乳杆菌（Lactobacillus casei化irota)的诱变后代涂布其中一个平板后，再用纤维素 膜影印至另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置， 平板C出现菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌 落甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆菌，命名为LcS-Mef，保藏于MRS固体培养基（斜面）中。
[0123] (3)BN-NKPQQ-RWX-202 的活化培养
[0124] 将保存于豆芽汁绿豆汁固体培养基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-202取一环，接种 至豆芽汁绿豆汁液体培养基活化，培养温度35C，培养结束菌种密度达到10 9c化/mL左右。
[0125] (4) LcS-Met-的活化培养
[0126] 将保存于MRS固体培养基（斜面）中的LcS-Mef取一环，接种至MRS液体培养基 37C活化培养，培养结束菌种密度达到10 9c化/mL左右。
[0127] (5)富含NK和PQQ的绿豆乳的发酵制备
[0128] 将活化的BN-NKPQQ-RWX-202与LcS-Met-混合，使混合菌液中二者密度比为 l:5aX10 8CFM/mL:5X108CFM/mL)，混合菌液W5%接种量接种绿豆乳发酵培养基，37°C六 层纱布封口培养36h，得到富含NK和PQQ的绿豆乳。绿豆乳培养基中所含豆芽汁、酪氨酸、 谷氨酸和麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-202合成NK和PQQ进行代谢调控，豆芽汁有利于纳豆芽 抱杆菌增殖，麦芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通过肤键连接环化而成。发 酵结束后，绿豆乳中NK活力llOOU/mL，PQQ含量81ng/mL。所获得的绿豆乳除富含纳豆激 酶和化咯唾晰酿之外，呈均一淡绿色，组织细腻均匀，具有绿豆乳固有的滋味和发酵后特有 的风味。
[0129] 本发明中采用色谱法测定PQQ，具体步骤参照"Noji N,化kamura T,Kit址ata N, et al. Simple and sensitive method for pyrroloquinoline quinone(PQQ)analysis in various foods using liquid chromatography/electrospray-lonization tandem mass spectrometry. J Agri Food Qiem, 2007, 55(18):7258-7263."。
[0130] 本发明中采用琼脂糖-纤维蛋白原平板法测定NK活力。测定步骤；将发酵液过滤 后点种在琼脂糖-纤维蛋白平板上，37C赔育1她，W尿激酶作为标准品，通过测量透明圈 直径计算纳豆激酶相当于尿激酶的活力单位扣/mL)。
【主权项】
1. 一种含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进 行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳 豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-202 ; 2) 、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌， 命名为干酪乳杆菌LcS-Met_; 3) 、将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-202和干酪乳杆菌LcS-Met_共发酵绿豆汁，得到富 含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的绿豆乳。
2. 根据权利要求1所述的含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，其特征在于，步骤1) 中，所述的高通量筛选具体包括：①制备2个平板豆芽汁绿豆汁固体培养基，其中一个将小 鼠抗PQQ IgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平板B ; ②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代涂布其中一个平板后，再 用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板；③平板A中，高产吡咯喹 啉醌的诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀圈，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断产吡 咯喹啉醌量大小；④平板B中，高产纳豆激酶的诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透 明圈直径大小可肉眼判断产纳豆激酶活力高低；⑤平板A与平板B中，高产吡咯喹啉醌菌落 与高产纳豆激酶菌落处于同一位置者，即为高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌。
3. 根据权利要求2所述的含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，其特征在于，步骤1) 中，所述的平板豆芽汁绿豆汁固体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 绿豆汁 100?150mL; 鹿糖 4.0?6.0g; 琼脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4. 根据权利要求1所述的含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，其特征在于，步骤2) 中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括：①制备2个平板MRS 固体培养基，其中一个将甲硫氨酸配入，为平板C，另一个为单纯MRS固体培养基平板，为平 板D ;②将诱变后的干酪乳杆菌涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使 平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置，平板C出现菌落而平板D 未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌落为甲硫氨酸营养缺陷型 干酪乳杆菌。
5. 根据权利要求4所述的含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，其特征在于，步骤2) 中，所述的平板MRS固体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氧二按 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸锰 0.25g; 琼脂 20g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； 该MRS固体培养基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根据权利要求1所述的含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，其特征在于，步骤3) 中，在共发酵之前，将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-202和干酪乳杆菌LcS-Met_分别进行活 化培养，纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-202在豆芽汁绿豆汁液体培养基中进行活化培养，培 养温度为34?36°C，干酪乳杆菌MRS液体培养基中进行活化培养，培养温度为 36 ?38?。
7. 根据权利要求6所述的含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，其特征在于，步骤3) 中，所述的豆芽汁绿豆汁液体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 绿豆汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. Og ; 豆芽汁余量； 所述的MRS液体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 柠檬酸氢二铵 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸锰 0.25g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； 该MRS液体培养基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根据权利要求1所述的含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，其特征在于，步骤3) 中，将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-202和干酪乳杆菌LcS-Met_共发酵绿豆汁，具体包括： 将活化后的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-202和干酪乳杆菌LcS-Met_混合，形成混合菌液， 将混合菌液接种至含绿豆汁的绿豆乳发酵培养基，纱布封口培养后得到富含纳豆激酶和吡 咯喹啉醌的绿豆乳。
9. 根据权利要求8所述的含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，其特征在于，步骤3) 中，所述的绿豆乳发酵培养基以IL计，由以下量的组分组成： 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麦芽糖 20.0g; Λ7:芽 ?Ι· IOOmL; 绿豆汁 余量。
10. 根据权利要求1所述的含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，其特征在于，步骤3) 中，所述的绿豆汁的制备包括：在水中加绿豆，浸泡2?12小时，在90°C?99°C碾磨成浆 汁，得到绿豆汁，其中，所述的水的体积与绿豆的质量比为IOOmL :10?25g。
【专利摘要】本发明公开了一种含食疗成分的发酵绿豆乳的制备方法，包括：将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变，然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，并在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌；将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌；将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵绿豆汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的绿豆乳。本发明得到的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的绿豆乳中，吡咯喹啉醌含量达到67-81ng/mL，纳豆激酶活力达到635-1100U/mL。
【IPC分类】C12R1-07, C12N15-03, C12R1-245, C12N15-01, A23C11-10
【公开号】CN104522182
【申请号】CN201410751527
【发明人】徐薇薇, 张哲滔, 林语秋, 阮晖, 莫凡
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日