本发明涉及烟草生产技术领域，具体涉及提高烤烟上部烟叶质量的复合制剂及其制备方法与应用。
背景技术：
烟叶原料的好坏，直接决定了卷烟工业企业产品的质量与市场销量，其工业可用性很大程度上影响了烟草行业的税利水平。低次等烟叶原料的大量积压，严重占用了卷烟工业企业的资金，急需通过新兴技术手段提高其利用率，加速库存消化。我国烤烟的上部烟叶，普遍存在成熟度不够、化学成分不均衡尤其是含氮化合物(如烟碱、总蛋白质)含量较高等缺陷，导致上部烟叶原料的工业可用性不高(上部烟叶定义：烟株打顶后，自顶叶向下6-8片烟叶)。
针对烟叶原料工业可用性的评价，包含了外观质量、抽吸质量、加工性能与安全性等，因此通过生物技术手段来改进现有的烟草生产技术水平显得尤为必要，而自然界中广泛存在的微生物资源和成熟的商业化酶类产品则为该方向提供了更加高效有力的支撑。
在微生物资源的工业化利用方面，当前世界范围内已经具备了几十年的研究积累和应用成果，具体到烟草行业，多是以微生物分离与辅助烟叶发酵、酵母菌加速烟叶自然醇化与增香、微生物菌剂改良植烟土壤环境以提高烟叶内在化学成分协调性等为主攻方向。酶类的使用方面，则是以酶类与香精单体的配合研究、单一酶类对烟叶化学成分和香味成分的处理效果研究等辅助提质方向为主。此外在烟草农业生产技术方向，通过田间栽培管理、选育优良品种、改良调制(烘烤)工艺、提高采收成熟度与水肥管理水平等。以上各个方向都取得了可提高上部烟叶部分品质的研究进展，但应用成果相对比较分散，针对性较强而缺乏技术层面的整合，在烟叶生产上有一定的局限性，较难应对决定烟叶原料品质的品种、产地与年度差异化波动。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服目前我国烤烟上部烟叶普遍存在的主要品质缺陷，提供一种可在烟叶采收前添加的微生物与酶类复合制剂，并提供该制剂的具体制备方法与在烟草生产领域的应用方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
提高烤烟上部烟叶质量的复合制剂，复合制剂包括含有蜡状芽孢杆菌4-a的第一接种体、含有蜡状芽孢杆菌4-d的第二接种体、酶制剂，蜡状芽孢杆菌4-a的保藏编号为cgmccno.3864，蜡状芽孢杆菌4-d的保藏编号为cgmccno.5977。
进一步，复合制剂还包括无机盐溶液辅助剂，无机盐溶液辅助剂选用无机盐柠檬酸钾和磷酸二氢钠按照2:3的比例均匀混合，配制成质量分数为0.05％-0.1％的溶液。
进一步，酶制剂包括10-12万u/ml中性蛋白酶、2-3万u/mlα-淀粉酶、20-25万u/ml纤维素酶、6-8万u/ml果胶酶和2-3万u/mlβ-葡聚糖酶；以体积比计，组成酶制剂的中性蛋白酶：α-淀粉酶：纤维素酶：果胶酶：β-葡聚糖酶＝8-9:50-52:1-1.2:16-17:9-10。
进一步，第一接种体和第二接种体的菌体浓度均为108-109个/ml。
进一步，第一接种体、第二接种体、酶制剂和无机盐溶液辅助剂的体积比为1-1.2:10-12:35-38:12-15。
本发明还提供一种提高烤烟上部烟叶质量的复合制剂的制备方法，包括如下步骤：
菌株的活化培养，对筛选分离得到的蜡状芽孢杆菌4-a、蜡状芽孢杆菌4-d，分别于活化板培养基上进行活化培养；
菌株的扩大培养，对活化培养生长形成的两种菌株的单菌落，分别于扩大液体培养基中进行扩大培养，获得菌悬液；
接种体的制备，分别收集两种菌悬液中的菌体，分别重悬于含0-0.05％胰蛋白胨的0.85％生理盐水中，获得第一接种体和第二接种体；
制剂的复配：按照第一接种体、第二接种体、酶制剂和无机盐溶液的体积比为1-1.2:10-12:35-38:12-15分别量取各原料，混合均匀，获得复合制剂。
进一步，活化平板培养基的配方为：0.3％牛肉膏、0.5％胰蛋白胨、1％氯化钠、1.5％琼脂粉，余下为蒸馏水，活化平板培养基的ph＝7.2。
