>[0115] 实施例1-用于牛物棹制中的非致病产乳酸微牛物
[0116] 生物控制微生物的测量
[0117] 本文中公开的方法的几个实施方案涉及使用非致病微生物来防止或降低接受温 度滥用的食品中的致病微生物的生长和/或活性。特别地，具有低酸含量的特定食品特别 易受致病微生物（例如，肉毒梭菌）的生长和活性的影响。
[0118] 以下的实验评价了各种乳杆菌属种的特征，在HPP前（HPP条件用于获得病原体 (如大肠杆菌、沙门氏菌属、单核细胞增生性李斯特氏菌）至少51og降低）加入（例如）低 酸汁液中时，如具有高于约5的pH的胡萝卜汁或水果/蔬菜汁，足量的乳杆菌属保持有活 力；足量在操作上限定为：
[0119] ⑴如果汁液受到温度滥用（例如，暴露于高于约40° F的温度），在致病肉毒梭 菌可以生长前，剩余的乳杆菌具有将PH降至低于约4.6的能力（例如，生物控制）；和
[0120] (ii)如果产品没有受到温度滥用（例如，储存在40° F或更低温度下）；
[0121] 剩余的乳杆菌没有生长并且食品没有变化（例如，关于其pH)。
[0122] 因此，满足这些标准的细菌（例如，生物控制和HPP的结合）符合FDA关于确保低 酸冷藏汁液对热滥用的安全性的准则。有利地，在几个实施方案中，这得到了实现，而不需 要可能不利地影响汁液风味的外源性PH调节。
[0123] 高压处理，也称为HPP，在杀灭病原体（如大肠杆菌、沙门氏菌属和单核细胞增生 性李斯特氏菌）中是有效的。与热巴氏消毒相比，HPP在杀灭不同类型（属和/或种）的 微生物中的有效性具有一些不同也是已知的。换句话说，一些品种的微生物与其他相比更 能抵抗HPP。如以上讨论的，特定的致病微生物（例如，孢子）能抵抗HPP。有利地，已经发 现了特定的非致病微生物相对能抵抗HPP。例如，来自乳杆菌属的同型发酵的某些微生物 (组1)相对能抵抗HPP。同型发酵乳杆菌的一个非限制性实例是嗜酸乳杆菌（也认为是益 生菌）。其中，组1的其他非限制性实例包括嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、唾液乳 杆菌。令人惊讶地，不是所有同型发酵乳酸细菌能够同样强壮地在HPP中存活，因此，在一 些实施方案中，将其他类型的乳杆菌（例如，异型发酵的）用于几个实施方案中。
[0124] 评价了各种乳杆菌株在各种HPP条件中存活的能力。筛选了每个种的特征的简 述，筛选的结果和使用的HPP条件概括于表1中。
[0125] 表1-非致病微生物和HPP存活
[0126]
[0128] 这些结果表明了几种微生物在HPP (在约87, OOpsi下30-200秒）中存活，与初始 接种物相比，具有最小的数量降低或无降低。例如，在90秒停留时间下，乳酸片球菌（球 菌）显示出基本上根本无降低，而干酪乳杆菌（杆菌）显示出仅有一 log降低。此外，出乎 预料地，同型发酵乳酸细菌以外的微生物能抵抗HPP。因此，在几个实施方案中，使用同型发 酵乳酸细菌，而在其他实施方案中，异型发酵乳酸细菌令人惊讶地能抵抗HPP并使用。这些 数据还表明了微包胶提供了一定的增加的HPP抵抗力。因此，在几个实施方案中，任选地使 用微包胶的乳酸细菌。
[0129] 设计了实验来评价显示出相对良好的HPP抵抗力的微生物的各种株在暴露于非 冷藏温度时在降低低酸汁液的pH中的功效。最初，将几瓶对照汁液和几瓶接种的汁液储存 在~50° F至~70° F，以确定测试汁液在HPP后的pH的时间点。然而，发现了在HPP中存 活的内源性微生物存在于对照汁液中，产生气体（CO 2)并在70° F下约3天后将pH降至低 于4. 6。DNA分析表明了微生物是异型发酵乳酸细菌（乳明串珠菌（Leuconostoc lactis) 和丙酸杆菌（Propionibacterium)的混合物。
