一种纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法

(一)本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、松茸(tricholoma matsutake)，又名松口蘑、松菌，属担子菌门担子菌纲伞菌目口蘑科(tricholomataceae)口蘑属真菌，其子实体就是我们所说的食用菌“松茸”。新鲜松茸形若伞状，色泽鲜明，菌盖呈褐色，菌柄为白色，肉质白嫩肥厚，质地细密，有浓郁的特殊香气。野生松茸因其产量少、价值高而显得极其珍贵，被誉为“万菌之王”。松茸含有丰富的营养成分和活性物质，主要包括多糖、甾体、皂苷、油脂、三萜、多种必需氨基酸和维生素等。在食用价值方面，松茸口感如鲍鱼，润滑爽口，味道鲜美，营养极其丰富，深受人们喜爱；在药用价值方面，《中华本草》就有记载，松茸甘、平、无毒，舒经活络、理气化痰、利湿别浊，主腰腿疼痛、手足麻木、经络不舒、痰多气短、小便淋沥。现代药理学研究表明，松茸具有增强免疫、抗癌、治疗糖尿病、促肠胃、保肝脏、改善心血管疾病、抗衰老养颜等多种功效。松茸已经成为全球化的天然滋补类真菌，其提取物在药品、食品和化妆品的应用开发方兴未艾。

2、目前，有不少关于松茸提取物制备方法的报道，按提取使用的溶剂，方法可以分为两类，即乙醇提取法和水提取法。乙醇提取法主要用于三萜、黄酮、多酚等醇溶性物质的提取等，产品适用于化妆品和药品中使用；水提取法主要用于多糖，蛋白、多肽、低聚糖和氨基酸等水溶性物质的提取，产品适合使用在食品领域。在这两种方法的基础上，有辅以超声波或微波强化提取，能提高提取物的得率。超声辅助提取的设备要求低，不会显著增加提取成本，但对提高提取得率的效果不够理想；微波辅助提取的耗时短、效率高，但由于内部高温，往往会导致提取的活性成分结构被破坏。

3、近年来，酶解技术在食用菌和植物的活性成分的提取中有广泛应用，它是用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶等，在适宜的条件下水解食用菌或植物原料，其细胞壁被水解，从而有利于胞内活性成分在提取时溶出。酶解辅助法不仅能够显著提高提取得率，条件温和，不会破坏提取物中活性成分的结构；而且，酶解作用可以降低多糖的分子量，以及将一些糖苷转化为苷元，提取物的生物活性会更好。

4、为了提高松茸提取物的得率和抗氧化活性，本发明用纤维素酶酶解松茸后，再使用超声波热水提取，提取物的得率、多糖含量和抗氧化活性可以显著提高。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法，将纤维素酶的酶解技术和超声波提取技术应用于松茸提取物的制备，松茸经纤维素酶酶解后，再经超声波热水提取，提取物的得率显著提高，多糖含量增加，抗氧化活性也显著提高。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法，所述方法为：(1)松茸经干燥、切片和粉碎，加入去离子水和纤维素酶，搅拌均匀，构成松茸酶解体系；(2)松茸酶解体系于水温为35–45℃中，酶解4–6h后，转入沸水浴中提取30–40min，再于超声波65–75℃提取40–60min，趁热过滤，收集滤液，得松茸水提液；(3)松茸水提液经减压浓缩，真空干燥，粉碎，获得松茸提取物。

4、进一步，步骤(1)所述的松茸是口蘑科(tricholomataceae)口蘑属真菌tricholoma matsutake的子实体。松茸经85℃烘干后，切成薄片，粉碎过60目筛。

5、进一步，步骤(1)所述的去离子水加入体积是按松茸粉质量计的20–30ml/g[即料液比为1:20–1:30(g:ml)]。

6、进一步，步骤(1)所述的纤维素酶加入量是按松茸粉质量计的6％–8％；所述的纤维素酶单位酶活为100u/mg。

7、进一步，步骤(2)所述超声波频率为40khz，功率是100–140w。

8、进一步，步骤(3)从松茸水提液回收松茸提取物的方法为：松茸水提液于55℃、–0.1mpa条件下减压浓缩至原去离子水体积的1/10–1/15，获得松茸水提浓缩物，浓缩物于60℃、–0.1mpa真空干燥，粉碎，得松茸提取物。

9、进一步，本发明所述的纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法，具体按以下步骤操作：

10、(1)新鲜松茸清洗干净，经85℃烘干后，切成薄片，粉碎后过60目筛，得松茸粉；

11、(2)松茸粉于三角烧瓶中，加入松茸粉质量计的20–30ml/g去离子水[即料液比为1:20–1:30(g:ml)]，加入按松茸粉质量计6％–8％的纤维素酶，搅拌均匀，构成松茸酶解体系；

