赤芍总单萜苷的应用及赤芍总单萜苷中活性成分的分析方法

本发明属于赤芍总单萜苷用途领域。

背景技术：

1、赤芍paeoniae rubraradix(prr)为芍药科(ranunculaceae)芍药属(paeonia)植物芍药paeonia lactiflora pall.或川赤芍p.anomala subsp.veitchii(lynch)d.y.hong&k.y.pan的干燥根。其气微香、味微苦、酸涩、微寒，归肝经，具有清热凉血、散瘀止痛的功效。现代药理研究表明，赤芍的药理活性较多，应用极其广泛，可用于多种疾病的治疗，包括抗菌、抗肿瘤、抗肌肉萎缩等，有着极高的药用价值。

2、虽然目前国内外学者对于赤芍治疗患有肌肉萎缩小鼠的报道较多，但尚无赤芍对于正常小鼠增肌作用的研究。

技术实现思路

1、本发明提供了一种增肌的化合物，另外采用uplc-ms/ms和多元统计分析方法，建立“谱效关系”模型，从而系统研究赤芍总单萜苷的增肌作用，探索其主要活性成分。本发明方法能够进一步发掘与药理作用有效成分相对应的各种药材，并确定其药效学物质基础。本发明为赤芍在健身食品开发上提供基础，并对能够增加肌肉的动物饲料的开发提供实验依据。

2、本发明中赤芍总单萜苷在制备增加肌肉的动物饲料或药物中的应用。

3、进一步地限定，所述动物为哺乳动物。

4、本发明还提供了赤芍总单萜苷中活性成分的分析方法，具体步骤如下：

5、步骤1、测定不同产地赤芍总单萜苷的总还原力、·oh-、·dpph、·o2-与abts+自由基清除率，设为同等重要，每组数据的最大值作为1，最小值作为0，然后将所有数据归一化，按公式为y＝y1×1/5+y2×1/5+y3×1/5+y4×1/5+y5×1/5，计算数值后列表，从中分析抗氧化能力强弱；

6、步骤2、进行拉力和游泳时间，腓肠肌及附睾脂肪指数，及组织病理学实验并获取结果；采用spss 29.0软件对上述实验中所涉及的数据进行处理，计量数据用平均数±标准差-x±s)的形式来表示，并对数据进行重复测量方差分析，以及采用duncans multiplerange test方法进行单因素方差分析，p＜0.05记为具有显著性差异；

7、步骤3、精确称量来自不同来源的3.75g赤芍总单萜苷粉末，分别进行下述操作：用10ml70％(体积)乙醇稀释，然后取1.0ml以12000r·min-1高速离心5min，再用0.22μm微滤膜过滤上清液，等待检测；

8、步骤4、获取uplc-ms/ms数据；

9、步骤5、然后用xcalbur 4.2软件处理，通过对正负离子质谱图的分析比较，在查阅相关文献的基础上，利用二次质谱学的信息，利用chembl数据库和pubchem网站确定物质组成，得到准确的相对分子质量；

10、步骤6、将各产地赤芍总单萜苷的总离子色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版)，通过软件建立赤芍总单萜苷指纹图谱；

11、步骤7、以小鼠拉力系数、游泳时间、腓肠肌指数为参考序列，以赤芍总单萜苷共有峰面积为对比序列，将各药效学指标的公共峰面积和数据分组列表，并输入以下公式进行计算：

12、选择上述指数作为参考序列，记为x0(k),k＝1,2,3,…,m，

13、选择共有峰的峰面积作为比较序列，记为xi(k),i＝1,2,3,…,n，

14、由于参考序列和比较序列的单位不同，因此需要无量纲处理，采用均值化的方法分别对参考序列和比较序列进行处理，求平均值的公式如下：

15、

16、式中，x(k)-为数据均值化结果，x(k)-为参考数列和比较数列，为参考数列和比较数列的平均值，

17、x0(k)与xi(k)的灰色关联系数loi(k)由下式公式计算：

18、loi(k)＝(△min+△max)/(△oi(k)+ρ△max)

19、式中，loi(k)-为两比较序列差的绝对值，即△oi(k)＝|xo(k)-xi(k)|(1≤i≤m)，△max-为所有比较序列绝对差中的最大值，△min-为所有比较序列绝对差中的最小值，ρ-为分辨系数，一般取0.5。

