一种具有缓解过敏功能的活性母乳低聚糖制剂及其应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有缓解过敏功能的活性母乳低聚糖制剂及其应用。

背景技术：

1、食物过敏是指身体对某些食物成分产生异常的免疫反应。当人体的免疫系统错误地将食物中的蛋白质视为有害物质时，会产生过敏反应。食物过敏的症状可以涉及多个器官系统，包括皮肤、呼吸系统、消化系统和循环系统等。常见的症状包括皮疹、荨麻疹、皮肤瘙痒、口腔肿胀、呼吸困难、恶心、腹痛等。在严重的情况下，食物过敏还可能引发过敏性休克，对健康造成损害，甚至危及生命。

2、th1和th2细胞是t淋巴细胞的亚群，它们在免疫调节和炎症反应中发挥重要作用。正常情况下，th1和th2细胞之间应该保持平衡，以确保免疫系统对抗感染和病原体的能力。食物过敏时，免疫系统会出现th1/th2细胞的偏向性失衡，表现为th2细胞过度活化和th1细胞功能受抑制。这种失衡会导致过度的免疫反应，引发过敏症状。具体来说，食物过敏时，食物中的过敏原被摄入后，免疫系统会产生过敏特异性ige抗体，当再次暴露于相同的过敏原时，ige抗体会与过敏原结合，激活机体的免疫反应，导致th2细胞活化并释放过敏相关的细胞因子。这些细胞因子进一步增强th2细胞的活性，形成一个正反馈循环，导致过敏症状的加剧。同时，th1细胞的功能可能受到抑制，导致其产生的干扰素γ(ifn-γ)减少。ifn-γ对于抑制过敏反应和维持免疫平衡非常重要。因此，th1/th2细胞失衡导致免疫系统对抗过敏原的能力下降，使过敏症状更加严重或持续。

3、食物过敏的主要原因是某些食物中的特定蛋白质成分，被称为过敏原。常见的食物过敏原包括牛奶、鸡蛋、花生、坚果、大豆、鱼类、贝类、小麦和虾等。

4、食物过敏常常出现交叉现象，比如对食物甲过敏的人一段时间后又会对食物乙过敏。有些食物过敏一段时间后能好转。

5、食物过敏的易感性受到基因和环境的双重影响，其中生活习惯和膳食情况会显著改变食物过敏状况。

6、对于大部分类型的食物过敏而言，婴幼儿的发病率显著高于成人，且呈逐年上升趋势。对于已经确诊为食物过敏的人，最行之有效的方法是避免接触过敏原，这意味着需要注意食物标签，避免食用含有过敏原的食物。但对于处于高速生长发育阶段且食物种类高度受限的婴幼儿而言，回避致敏原不但会严重影响生长发育，而且在很多情况下无法贯彻实施。

技术实现思路

1、针对婴幼儿过敏难以实施回避致敏原的现状，本发明通过对活性母乳低聚糖与食物过敏的关联机制的研究，提供了一种具有缓解过敏功能的活性母乳低聚糖制剂及其应用，其具体技术方案如下：

2、第一方面，本发明提供了一种具有缓解过敏功能的活性母乳低聚糖制剂，包括乳糖-n-岩藻五糖i(lnfp-i)与2＇-岩藻糖基乳糖(2＇-fl)中的一种或多种。

3、进一步地，所述制剂包括乳糖-n-岩藻五糖i与2＇-岩藻糖基乳糖。

4、进一步地，所述乳糖-n-岩藻五糖i与2＇-岩藻糖基乳糖以质量计的比例为1：1～3。

5、母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，hmo)是一类复合糖，是母乳中第三丰富的固体成分(仅次于脂肪和乳糖)，由五种单糖(d-葡萄糖、d-半乳糖、n-乙酰氨基葡萄糖、l-岩藻糖和唾液酸)以不同方式连接而成。目前已经发现了超过200种活性母乳低聚糖。有研究表明母乳低聚糖具有广泛的生物学活性，包括支持肠道菌群生长、抗感染、免疫调节和维持肠道屏障稳态等。

6、研究表明，母乳低聚糖之间存在很强的结构-功能相关性(structure-functionrelationships)。换言之，不同结构的母乳低聚糖具有不同的功能。母乳低聚糖发挥生物效应时具有高度结构特异性和剂量依赖性，表明它们只能与特定的宿主或微生物受体相互作用。某些生物效应只能由特定的母乳低聚糖发挥，其他结构不同的母乳低聚糖无法模仿。某些生物效应需要一组由不同母乳低聚糖按特定比例组成的混合物来发挥。多种母乳低聚糖通过共同作用来调节微生物群落的组成和活性以及复杂的免疫系统反应，单独一种母乳低聚糖没有这种作用。