12、(3)松茸酶解体系于水温为35–45℃中，酶解4–6h，转入沸水浴中提取30–40min，再于功率为100–140w、温度65–75℃超声波(频率为40khz)中，提取40–60min，趁热过滤，收集滤液，得松茸水提液；

13、(4)松茸水提液于55℃、–0.1mpa条件下减压浓缩至原去离子水体积的1/10–1/15，获得松茸水提浓缩物；

14、(5)松茸水提浓缩物于60℃、–0.1mpa真空干燥，粉碎，得松茸提取物。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明松茸先经过纤维素酶酶解，纤维素酶能够水解松茸细胞壁中的纤维素，使细胞壁破损；再用超声波热水提取，超声波的空穴效应能增强物质分子的运动频率和速度，两者联合作用有助于细胞壁中与纤维素结合的物质和胞内物质溶出，提取物的得率显著提高，多糖含量也显著提高。本发明提供的纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法，较直接采用热水提取法相比，松茸提取物的得率可以提高34.3％，多糖含量增加22.3％，提取物的抗氧化活性也有显著提高。

16、(四)具体实施方式

17、下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

18、本发明实施例所用的松茸是口蘑科(tricholomataceae)口蘑属真菌tricholomamatsutake的子实体。

19、本发明实施例所述的纤维素酶的活力单位为100u/mg。

20、本发明实施例所述的松茸提取物的提取得率按公式1计算：

21、

22、实施例1：纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法1

23、一种纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法，可以按如下步骤操作：

24、(1)市售新鲜松茸清洗干净，经85℃烘干后，切成薄片，粉碎后过60目筛，得松茸粉；

25、(2)5g松茸粉于250ml三角烧瓶中，加入100ml的去离子水[即料液比为1:20(g:ml)]，加入纤维素酶0.3g(松茸粉质量的6％)，搅拌均匀，构成松茸酶解体系；

26、(3)松茸酶解体系于水温为35℃中，酶解6h，转入沸水浴中提取30min，再于功率为100w、温度65℃超声波(频率为40khz)中提取60min，趁热过滤，收集滤液，得松茸水提液；

27、(4)步骤(3)制备的全部松茸水提液于55℃、–0.1mpa条件下减压浓缩至10ml(原去离子水体积的1/10)，获得松茸水提浓缩物；

28、(5)步骤(4)制备的全部松茸水提浓缩物转入一洁净培养皿中，60℃、–0.1mpa真空干燥，粉碎，得提取物2.48g，减去加入的0.3g纤维素酶，松茸提取物质量为2.18g，得率为43.6％。

29、对比例1：实施例1中，步骤(2)中不加纤维素酶；步骤(3)中，在沸水浴提取30min后，再于65℃保温60min(未超声)，其他步骤完全相同，5g松茸可制备得1.63g提取物，得率为32.6％。

30、比较实施例1与对比例1的结果，可以看出，增加纤维素酶协同超声波处理，松茸的提取物得率由32.6％提高到43.6％，提高了33.7％。

31、实施例2：纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法2

32、一种纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法，可以按如下步骤操作：

33、(1)市售新鲜松茸清洗干净，经85℃烘干后，切成薄片，粉碎后过60目筛，得松茸粉；

34、(2)5g松茸粉于250ml三角烧瓶中，加入125ml的去离子水[即料液比为1:25(g:ml)]，加入纤维素酶0.35g(松茸粉质量的7％)，搅拌均匀，构成松茸酶解体系；

35、(3)松茸酶解体系于水温为40℃中，酶解5h，转入沸水浴中提取35min，再于功率为120w、温度70℃超声波(频率为40khz)中提取50min，趁热过滤，收集滤液，得松茸水提液；

36、(4)步骤(3)制备的全部松茸水提液于55℃、–0.1mpa条件下减压浓缩至10ml(原去离子水体积的1/12.5)，获得松茸水提浓缩物；

37、(5)步骤(4)制备的全部松茸水提浓缩物转入一洁净培养皿中，60℃、–0.1mpa真空干燥，粉碎，得提取物2.66g，减去加入的0.35g纤维素酶，松茸提取物质量为2.31g，，得率为46.2％。

38、对比例2：实施例2中，步骤(2)中不加纤维素酶；步骤(3)中，在沸水浴提取35min后，再于70℃保温50min(未超声)，其他步骤完全相同，5g松茸可制备得1.72g提取物，得率为34.4％。