20、关联度是参考数列和比较数列关联系数的平均值，其计算公式如下：

21、

22、式中，roi-为关联度，即关联系数的平均值，n-为样本数量，loi(k)-为灰色关联系数；

23、步骤8、将各药效指标的共有峰和各药效指标的数据分组列表，并对数据进行标准化处理，将赤芍总单萜苷有效部位指纹图谱的13个共有峰(矩阵x)和赤芍增肌作用的药效指标(矩阵y)两组变量输入spss 29.0软件，用软件中的神经网络多层感知器模块进行相关性研究，前者为协变量，后者为应变量，通过自变量重要分析，筛选药效指标的活性成分，赤芍总单萜苷共有峰峰面积作为自变量(矩阵x)，小鼠拉力系数、游泳时间、腓肠肌指数为因变量(矩阵y)，归一化是根据以下公式计算的：

24、x0＝(x-xmin)/(xmax-xmin)+0.0001

25、式中，x0-为数据标准化结果，x-为各组数据数值，xmin-为各组数据中最小值，xmax-为各组数据中最大值，

26、步骤9、选取与赤芍总单萜苷活性密切相关的抗氧化活性、拉力系数、游泳时间、腓肠肌指数作为参考序列进行灰色关联分析与神经网络分析，鉴定出活性成分。

27、步骤10、利用excel软件中的correl函数计算抗氧化活性、拉力系数、游泳时间、腓肠肌指数与药效相关化合物色谱峰总面积的相关系数。

28、本发明的赤芍单萜苷的增肌作用；通过实验验证了赤芍单萜苷具有很好的增肌效果，共鉴定出5种具有增肌作用的成分。其中单萜苷类化合物有4个，有一个属于苯甲酰芍药苷的同分异构体，其余三个为albiflorin、4-o-galloylalbiflorin、isopaeoniflorin；鞣质类化合物有1个，为pentagalloylglucose。本发明赤芍中的单萜苷提取物相互作用，对于正常小鼠具有一定程度地增肌效果。

29、本发明首次采用了uplc-ms/ms技术建立了11批不同产地的赤芍总单萜苷指纹图谱，为揭示赤芍总单萜苷的有效成分群奠定了基础。运用多元统计分析方法，共确定了以赤芍总单萜苷为主的具有增肌作用的5个化合物，其中单萜苷类化合物有4个，有一个属于苯甲酰芍药苷的同分异构体，其余三个为albiflorin、4-o-galloylalbiflorin、isopaeoniflorin；鞣质类化合物有1个，为pentagalloylglucose。上述5个峰的峰面积总和与小鼠拉力系数大小呈正相关，表明赤芍总单萜苷具有增肌作用且与上述五个化合物的含量相关。结合药效学结果，与各给药组相比，ab(阿坝)、df(道孚)、cb(池坝)组以上5个化合物的峰面积总和较大，因此增肌效果较好，且显著高于蛋白粉(阳性)组(p＜0.05)。其余各给药组与灌服蛋白粉组的pg增肌效果相当，相比之下均无显著性差异(p＞0.05)。结合前期网络药理学筛选出的与增肌作用相关性较强的化合物与指纹图谱结果推测，起到的增肌效果为上述5种化合物共同作用的结果。赤芍总单萜苷在制备增加肌肉的动物饲料或药物中的应用。本发明建立了赤芍总单萜苷指纹图谱-药效相关模型，建立了以赤芍总单萜苷有效部位指纹图谱为基础的增肌作用的质量评价标准的同时，也为赤芍其他药理作用活性成分的筛选提供了新的思路。本发明填补了赤芍总单萜苷类活性成分对增肌作用研究的空白，完成赤芍总单萜苷提取物增肌作用成分的确定，对赤芍的进一步开发和资源利用具有重要意义——为健身人群增肌食品的开发奠定理论基础，为畜牧业动物饲料添加剂的开发提供新资源。

30、本发明旨在为今后赤芍在健身食品开发上提供基础，在能够增加肌肉的动物饲料添加剂的开发上提供实验依据。本发明建立了赤芍总单萜苷指纹图谱-药效相关模型，填补了赤芍总单萜苷类活性成分对正常小鼠增肌作用研究的空白，对赤芍的进一步开发和资源利用具有重要意义。