[0130] 设计了实验来评价各种HPP抗性微生物在各种接种水平下的功效。将生胡萝卜汁 用作低酸汁液，用于这些实验，尽管如上讨论的，生物控制可以与各种其他低酸水果和/或 蔬菜汁一起使用。选择显示出良好HPP抗性的两个株作为可以用于本文中公开的方法中的 那些的实例，乳酸片球菌和干酪乳杆菌。使用了两个接种水平（HPP后汁液中将存在的哪种 生物控制微生物的估算值），即，5x IO2和5x 10 4CFU/克。在HPP前进行了总微生物计数， 并且随后进行了 HPP(87K PSI下90秒），并分析了样品的HPP后生物控制微生物计数、在 70° F下随着时间的pH和溶解氧。还使用了在接种生物对照微生物前接受5分钟HPP的胡 萝卜汁进行了这些实验，以区分什么作用是来自内源性微生物和什么是由于接种的生物控 制微生物引起的。在几个实施方案中，本文中公开的方法对于满足正向调控步骤来确保低 酸汁液（和其他食品）的安全性特别有用。外源性微生物的存在意外地帮助了降低PH(或 另外抑制病原体生长）；然而，本文中公开的外源性微生物的使用满足了针对低酸食品（特 别是低酸汁液）安全性的特定调控需求。
[0131] 将生胡萝卜汁用作起始材料时确定了对照样品（参见表2和图1)以及来自接种 了生物控制微生物的汁液的样品中发生的酸产生（pH下降）。值得注意的是在该pH期间 约1至约3天的停滞期基本上没受到影响。停滞期是生物控制微生物变得代谢上有活性并 且产生足够的乳酸来克服汁液（或其他食品）中任何固有的缓冲作用需要的时间的结果。 在几个实施方案中，停滞期基于汁液（或其他食品）的温度而不同。例如，如果食品升至约 70° F-72° F的温度，停滞期相对短，而将食品升至较低温度（例如，44-50° F)具有较长 停滞期。在几个实施方案中，这是有利的，因为温度滥用越严重，生物控制微生物越快速地 变成有活性的，并且pH越快速地降低。将接种生物控制微生物前接受5分钟HPP的胡萝卜 汁用作起始材料，确定了也在对照样品（参见表3和图1)以及来自接种了生物控制微生物 的汁液的样品中发生的酸产生（pH下降）。溶解氧浓度在样品中也是低的（数据未显示）， 表明存在肉毒梭菌孢子形成的条件（肉毒梭菌只能够在孢子形成过程中产生神经毒素，其 只能在低氧和/或厌氧环境中发生）。
[0132] 表2-HPP对生胡萝卜汁中的内源性和生物控制微生物的影响
[0133]
[0134] 表3-HPP对HPP已处理的胡萝卜汁中的内源性和生物控制微生物的影响
[0136] 这些数据表明，尽管胡萝卜汁中存在一些内源性微生物，但5分钟HPP暴露没有将 胡萝卜汁灭菌（例如，剩余的内源性微生物）。内源性微生物，以及接种的微生物，在70° F 下~5天中，将pH降至〈4.6 (参见图1)。然而，因为内源性微生物不总是存在于胡萝卜汁 中，可以以不同水平存在于不同批次的胡萝卜汁中（例如，批次与批次之间、制造商与制造 商之间，和或胡萝卜来源的不同地理区域之间），并且其他低酸汁液中可能根本不存在，但 生物控制微生物的接种仍然是消费者安全性的重要过程。如表2和3中所示的，接种至胡 萝卜汁中的生物控制微生物不仅在HPP中存活，在暴露于温度滥用（作为严重的温度滥用 的实例，70° F)时将pH降至低于4.6(参见图1)。因此，在几个实施方案中，当将汁液暴露 于非冷藏温度时，将产乳酸微生物，单独或结合食品保存技术（例如，HPP)，用于降低天然 低酸汁液的pH。在几个实施方案中，使用乳酸片球菌。在几个实施方案中，使用干酪乳杆 菌。根据所述实施方案，也可以使用组合。此外，在几个实施方案中，根据本文中公开的方 法，将接种的生物控制用于补充特定的内源性微生物（它们应当存在）。
[0137] 不同温度下的温度滥用后的生物控制的功效
[0138] 如上讨论的，将食品（例如，低酸含量汁液）的温度升至允许特定致病微生物生 长的温度，则发生温度滥用。如上讨论的，肉毒梭菌的特定株可以在较低温度（例如，约 50° F)下生长，而其他株在较高温度（例如，约70° F)下生长。因此，以下描述的实验被 设计成进一步确认以上讨论的结构，并且鉴别在各种温度内是功能性的非致病生物控制微 生物。
[0139] 通常如上所述进行实验（对于示意性方法流程，还可以参见图9)。简而言之，制备 并提取汁液（在这些实施方案中，使用从芹菜、黄瓜、菠菜、来檬、长叶莴苣、小麦草和苜蓿 制得的低酸汁液的非限制性实例）。当提取时，将浓度为约100, 〇〇〇至5, 000, 000CFU/克汁 液的各种非致病生物控制微生物加入汁液中。这些实验使用了（作为用于生物控制的非致 病微生物的非限制性实例）干酪乳杆菌（来自不同供应商的两个株）和乳酸片球菌，因为 这些微生物在（以上）胡萝卜汁的HPP存活和pH降低中显示出有前景的结果。然后将接 种的汁液装瓶并接受HPP(87K PSI下180秒停留时间；已知满足FDA对某些靶病原体5-log 降低的指导）。如上讨论的，根据所述实施方案，可以使用各种其他HPP构成。例如，可以使 用以下非限制性HPP构成：大约75, 000-100, 000 PSI (例如，约87, 000 PSI)的压力和大约 30-300秒（例如，180秒）的停留时间。此外，在几个实施方案中，除了 HPP，或替代HPP，其 他食品保存技术可以与生物控制一起使用。将汁液（现在按照制造商那样装瓶了）在各种 温度下（70-72° F、50-52° F，或~42° F的标准储存温度）储存不同的时间段。以间隔 的时间点收集样品并评价pH。
