一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用

本发明属于水产养殖，具体涉及一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用。

背景技术：

1、牛蛙(rana catesbeiana)属于脊索动物门(chordate)、两栖纲(amphibia)、无尾目(anura)、蛙科(ranidae)，为蛙属中的大型食用蛙。其肉质鲜美，营养丰富，具有高蛋白、低脂肪等特点，其肌肉氨基酸总量占干物质总量90.01％，鲜味氨基酸含量27.91％，为食品中不可多得的优质蛋白质源之一。

2、牛蛙原产于北美洲，于1959年从古巴引入我国。近年来牛蛙养殖业在我国发展迅速，2021年全国牛蛙养殖产量超过50万吨，已成为新兴的特种水产养殖品种之一。

3、牛蛙养殖密度高，病害频发，不但给养殖业造成极大经济损失，而且也危害食品安全。牛蛙养殖中的疾病主要包括细菌性疾病(如：红腿病、腹水病)、真菌性疾病(如：壶菌病)、寄生虫疾病(如：隐孢子虫病)、病毒性疾病(雷纳病毒)等。其中细菌性疾病是牛蛙养殖中最常见、最严重的疾病之一。感染牛蛙发病的细菌病原菌主要有铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、摩根氏菌(morganella morganii)等，主要症状包括红腿、皮肤溃烂、腹部肿大等。在广东省某牛蛙养殖场的牛蛙蝌蚪养殖生产中，有蝌蚪肚子出现红色症状，随后腹部积水肿大，进而死亡。目前尚未发现牛蛙蝌蚪中该症状的相关报道，故我们暂命名其为红肚病。

4、目前，在牛蛙养殖过程中主要通过使用抗生素等化学药物来防控病害。然而，这类药物长期使用易导致药物残留、引起致病菌产生抗药性，从而引发食品安全问题。因此，研究一种绿色安全环保且可有效预防病害发生的方法十分必要。

5、微生态制剂是从动物或自然界分离、鉴定或通过生物工程人工组建的有益微生物，经培养、发酵等工艺制成的含有活菌并用于动物的生物制剂。微生态制剂是利用特定微生物与病原菌之间的相互作用或竞争关系，控制病原菌繁殖，从而达到改善宿主健康的目的，为绿色安全环保且可替代化学药物的有效方法之一。

6、乳酸菌(lactic acid bacteria，lab)作为一类微生物制剂，凭借其良好的益生作用在水产养殖中应用广泛。乳酸菌为无芽孢、革兰氏染色阳性菌，为一类能够利用可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的细菌总称。乳酸菌在水产养殖中的作用机制主要为：一，乳酸菌可分泌淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和植酸酶等消化酶，促进机体消化吸收；二，乳酸菌可产乳酸、乙酸等有机酸，降低环境ph值，抑制腐败菌和致病菌繁殖；三，乳酸菌产生类似细菌素的细小蛋白质或肽，可杀灭李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病菌，提高宿主存活率。

7、乳酸菌的作用主要体现在对水产动物肠道菌群的优化、生长性能的提高及其抗病能力的增强等方面。唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)隶属于乳杆菌属(lactobacillus)，为有益菌之一。目前唾液乳杆菌在水产养殖中的研究应用主要集中在鱼、虾、蟹等，而国内针对乳酸菌来改善牛蛙肠道菌群、提高抗病能力的应用未见报道。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用。

2、本实验从市售泡菜中分离出一株唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)gzph2。所述的唾液乳杆菌为lactobacillus salivarius gzph2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2014年11月27日，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号：cctcc m2014598。该菌株在专利“cn104611251a、一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌及其应用”中公开。

3、唾液乳杆菌gzph2对39株受试致病菌株中的33株表现出抗菌活性，并且gzph2(上清液)对13株致病菌达到了强抑菌活性(+++，抗菌直径>15mm)。

4、本发明利用唾液乳杆菌gzph2调节牛蛙蝌蚪肠道菌群结构，提升有益菌的相对丰度，降低(潜在)有害菌的相对丰度，进而促进牛蛙蝌蚪的生长，抑制牛蛙蝌蚪红肚病的发生，提高蝌蚪存活率。通过将唾液乳杆菌gzph2培养液拌喂于牛蛙蝌蚪饲料中实现。

5、本发明的目的通过下述技术方案实现：

6、本发明提供一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用，所述的唾液乳杆菌为lactobacillus salivariusgzph2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2014年11月27日，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号：cctccm2014598；

7、所述的应用是将唾液乳杆菌gzph2培养液拌喂于牛蛙蝌蚪饲料中实现，拌喂于牛蛙蝌蚪饲料中的唾液乳杆菌gzph2浓度为106～108cfu/g。

8、优选地，所述的唾液乳杆菌gzph2培养液的制备方法，包括如下步骤：

9、(1)将唾液乳杆菌菌株接种到mrs液体培养基中培养得到种子液；

10、(2)接种步骤(1)所述种子液到mrs液体培养基中再次培养，得到浓度为1～5×109cfu/ml的唾液乳杆菌。

11、更优选地，步骤(1)中，所述的培养的条件为在37℃的条件下培养24h；

12、步骤(2)中，所述的再次培养的条件为在37℃的条件下培养24h。

13、优选地，所述mrs液体培养基通过如下步骤制备得到：称取蛋白胨5g，牛肉浸粉5g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，吐温-80 1g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，七水合硫酸锰0.25g，七水合硫酸镁0.1g，最终ph6.5，在121℃、0.1mpa下灭菌处理20min，保存备用。

14、优选地，从蝌蚪刚孵出开始，到变态发育前，每日投加2次含有唾液乳杆菌gzph2培养液的牛蛙蝌蚪饲料。

15、本发明还提供一种牛蛙蝌蚪饲料，所述牛蛙蝌蚪饲料中含有唾液乳杆菌gzph2，唾液乳杆菌gzph2在饲料中的浓度为106～108cfu/g；

16、所述的唾液乳杆菌为lactobacillus salivariusgzph2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2014年11月27日，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号：cctcc m2014598。

17、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

18、(1)本发明提供了一种唾液乳杆菌在牛蛙蝌蚪养殖中的应用。从蝌蚪刚孵出开始，到变态发育前，将唾液乳杆菌gzph2培养液拌喂于每天的牛蛙蝌蚪饲料中，可提高牛蛙蝌蚪体重增长率，降低蝌蚪红肚病的患病率，提高其存活率。同时，该方法有无药物残留、不产生耐药性、可大面积使用的优点。

19、(2)本发明提供了一种改善牛蛙蝌蚪肠道菌群的方法。唾液乳杆菌gzph2培养液可调控牛蛙蝌蚪肠道菌群结构，降低潜在致病菌的丰度，进而蝌蚪肠道健康状况。具体地，唾液乳杆菌gzph2可提高严格梭菌属(clostridium_sensu_stricto_1)、romboutsia、微杆菌属(microbacterium)等有益菌的相对丰度；能够显著降低引发蝌蚪红肚病的潜在细菌病原：摩氏摩根菌(morganella)、漫球菌属(vagococcus)、丛毛单胞菌属(comamonas)的相对丰度；还可降低引发蝌蚪红肚病的潜在真菌病原：meyerozyma-candida_clade、nakaseomyces-candida_clade和unclassified_f__aspergillaceae的相对丰度，且使用20天后，meyerozyma-candida_clade和nakaseomyces-candida_clade均不存在。