进一步，菌株的扩大培养步骤具体为，将活化培养的单菌落接种于扩大液体培养基中，在恒温摇床中，于150rpm、38℃条件培养12小时以上，至活菌计数达到106个/ml，取1ml菌液再次接种于扩大液体培养基中，在恒温摇床中，以170rpm、38℃条件培养24小时以上，至活菌计数达到108-109个/ml，获得菌悬液。
进一步，扩大液体培养基的配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠，余下为蒸馏水，扩大液体培养基的ph＝7.0。
进一步，接种体的制备步骤中，分别将两种菌株的菌悬液，于5000rpm、4℃条件下离心20分钟收集菌体，再用0.85％的灭菌生理盐水打散菌体并清洗后，以5000rpm、4℃条件离心10分钟，重复三次，最终收集的菌体重悬于含0-0.05％胰蛋白胨的0.85％生理盐水中。
本发明还提供一种提高烤烟上部烟叶质量的复合制剂的应用方法，应用方法为将复合制剂于烟叶采收前7天均匀喷施于上部烟叶正反两面，以烟叶表面出现可见液滴为止。
进一步，复合制剂的用量为350ml/1100烟株。
进一步，复合制剂按稀释比1：22加水稀释定容为复合制剂工作液。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明结合了微生物培养、酶制剂筛选与辅助剂的复配技术并调整烘烤工艺，综合利用多种技术，解决了我国烤烟上部烟叶普遍存在的主要品质缺陷，提高了其工业可用性。
(2)经过试验证明，采用本发明的技术方案处理后的烤烟上部烟叶，相较于未采用该技术的对照烟叶，有利于实现烘烤过程中大分子物质的更高效转化，在烟叶等级结构质量、感官评吸得分、化学成分协调性等方面均有显著提高。
具体实施方式
结合具体实施例，下面进一步说明本发明的使用方法与技术细节。同时就实施例中所涉及到的原材料和检测分析方法简要介绍如下：
(1)本发明的复合制剂中的蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)有两种，分别命名为蜡状芽孢杆菌4-a和蜡状芽孢杆菌4-d，蜡状芽孢杆菌4-a于2010年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.3864；蜡状芽孢杆菌4-d于2012年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.5977。实施例中使用的这两种菌株均为本公司保存的斜面菌种，也可从上述保藏机构获得，或者采用其他的同种菌株。
(2)本发明使用的液体酶产品，应保证酶活力范围如下：中性蛋白酶(10-12万u/ml)、α-淀粉酶(2-3万u/ml)、纤维素酶(20-25万u/ml)、果胶酶(6-8万u/ml)和β-葡聚糖酶(2-3万u/ml)。
(3)烤后烟叶等级分类标准，即在烘烤结束后，按烤烟国标42级对整炕烟叶样品进行分级，统计处理与对照各等级烟叶重量，并汇总为橘黄、柠檬黄、杂色三大等级，计算各大等级占比。
(4)样品的感官质量评价，即在重庆卷烟厂小线将处理与对照的样品烟叶采用同一工艺标准润叶与切丝并将烟丝自然晾干，采用同一机台和卷烟材料按统一的工艺标准卷制成卷烟(卷烟按照同一标准进行重量、吸阻分选)。样品卷烟在温度22℃、湿度60％条件下平衡48小时后，由重庆中烟工业有限责任公司组织9名专业评委，按照《yc/t138-1998烟草及烟草制品感官评吸方法》中单料烟感官质量评价方法，对处理与对照卷烟样品进行评吸打分，计算样品感官评价总分。
(5)常规化学成分检测，将处理与对照的样品烟叶用旋风磨粉碎成烟末，在35-40℃条件下干燥2.5-3小时，过40目筛后获得样品烟末并密封保存；样品烟末分别按照《yc/t162-2011烟草及烟草制品氯的测定连续流动法》、《yc/t159-2002烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》、《yc/t160-2002烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》、《yc/t217-2007烟草及烟草制品钾的测定连续流动法》、《yc/t161-2002烟草及烟草制品总氮的测定连续流动法》的标准方法，使用流动分析仪测定氯、还原糖、总糖、总植物碱、钾、总氮的含量，并以此计算钾氯比、糖碱比、氮碱比、两糖差这四种化学成分协调性的参考值，评价处理和对照样品之间的差异水平。
