。冷冻粪便样本在30分钟内化冻后，与培养基轻柔的混合，作为初始培养物质加入到批量发酵培养基中，并持续混合溶液，维持理想的混合均一度。因为化冻时间一致，各组在初始的细菌组成相似。
112.（3）发酵：如需进行产气分析，开始发酵前，用气压计进行发酵0小时的西林瓶气压检测并记录。随后将西林瓶放置于37℃恒温箱静置培养24小时，勿扰动。
113.培养结束后，取出小瓶，勿开盖，直接冻存于-20度待检测。
114.3. 气体检测取出发酵小瓶，用气压计进行发酵终点（24小时）的气压检测并记录，并使用气体分析仪（hl-qt01，湖南海路生物科技有限公司）进行气体成分的检测。
115.具体而言，该仪器由一个气体采样器、阀门模块、真空发生器和集成了多个气体传感器的气体检测室组成。所述配气模块是借助真空发生器来控制气体检测室引入的气量。检测步骤如下：
①
检测空白培养基中的气体，进行仪器校准；
②
通过配气模块，使用真空发生器将气体检测室调节到一定的真空水平；
③
通过气体采样器，将小瓶中的气体吸入仪器的检测室，通过配气模块调节气体体积；
④
分别使用对应的气体传感器，检测进入气体检测室的co2，h2，ch4，h2s共4种气体；
⑤
通过预置软件计算气体比例。
116.4. 短链脂肪酸检测使用气相色谱仪（9720，浙江福立分析仪器股份有限公司）检测短链脂肪酸浓度，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸。具体步骤如下：（1）进样前准备：使用无菌针头吸取500μl发酵液置于1.5ml离心管中，加入100μl巴豆酸偏磷酸溶液，置于-30℃冻结24h。解冻后10000rpm、4℃离心3min，取上清，并用0.22μm过滤器（millipore）过滤，取100μl样品提取液加入气相样品瓶内插管中，用盖子盖紧排除气泡后，上样分析。
117.（2）气相色谱仪器条件如下：色谱柱：agilent ffap 30m
×
0.25mm
×
0.25μm；柱温：75℃，20℃/min升至180℃保持1min，50℃/min升至220℃保持1min；进样口温度：250℃，进样量：1.0μl，分流比：（5:1）；载气：高纯氮；流速：2.5ml/min保持6.5min，升至2.8ml/min保持2min；检测器：fid；温度：250℃；尾吹：20ml/min；氢气：30ml/min；空气：300ml/min。
118.（3）利用峰面积内标法进行定量测定，利用工作站内置软件根据标准曲线方程内标法自动计算。
119.5. 功效考察实验结果模拟婴儿肠道环境下各hmo单体小批量发酵产生乙酸的检测结果参见图1，lnnt和四种hmo单体及对照组的显著性差异情况及p值见表2。
120.表2可以看出lnnt和四种hmo单体及对照组相比，在母乳喂养和配方奶粉喂养的婴儿粪便发酵组中，无论是否添加etec模拟腹泻，均增加了乙酸。其中以lnnt效果更显著，且优于其他hmo单体。
121.模拟婴儿肠道环境下各hmo单体小批量发酵产生乙酸占总短链脂肪酸的百分比的结果参见图2，lnnt和四种hmo单体及对照组的显著性差异情况及p值见表3。
122.表3
可以看出lnnt和四种hmo单体及对照组相比，在母乳喂养和配方奶粉喂养的婴儿粪便发酵组中，无论是否添加etec模拟腹泻，均增加了乙酸的占比。其中以lnnt效果更显著，且优于其他hmo单体。
123.模拟婴儿肠道环境下lnnt和四种hmo单体产生异丁酸的结果参见图3，显著性差异情况及p值见表4。
124.表4可以看出在配方奶粉喂养的婴儿粪便发酵组中，无论是否添加etec模拟腹泻，与空白相比，hmo单体的加入会减少异丁酸的产生。其中添加lnnt效果显著，且在无etec时优于3-fl、3
’‑
sl和lnt，与2
’‑
fl效果相当；在有etec时，lnnt优于3
’‑
sl和lnt，与2
’‑
fl和3-fl效果相当。
125.模拟婴儿肠道环境下lnnt对比其他hmo单体小批量发酵产生异丁酸占总短链脂肪酸的百分比的结果参见图4，显著性差异情况及p值见表5。
126.表5可以看出在母乳和配方奶粉喂养的婴儿粪便发酵组中，无论是否添加etec模拟腹泻，与空白相比，加入hmo单体可能会减少异丁酸的产生。其中添加lnnt效果显著，且在有无
etec时均优于3-fl、3
’‑
sl和lnt，与2
’‑
fl效果相当。
127.模拟婴儿肠道环境下lnnt对比其他hmo小批量发酵产生异戊酸的结果参见图5，显著性差异情况及p值见表6。
128.表6可以看出在配方奶粉喂养的婴儿粪便发酵组中，无论是否添加etec模拟腹泻，与空白相比，加入hmo单体可能会减少异戊酸的产生。其中添加lnnt效果显著，且在无etec时优于3-fl、3
’‑
sl，与lnt和2
’‑