39、比较实施例2与对比例2的结果，可以看出，增加纤维素酶协同超声波处理，松茸的提取物得率由34.4％提高到46.2％，提高了34.3％。

40、实施例3：纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法3

41、一种纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物的方法，可以按如下步骤操作：

42、(1)市售新鲜松茸清洗干净，经85℃烘干后，切成薄片，粉碎过60目筛，得松茸粉；

43、(2)5g松茸粉于250ml三角烧瓶中，加入150ml的去离子水[即料液比为1:30(g:ml)]，加入纤维素酶0.4g(松茸粉质量的8％)，搅拌均匀，构成松茸酶解体系；

44、(3)松茸酶解体系于水温为45℃中，酶解4h，转入沸水浴中提取40min，再于功率为140w、温度75℃超声波(频率为40khz)中提取40min，趁热过滤，收集滤液，得松茸水提液；

45、(4)步骤(3)制备的全部松茸水提液于55℃、–0.1mpa条件下减压浓缩至10ml(原去离子水体积的1/15)，获得松茸水提浓缩物；

46、(5)步骤(4)制备的全部松茸水提浓缩物转入一洁净培养皿中，60℃、–0.1mpa真空干燥，粉碎，得提取物2.62g，减去加入的0.4g纤维素酶，松茸提取物质量为2.22g，得率为44.4％。

47、对比例3：实施例3中，步骤(2)中不加纤维素酶；步骤(3)中，在沸水浴提取40min后，再于75℃保温40min(未超声)，其他步骤完全相同，5g松茸可制备得1.68g提取物，得率为33.6％。

48、比较实施例3与对比例3的结果，可以看出，增加纤维素酶协同超声波处理，松茸的提取物得率由33.6％提高到44.4％，提高了32.1％。

49、实施例4纤维素酶协同超声波辅助制备松茸提取物多糖含量分析

50、采用苯酚-硫酸法测定实施例1–3和对比例1–3制备的松茸提取物的多糖含量，具体方法如下：

51、用去离子水将松茸提取物配制成浓度为1mg/ml的水溶液，取1ml松茸提取物水溶液于10-ml离心管中，再加入4ml的无水乙醇(体系的乙醇体积分数为80％)，充分振荡后于4℃条件下静置12h后，8000r/min离心10min，弃上清液，加10ml去离子水溶解，得松茸提取物的多糖水溶液。

52、1ml松茸提取物的多糖水溶液于10-ml具塞管中，加1ml体积浓度为5％的苯酚水溶液，摇匀后迅速加入5ml浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后置沸水浴中加热15min，冷却至室温。以1ml去离子水代替多糖水溶液的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(a490)。以相同方法测定不同浓度葡萄糖样品的a490，绘制葡萄糖浓度—a490标准曲线，得回归方程，由回归方程计算测定的松茸提取物的多糖含量。

53、所述的松茸提取物的多糖含量按公式2计算：

54、

55、由实施例1–3、对比例1–3制备松茸提取物的多糖含量见表1。

56、表1不同实施例和对比例制备的松茸提取物多糖含量

57、

58、由表1数据可以看出，实施例1–3制备的松茸提取物的多糖含量均显著高于对比例1–3，说明采用纤维素酶协同超声波辅助制备的松茸提取物多糖含量，较非酶解未超声法制备有显著提高。

59、实施例4纤维素酶协同超声波辅助制备的松茸提取物抗氧化活性

60、用dpph法测试了实施例1–3、对比例1–3制备松茸提取物抗氧化活性。

61、松茸提取物的抗氧化活性测定采用的dpph法，具体方法为：松茸提取物用去离子水配制成1–5g/l的待测提取物水溶液，1ml不同浓度的待测提取物水溶液于试管中，加入3ml浓度为0.1mmol/l的dpph溶液(2,2-联苯基-1-苦基肼基，95％乙醇配制，现配现用)，摇匀，室温避光反应20min后，以95％乙醇做参比，于波长517nm处测定吸光值(as)；以1ml去离子代替待测提取物水溶液，按如上操作，测定空白组的517nm吸光值(ab)；1ml待测提取物水溶液于试管中，加入3ml的95％乙醇摇匀，按如上操作，测定对照组的517nm吸光值(ac)，按公式3计算dpph自由基清除率。

62、

63、按本实施例测定方法，由实施例1–3、对比例1–3制备松茸提取物dpph自由基清除活性见表2。

64、表2不同实施例和对比例制备的松茸提取物的dpph自由基清除率

65、

66、由表2结果可以看出，实施例1–3制备的松茸提取物的抗氧化活性均显著高于对比例1–3，如在浓度为2g/l时，实施例2制备的松茸提取物的抗氧化活性(65.1％)较对比例2(48.8％)提高了33.4％。以上结果说明松茸经过酶解后，再用超声波热水提取，提取物的抗氧化活性也显著提高。