将采用以上材料与技术细节的实施例列举如下：
【实施例1】
复合制剂制备：包括如下步骤，
s1：菌株的活化培养，对筛选分离得到的蜡状芽孢杆菌4-a、蜡状芽孢杆菌4-d，分别于活化板培养基上进行活化培养。
具体地，在无菌工作环境，从保藏菌株的密闭试管斜面培养基上，使用灭菌刮铲刮取少量菌体，以三区划线分离法涂布于无菌培养皿中的活化平板培养基上，生长形成单菌落，活化平板培养基配方为：0.3％牛肉膏、0.5％胰蛋白胨、1％氯化钠、1.5％琼脂粉，蒸馏水补足体积后调节ph值至7.2，在121℃高压灭菌10分钟，倒入无菌培养皿中凝固。
s2：菌株的扩大培养，对活化培养生长形成的两种菌株的单菌落，分别于扩大液体培养基中进行扩大培养，获得菌悬液。
具体地，挑取生长良好的单菌落，将活化培养的单菌落接种于扩大液体培养基中，在恒温摇床于150rpm、38℃条件培养12小时以上，至活菌计数达到106个/ml，取1ml菌液再次接种于扩大液体培养基中，在恒温摇床中，以170rpm、38℃条件培养24小时以上，至活菌计数达到108个/ml，获得菌悬液。扩大液体培养基配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠，蒸馏水补足体积后调节ph值至7.0，在121℃高压灭菌10分钟。
s3：接种体的制备
具体地，分别将两种菌株的菌悬液，于5000rpm、4℃条件下离心20分钟收集菌体，再用0.85％的灭菌生理盐水打散菌体并清洗后，以5000rpm、4℃条件离心10分钟，重复三次，最终收集的菌体重悬于含0.05％胰蛋白胨的0.85％生理盐水中，生理盐水中菌体浓度为108个/ml，即为可在烟叶表面添加的两种接种体。
选择酶制剂：酶制剂包括中性蛋白酶(10万u/ml，液体)、α-淀粉酶(2万u/ml，液体)、纤维素酶(20万u/ml，液体)、果胶酶(6万u/ml，液体)和β-葡聚糖酶(2万u/ml，液体)，以体积比计，组成酶制剂的中性蛋白酶包括：α-淀粉酶：纤维素酶：果胶酶：β-葡聚糖酶＝8:50:1:16:9。
选择无机盐溶液辅助剂：无机盐溶液辅助剂选用无机盐柠檬酸钾和磷酸二氢钠按照2:3的比例均匀混合，配制成质量分数比为0.1％的溶液。
最终将第一接种体、第二接种体、酶制剂溶液、无机盐溶液辅助剂按照体积比1:10:35:12的比例配制成3.5l复合制剂原液(液体，可在4℃保存1-2天，最好现用现配)，再以1:22加水稀释定容，搅拌均匀后得到可用于10亩烟田上部烟叶添加的复合制剂工作液。
复合制剂添加、烟叶采收与烘烤：选取彭水地势平坦、连片且长势均匀的烟田共计20亩，以当地主栽品种k326作为复合制剂添加对象，排除阴雨和大风天气，在多云或者晴朗的午后(应避免阳光暴晒)对该品种上部烟叶进行复合制剂与空白对照的喷施添加，由有经验的农艺工使用电动喷雾器均匀喷施工作液到每株烤烟的上部烟叶正反两面，以烟叶表面出现可见液滴为止，其中添加复合制剂工作液的处理用地10亩(样品编号b1)，以1亩烟田约1100烟株计，添加等量水的空白对照用地10亩(样品编号c1)。在复合制剂添加后7天，所有上部烟叶一次性全部采收，并进行初步分拣以去除小叶和病叶，然后挂杆于密集烤房，以重庆彭水当地“三段六步式”烤烟烘烤正常工艺进行处理与对照烟叶样品的烘烤。烤后烟叶样品的等级结构见表1，样品卷烟的感官评价结果见表2，烤后烟叶样品的常规化学成分检测结果与化学成分协调性参考值见表3与表4。
表1烤后样品等级结构
由表1可见，复合制剂处理样品相较于对照样品，橘黄烟比例显著提高，柠檬黄烟比例显著降低，表明复合制剂处理有利于提高烤后上部烟叶的等级结构。
表2样品卷烟感官评价结果
