一种水产动物用中草药复方饲料添加剂及其制备方法与应用与流程

本发明属于水产品养殖领域，涉及一种水产动物用中草药复方饲料添加剂及其制备方法与应用。

背景技术：

1、大口黑鲈(micropterus salmoides)俗称加州鲈，隶属鲈形目、鲈亚目、太阳鱼科、黑鲈属，自然分布于北美洲美国中部、东部至墨西哥北部的淡水流域，是北美最重要的游钓鱼类之一。大口黑鲈为广温性鱼类，具有生长快、易起捕、肉质鲜美、肌间刺少，肌肉紧实似海水鱼，有“淡水黄鱼”之美称，深受养殖者和消费者欢迎。然而，随着集约化养殖程度不断提高以及养殖环境恶化，大口黑鲈病害逐渐增多，既影响养殖经济效益也易诱发产品质量安全问题。

2、维氏气单胞菌(aeromonas veronii)可感染包括大口黑鲈、尼罗罗非鱼(oreochromis niloticus)、斑点叉尾鮰(ictalurus punctatus)、日本沼虾(macrobrachium nipponense)在内的多种经济水产动物，所引发的病害在全球范围频繁暴发，对水产养殖业的健康发展造成阻碍，有效防治维氏气单胞菌的感染愈发重要。目前对于维氏气单胞菌引起的鱼类疾病多使用抗生素进行治疗。但是，随着抗生素的广泛使用，超时、超量且不对症滥用的现象愈演愈烈，负面效应日益显著。药物滥用造成的环境污染、药物残留、耐药性等问题成为了当前食品安全和水产品销售的绿色贸易壁垒。越来越多的病例报告表明，维氏气单胞菌的耐药性仍在不断增强。随着禁抗时代的来临，如何实现大口黑鲈等水产动物的健康养殖，保证养殖经济效益与产品质量安全，是亟需探索与解决的问题。

3、中草药在预防和治疗动植物各种疾病方面有着重要价值，能以多机制、多靶点对病毒、细菌、真菌以及其他病原生物产生抑制甚至杀灭作用，同时可有效增强宿主动物的免疫力和抗病力，兼具治疗性与保健性的作用。此外，中草药对于细菌耐药性具有独特的作用机制，能以消除耐药质粒、下调耐药基因的表达、增加细胞膜通透性、阻碍细菌生物膜形成、抑制细菌主动外排泵和β-内酰胺酶等途径逆转细菌耐药性。中草药来源广泛、价格低廉，具有低残留、无副作用、不污染环境等优点，被视为抗菌药物的理想替代品，展现出广阔的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种水产动物用中草药复方饲料添加剂，该中草药复方饲料添加剂对水产动物如大口黑鲈促生长和抗病具有积极作用，可作为饲料添加剂拌饲料投喂，使用方便有效。

2、本发明的技术方案为：

3、一种水产动物用中草药复方饲料添加剂，该中草药复方饲料添加剂是以五倍子、诃子、苏木、石榴皮、地榆和乌梅为原料，将各中草药原料经水熬制得到的药液混合制成的。

4、优选的，所述的中草药复方饲料添加剂是由以下方法制备得到的：以五倍子、诃子、苏木、石榴皮、地榆和乌梅为原料，各自制备药液，每种中草药的药液的制备方法相同：按照中草药原料和水的用量比1:20g/ml先浸泡1h，提取两次，每次提取的方法为大火煮沸后文火熬制2h，合并两次滤液，文火浓缩至滤液(以提取用水的体积计)体积的2.5％，得到浓缩液；将五倍子、诃子、苏木、石榴皮、地榆和乌梅的药液按照体积比(4～5):(2～4):(2～3):(1～5):(1～5):(1～5)或5:2:1:5:4:3混合，得到中草药复方饲料添加剂。

5、优选的，五倍子、诃子、苏木、石榴皮、地榆和乌梅的药液的体积比为4:4:2:5:3:1、5:2:1:5:4:3、5:3:2:1:5:4、5:4:3:2:1:5。

6、最优选的，五倍子、诃子、苏木、石榴皮、地榆和乌梅的药液的体积比为5:4:3:2:1:5。

7、所述的水产动物是大口黑鲈、尼罗罗非鱼、斑点叉尾鮰、日本沼虾。

8、本发明的另一个目的是提供一种所述的水产动物用中草药复方饲料添加剂的制备方法，包括：分别制备6种中药草的药液，每种中草药的药液的制备方法相同：按照中草药原料和水的用量比1:20g/ml，将中草药原料在水中浸泡1h，提取两次，每次提取的方法为大火煮沸后文火熬制2h，合并两次滤液，文火浓缩至滤液体积的2.5％，得到药液；将五倍子、诃子、苏木、石榴皮、地榆、乌梅的药液混合，得到水产动物用中草药复方饲料添加剂。