fl效果相当。在有etec时lnnt优于3
’‑
sl。
129.模拟婴儿肠道环境下lnnt和四种hmo单体产生硫化氢占总产气的百分比的结果参见图6，显著性差异情况及p值见表7。
130.表7可以看出在母乳喂养和配方奶粉喂养的婴儿粪便发酵组中，无论是否添加etec模拟腹泻，hmo单体的加入会影响硫化氢的产生。其中添加lnnt效果显著，且优于3-fl、3
’‑
sl和lnt，与2
’‑
fl效果相当。
131.母乳低聚糖lnnt与益生菌组合调控肠道产酸、产气功效实验二本发明中，通过模拟婴儿肠道环境下发酵实验，测定发酵后产物的气压、气体成分、短链脂肪酸含量，考察了母乳低聚糖lnnt与益生菌组合调控肠道产酸、产气功效。
132.实验中所涉及添加的益生菌和益生元如表8所示。其中每种培养基均分为添加或不添加etec两种情况。所添加的etec终浓度为10
10 cfu/ml。
133.表8、发酵条件列表2. 菌株活化及鉴定分别取菌株bb12，ylgb-1496，hn019及bl-99菌粉，在厌氧工作站中配制至10
7 cfu/ml，使用平板计数法检测浓度。配制培养基之前，将保种于-80℃冰箱中的甘油管菌种取出，接种于mrs培养基中进行活化，随后将活化好的菌液用注射器接种到相应的培养基中。
134.取菌株etec（atcc35401）菌粉，在厌氧工作站中配制至10
10 cfu/ml，使用平板计数法检测浓度。
135.实验方法的其他操作基本同母乳低聚糖lnnt与益生菌组合调控肠道产酸、产气功效实验一。
136.模拟婴儿肠道环境下lnnt与益生菌的组合小批量发酵产生异戊酸占总酸的百分比，结果见图7所示。
137.可以看出在所有实验组别中，lnnt与益生菌的组合优于空白和四种益生菌单独作用组。且在配方粉组，lnnt与益生菌的组合产生异戊酸占总酸的百分比较lnnt更低。
138.模拟婴儿肠道环境下lnnt与益生菌的组合小批量发酵产生异戊酸的结果见图8所示。可以看出在所有实验组别中，lnnt与益生菌的组合优于空白和四种益生菌单独作用。
139.lnnt与益生菌的组合与lnnt的显著性差异情况及p值见表9。由表9可知，lnnt与益生菌的组合比lnnt，更显著降低了异戊酸（p《0.0001），体现了二者组合的协同效应。lnnt分别与四种益生菌的组合之间没有显著性差异，其中lnnt+bl-99相比lnnt+bb12，降低异戊酸的趋势较大（p=0.1254）。
140.表9
lnnt与益生菌的组合（lnnt+bl-99效果最佳）产生异戊酸占总酸的百分比较lnnt及益生菌单独使用时更低。
141.模拟婴儿肠道环境下lnnt与益生菌的组合小批量发酵产生总短链脂肪酸的情况，结果见图9所示。可以看出在所有实验组别中，lnnt与益生菌的组合优于空白和四种益生菌单独作用。
142.进一步对lnnt与不同益生菌的组合进行组间比较，结果如表10所示。
143.表10由表10可知在无etec时，四种组合物在配方粉中产总酸的量均高于母乳组（p《0.05）。其中lnnt和bl-99在有etec时，在配方粉中仍能产生较母乳组更多的短链脂肪酸，说明其有助于建立更健康的肠道环境（p=0.0229）。
144.模拟婴儿肠道环境下lnnt与益生菌的组合小批量发酵产生硫化氢占总产气的百分比的结果见图10所示。由图10可以看出在所有实验组别中，lnnt与益生菌的组合优于空白和四种益生菌单独作用组。
145.进一步比较不同组别的结果如表11所示。
146.表11
由表11可知，在均有或均无etec的情况下，相较母乳喂养组，配方粉喂养来源的婴儿粪便会导致肠道产生较多的硫化氢。在母乳组中，有无etec可产生显著性差异，在配方粉组则无此差异，说明在配方粉喂养时，etec不是影响硫化氢产生的主要因素，相反地，etec的存在对母乳喂养的婴儿，可能导致产生更多的硫化氢气体。
147.针对母乳无etec组进一步比较发现，lnnt+bl-99的组合产生的硫化氢低于lnnt单体（p《0.05），lnnt+bb12以及lnnt+ylgb-1496与lnnt虽无显著性差异，但有显著性趋势，即p《0.1，说明上述lnnt与益生菌的组合可以产生协同增益效应。比较结果参见表12。
148.表12针对母乳有etec组，不同发酵条件下产硫化氢没有观察到显著性差异。比较结果参见表13。
149.表13在配方粉无etec组中，lnnt+ylgb-1496及lnnt+bl-99产生的硫化氢低于lnnt（p《0.05），lnnt+hn019与lnnt虽无显著性差异，但有显著性趋势，即p《0.1，说明上述lnnt与益生菌组合之后，可以协同增效并更多地减少硫化氢的产生。比较结果参见表14。
150.表14
表15表15分析显示，在配方粉有etec组中，不同发酵条件下产硫化氢没有观察到显著性差异。