[0140] 暴露于严重温度滥用（例如，70-72° F的汁液温度）的结果显示于图1中。如所 示的，接种干酪乳杆菌或乳酸片球菌的汁液在~3天内pH从约6. 2的初始值（汁液的天 然pH)降至低于约4. 6的pH。对照样品（无外源性细菌）也下降了 pH，但在延迟的时间框 内。因此，在几个实施方案中，在接受暴露于温度滥用的汁液中使用生物控制微生物变得代 谢上有活性的并且将PH降至低于灭活（或降低其活力和/或活性）致病微生物（如肉毒 梭菌）的水平。因此，降低、最小化和/或防止由病原体产生的毒素（或其他有害产物）的 产生。
[0141] 暴露于温度滥用（例如，50-52° F的汁液温度，持续25天）的结果显示于图2中。 如所示的，接种干酪乳杆菌株#1的汁液将PH从约6. 2的初始值（汁液的天然pH)在大约 7天内降至约5的pH并且在大约10天内降至低于约4. 6。其他干酪乳杆菌株和乳酸片球 菌在大约20天后实现了 pH降至约4. 6。
[0142] 在40-42° F的典型冷藏温度储存后，评价汁液样品的味道特征和微生物含量。这 个实验用于评价在温度滥用不存在的情况下，微生物对汁液的作用（例如，生物控制对汁 液货架期的影响）。表4概括了数据。
[0143]
[0144] 关于风味特征，在40-42° F下储存32天后，检测到风味没有改变。在第34天开 始注意到苦味，并且在第42天味道变得不可口。然而，如通过接种了干酪乳杆菌或乳酸片 球菌的汁液中随着时间相对稳定的PH所证明的，味道的这种变化不明显是由于生物控制 微生物的酸产生。其可以表示汁液的天然货架期。此外，稳定的PH证明了这些微生物，作 为用于生物控制中的那些的实例，在温度滥用不存在的情况下，没有降低pH。
[0145] 进行了其他实验来进一步阐明各种温度滥用条件下的生物控制的功效和再现性。 例如，进行了研究，其中测试了 5个独立的汁液生产运行。每个运行使用了接种浓度为~ 5, 000, 000CFU/克汁液的分开生产批次的生物控制微生物（将干酪乳杆菌用作生物控制微 生物的非限制性实例）。测试了以下的温度滥用条件（例如，保持在以下温度的汁液）：
[0146] L 70 - 72° F
[0147] 2.在 40。F 下保持 3 周后 70 - 72。F
[0148] 3. 50 - 52° F
[0149] 4. 44 - 46° F
[0150] 针对五个试验中的每一个，测量了重复样品的pH。此外，如上所述，标准感官货架 期测试，包括在42° F储存后测量微生物群和pH。来自试验#1的五个重复的概括数据显 示于图3中，针对一个重复试验（5个试验中4个的代表）的单独重复数据显示于图4中。 以上温度滥用条件#1的五个单独重复试验中在直至约6天时未能将pH降至约4. 6的一个 被终止（参见图5)。在一些实施方案中，尽管发生了 pH降低，但优选更快速的pH降低。这 很可能是由于生物控制微生物批次与批次之间的不同（再次，用独立批次的生物控制微生 物运行每个试验）。然而，如以下讨论的，在几个实施方案中，质量控制测试，其中冷藏汁液 在100° F下滥用，在少于48小时内靶pH降至~4.6。不能通过这个质量控制测试的汁液 批次将不能放行，因为测试结果表明生物控制微生物不足以实现在不太严重的温度滥用条 件下降低pH。因此，在几个实施方案中，即使其他温度滥用条件表明特定汁液生产运行具有 足够的生物控制活性，但不能通过100° F温度滥用质量控制测试的汁液生产运行也不能 放行。导致图5中所示数据的汁液样品将很可能不能通过该测试，并且因此不能销售给消 费者。
[0151] 来自针对以上温度条件#2_#4的单独试验的数据分别显示于图6、图7和图8中。 这些数据证明，不管温度滥用是严重和立即的（试验条件#1)、严重并且在正常储存一段时 间后（试验条件#2)、