9、五倍子：五倍子的活性成分主要包括鞣质及没食子酸，鞣质能够与蛋白质、多糖、生物碱、微生物、酶、金属离子反应，具有抗氧化、抗炎症等生物活性，可缓解机体的氧化应激，改善肠道的菌群结构，促进动物生长。以没食子酸为原料可以合成没食子酸酯类化合物，这些酯类化合物具有优良的抗氧化性能。研究表明，五倍子具广谱抗菌作用，对大肠杆菌、志贺杆菌、肠炎沙门杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌等菌均有抑制作用。

10、乌梅：乌梅是我国传统的药食同源中药，其主要化学成分类型为有机酸类、黄酮类、萜类、多糖类等。现代药理研究表明，乌梅具有调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、抑菌等作用。乌梅果实中含有丰富的枸橼酸和苹果酸，可抗菌、抗炎，或使组织蛋白沉淀凝固，在创面形成保护膜，起到收敛止泻、止血的作用。黄酮类物质具有抗炎、降血糖、抗肿瘤、抗肝纤维化等功效。

11、诃子：诃子的主要成分为单宁、三萜类物质、小檗碱、酚酸类物质等，具有收敛、抗菌、降低内毒素损伤及炎症反应、抗氧化以及提升肠道屏障功能等多方面功效。诃子多酚所含酚羟基可清除自由基，而诃子中的多糖则可通过增强抗氧化酶活性、清除自由基及降低脂质过氧化物含量等途径起到抗氧化作用。研究表明，诃子的提取物对大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、铜假绿单胞菌等病原菌具有较强的抑制作用。

12、苏木：苏木具有活血祛瘀、消肿止痛等功效，其化学成分复杂，以酚类化合物为主，包括原苏木素类、巴西苏木素类、高异黄酮类和查耳酮类等，具有很强的抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、免疫抑制及改善血糖的作用。

13、石榴皮：石榴皮含有鞣质类化合物、黄酮类化合物、生物碱、多糖和有机酸等生物活性物，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降血压等多种生物活性。石榴皮鞣质可以清除生物体内过多的自由基，维护细胞膜的流动和蛋白质的构象，防止辐射诱发的dna断裂，具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤等作用。安石榴苷具有很好的抗氧化能力，可有效清除羟自由基和dpph自由基。石榴皮中的黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌均具有明显的抑制作用。

14、地榆：地榆含有鞣质类、酚酸类、三萜及三萜皂苷类、木脂素类、黄酮类、甾体类及脂多糖类等多种天然活性物质，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗衰老、止血、抗氧化、抗急性肾损伤、抗肿瘤等药理作用。

15、本发明所述的大口黑鲈用中草药复方饲料添加剂遵循“君、臣、佐、使”的配伍原则。乌梅富含的有机酸能有效促进体内乳酸分解，解除疲劳，改善精神状态，能增进食欲，同时具有较强的抗菌能力和抗氧化能力；五倍子具有广谱抗菌作用，还可提高动物消化酶活性，促进动物生长；乌梅和五倍子作为“君药”可有效提高大口黑鲈生长率和抗病能力。诃子具有增强胃肠动力、通便防便秘的作用；苏木水煎液能降低血糖、血尿素氮以及肌酐水平，改善肾脏功能，二者作为“臣药”对提高大口黑鲈饲料利用和促进其生长具有重要作用。地榆和石榴皮都是良好的天然抗氧化剂，作为“佐药”和“使药”，可提高大口黑鲈抗氧化力，促进大口黑鲈健康生长。