7、母乳低聚糖的构成在女性之间存在较大的个体差异，基因是影响母乳低聚糖构成的最重要的母体因素，特定的糖基化酶参与合成母乳低聚糖，编码这类糖基化酶基因的单核苷酸多态性(snps)可以改变母乳低聚糖的构成，还可使母乳中某一种母乳低聚糖整体缺失。其他母体因素对母乳低聚糖构成有更微妙的影响，可使部分母乳低聚糖的绝对浓度和/或相对丰度持续增加或减少。

8、基于基因背景,母亲可以合成各种不同类型的母乳低聚糖。其中母乳低聚糖岩藻糖基化主要与lewis血型抗原和分泌类型有关。2种岩藻糖基转移酶(fucosyltransferases,futs)-fut2和fut3在母乳低聚糖岩藻糖基化的过程中起到重要的作用。约21％的母亲没有fut2,表现为其母乳中不含有2'-岩藻糖基乳糖和乳糖-n-岩藻五糖i。

9、在本发明中，结合不同母乳低聚糖的结构区别以及多次反复试验，得到具有缓解过敏功能的两种母乳低聚糖：乳糖-n-岩藻五糖i与2＇-岩藻糖基乳糖，人体摄入的这两种母乳低聚糖中的一部分可以进入系统循环调节免疫细胞群和细胞因子分泌，以此直接影响人体的免疫系统，对于部分婴幼儿存在的过敏现象可以起到较好的缓解作用，并且对于母乳不含有2'-岩藻糖基乳糖和乳糖-n-岩藻五糖i的婴幼儿，本发明提供的制剂可以起到对母乳营养的补充作用。

10、第二方面，本发明提供了一种具有缓解过敏功能的活性母乳低聚糖制剂的制备方法，将2＇-岩藻糖基乳糖以及乳糖-n-岩藻五糖i，溶解于缓冲溶液中，得到活性母乳低聚糖制剂。

11、进一步地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。

12、第三方面，本发明还提供了一种具有缓解过敏功能的活性母乳低聚糖制剂在制备缓解过敏的功能性食品的应用，使用抗过敏活性母乳低聚糖制剂。

13、第四方面，本发明还提供了活性母乳低聚糖制剂在建立免疫细胞过敏模型中的应用，所述免疫细胞过敏模型建立方法包括以下步骤：

14、(1)取出冻存的小鼠骨髓来源树突状细胞dc2.4细胞株，经复苏活化及传代，将细胞置于细胞培养箱中(37℃，5％ co2条件)培养；

15、(2)将balb/c雌性小鼠断颈处死，在超净工作台中取出脾脏，经研磨、裂解红细胞、洗涤以及细胞培养基重悬，制备得到小鼠脾脏单细胞悬液。并利用磁珠分选方法从脾脏单细胞悬液中纯化t细胞；

16、(3)将以上所述的细胞分别接种在12孔细胞培养板中。以每组3个生物学平行将细胞分为对照组、致敏组和干预组，将其置于细胞培养箱中(37℃，5％ co2条件)培养；

17、(4)提取细胞中的总rna，用核酸蛋白浓度仪检测rna浓度，进行后续实验。提取的rna立即进行反转录操作合成cdna，然后进行rt-qpcr操作，以β-actin为内参基因，按照2-δδct法计算得出目的基因相对表达量。

18、本发明中，对制得的制剂进行效果上的验证，在建立免疫细胞过敏模型时，所使用的致敏原为卵清蛋白(ova)，分别对促炎因子ox40l、抑炎因子il-10、th2型细胞因子il-5、th1型相关细胞因子t-bet、th2型细胞因子il-4、th1型相关细胞因子ifn-γ的基因相对表达量进行计算。

19、在本发明提供的免疫细胞过敏模型中，细胞受ova刺激后，促炎因子ox40l的基因表达量显著上升，th2型细胞因子il-5的基因表达量显著上升，th2型细胞因子il-4的基因表达量显著上升，th1型相关细胞因子t-bet的基因表达量下降，th1型相关细胞因子ifn-γ的基因表达量上升，说明细胞处于致敏状态，产生了th2型炎症反应。

20、活性母乳低聚糖制剂干预后，受ova刺激升高的ox40l基因表达量显著降低，il-4基因表达量显著降低，il-10基因表达量进一步上升，t-bet基因表达量显著上升，ifn-γ基因表达量进一步上升。说明本发明提供的活性母乳低聚糖制剂可以通过对th1/th2细胞平衡进行调控，有效的缓解过敏症状。

21、本发明具有如下有益效果：

22、(1)本发明的活性母乳低聚糖制剂能够显著调节受致敏原ova刺激而升高的il-4等的表达量，增强il-10等的分泌，在基因表达水平上调控食物过敏反应；

23、(2)本发明还可补充因基因问题母乳中缺乏的部分母乳低聚糖。