16、研发过程中，发明人开展了乌梅、五倍子、黄连、山楂、杜仲等33种中草药对大口黑鲈源维氏气单胞菌(aeromonas veronii)的抑菌能力研究。具体方法为：制备药液：各称取20g中草药，于400ml水中常温浸泡1h，大火煮沸后文火熬制2h，纱网过滤，再重复一次上述熬制步骤，合并两次滤液，文火浓缩至20ml，得到药液，药液的浓度为1000mg/ml(以初始中草药质量和药液终体积计)。采用96孔板法测定中草药对目的菌的最小抑菌浓度(mic)。无菌96孔板a-d列1-12行分别加入灭菌mh肉汤100μl；无菌96孔板a-d列第1行加入中草药100μl，用水逐次倍比稀释至第11列(每孔液体终体积100μl，最后一列稀释完后吸取100μl去掉)，使1-11列药液浓度分别为500mg/ml(2倍)、250mg/ml(4倍)、125mg/ml(8倍)、62.5mg/ml(16倍)、31.25mg/ml(32倍)、15.63mg/ml(64倍)、7.81mg/ml(128倍)、3.91mg/ml(256倍)、1.95mg/ml(512倍)、0.98mg/ml(1024倍)、0.49mg/ml(2048倍)；a-c的1-11行各孔加入待测菌液10μl，作为实验组，第12孔不加入菌液与药液，作为做阴性对照；d列1-11孔不加入菌液，作为空白对照，12孔加入10μl菌液，作为对照查看是否生长细菌；药物和菌液上样完毕后，盖上盖子，置于28℃培养24h观察结果。观察结果，取高于mic的浓度涂布于lb营养琼脂培养基上，28℃倒置培养18h。观察结果，少于5个单菌落的浓度即为待测中草药的最小杀菌浓度(mbc)。33种中草药对大口黑鲈源维氏气单胞菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度试验结果如表1所示。

17、表1.33种单方中药对维氏气单胞菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

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19、试验发现五倍子、诃子、石榴皮、地榆、乌梅、苏木等六种中草药抑菌效果最佳；连翘、黄连、黄芩、牡丹皮、艾叶、大黄、紫花地丁效果次之；夏枯竹、千里光、白头翁、黄柏、防己、厚朴、枸杞抑菌效果尚可，其余中草药效果不突出或不稳定。

20、结合试验结果，选取五倍子、诃子、石榴皮、地榆、乌梅、苏木结合正交设计做复方配伍，研究了乌梅、五倍子、石榴皮、诃子、苏木、地榆6种中草药的25组复方对维氏气单胞菌的体外抑菌作用。具体试验方法为：将五倍子、诃子、石榴皮、地榆、乌梅、苏木6种中草药药液按照表2所示体积比混合均匀，每组的终体积为1000μl，参照上述mic和mbc测定方法检测复方中草药对大口黑鲈源维氏气单胞菌的抑菌情况。试验结果见表2，发现五倍子、诃子、苏木、石榴皮、地榆和乌梅的药液按照体积比(4～5):(2～4):(2～3):(1～5):(1～5):(1～5)或5:2:1:5:4:3均能获得较好的效果，尤其是五倍子、诃子、苏木、石榴皮、地榆和乌梅的药液按照体积比＝5:4:3:2:1:5抑菌效果最好。

21、表2.复方中草药的体外抑菌结果

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23、本发明的另一个目的是提供一种水产动物用饲料，它是在基础饲料中添加所述的水产动物用中草药复方饲料添加剂制成的；每100g基础饲料添加0.5～2ml所述的水产动物用中草药复方饲料。

24、优选的，按每100g饲料添加2ml水产动物用中草药复方饲料添加剂。

25、优选的，按每100g饲料添加3个鸡蛋的蛋清。

26、本发明的另一个目的是提供一种水产动物用饲料的制备方法，包括：将复方中草药复方饲料添加剂与3个鸡蛋的蛋清搅拌混匀，再加入基础饲料，充分混匀，自然风干，获得含有中草药复方饲料添加剂的饲料。

27、本发明具有以下技术效果：

28、本发明将五倍子、诃子、苏木、石榴皮、地榆、乌梅进行合理配伍，制备得到的中草药复方饲料添加剂对大口黑鲈具有显著的促生长和抗病效果，作为饲料添加剂使用操作方便。

29、在大口黑鲈配合饲料中添加0.5％～2.0％的中草药复方饲料添加剂，喂养期30d，结果显示：在基础饲料中添加2.0％的中草药复方添加剂，试验组大口黑鲈的增重率、成活率、肝体比最高；试验组大口黑鲈血液中过氧化氢酶(cat)、总抗氧化能力(t-aoc)、碱性磷酸酶(akp)及酸性磷酸酶(acp)活性均高于对照组，说明中草药复方添加剂对催化大口黑鲈体内过氧化氢分解、提高大口黑鲈血清的总抗氧化能力、改善大口黑鲈acp和akp活性均有一定促进作用。人工感染维氏气单胞菌试验中，试验组死亡率均低于对照组，表明该中草药复方添加剂可提高大口黑鲈的抗维氏气单胞菌抗感染能力。