由表2可见，复合制剂处理样品相较于对照样品，香气质、香气量、杂气、刺激性、透发性、甜度、浓度、劲头等指标有不同程度改善，总分更高(提高＞2分)，表明复合制剂处理有利于提高烤后上部烟叶的感官品质。
表3烤后样品常规化学成分检测结果
表3结果表明，复合制剂处理样品相较于对照样品，氯、还原糖、总糖含量大幅下降，总植物碱、总氮含量有一定程度上升，钾含量显著上升。
表4化学成分协调性参考值
表4结果表明，复合制剂处理样品相较于对照样品，钾氯比显著上升，说明复合制剂处理样品的成熟度和燃烧性更好；两糖差有一定程度降低，说明复合制剂处理样品的化学协调性更好。
【实施例2】
与实施例1不同之处在于，复合制剂制备过程中，接种体1和接种体2重悬菌体的生理盐水中不含胰蛋白胨；在配制复合制剂原液时，第一接种体、第二接种体、酶制剂溶液、无机盐溶液辅助剂的体积比为1.2:10:38:15；烘烤过程中，在重庆彭水当地“三段六步式”烤烟烘烤工艺基础上，变黄期起始温度降低4℃，且延长变黄期稳温时长12小时。添加复合制剂工作液的处理样品编号为b2，添加等量水的空白对照样品编号为c2。烤后烟叶样品的等级结构见表5，样品卷烟的感官评价结果见表6，烤后烟叶样品的常规化学成分检测结果与化学成分协调性参考值见表7与表8。
表5烤后样品等级结构
由表5可见，复合制剂处理样品相较于对照样品，橘黄烟比例大幅提高，柠檬黄烟比例显著降低，表明复合制剂处理配合烘烤工艺改进有利于提高烤后上部烟叶的等级结构。
表6样品卷烟感官评价结果
由表6可见，复合制剂处理样品相较于对照样品，香气质、香气量、刺激性、透发性、甜度、余味、浓度、劲头等指标有不同程度改善，总分更高(提高＞1.5分)，表明复合制剂处理配合烘烤工艺改进有利于提高烤后上部烟叶的感官品质。
表7烤后样品常规化学成分检测结果
表7结果表明，复合制剂处理样品相较于对照样品，氯、还原糖、总糖含量大幅下降，总植物碱、总氮含量有一定程度上升，钾含量显著上升。
表8化学成分协调性参考值
表8结果表明，复合制剂处理样品相较于对照样品，钾氯比显著上升，说明复合制剂处理配合烘烤工艺改进样品的成熟度和燃烧性更好；两糖差有一定程度降低，说明复合制剂处理配合烘烤工艺改进样品的化学协调性更好。
【实施例3】
与实施例1不同之处在于，复合制剂制备过程中，离心收集菌体前，两种菌株的菌悬液活菌计数均达到109个/ml；在配制复合制剂原液时，第一接种体、第二接种体、酶制剂溶液、无机盐溶液辅助剂的体积比为1.1:12:35:15；同时作为辅助剂的无机盐溶液为0.05％浓度；组成酶制剂的中性蛋白酶：α-淀粉酶：纤维素酶：果胶酶：β-葡聚糖酶＝9:52:1.2:17:10；烘烤过程中，在重庆彭水当地“三段六步式”烤烟烘烤工艺基础上，变黄期起始温度降低2℃，延长变黄期稳温时长达到18小时。添加复合制剂工作液的处理样品编号为b3，添加等量水的空白对照样品编号为c3。烤后烟叶样品的等级结构见表9，样品卷烟的感官评价结果见表10，烤后烟叶样品的常规化学成分检测结果与化学成分协调性参考值见表11与表12。
表9烤后样品等级结构
由表9可见，复合制剂处理样品相较于对照样品，橘黄烟比例显著提高，柠檬黄烟比例有一定程度降低，杂色烟比例也大幅降低，表明复合制剂处理配合烘烤工艺改进有利于提高烤后上部烟叶的等级结构。
表10样品卷烟感官评价结果
由表10可见，复合制剂处理样品相较于对照样品，香气质、香气量、杂气、刺激性、透发性、甜度、余味、浓度、劲头等指标有不同程度改善，总分更高(提高＞2.5分)，表明复合制剂处理配合烘烤工艺改进有利于提高烤后上部烟叶的感官品质。
表11烤后样品常规化学成分检测结果
表11结果表明，复合制剂处理样品相较于对照样品，氯含量有一定程度下降，还原糖、总糖含量大幅下降，总植物碱含量有一定程度上升，钾含量显著上升，总氮含量略有下降。
表12化学成分协调性参考值
表12结果表明，复合制剂处理样品相较于对照样品，钾氯比显著上升，说明复合制剂处理配合烘烤工艺改进样品的成熟度和燃烧性更好；两糖差有一定程度降低，说明复合制剂处理配合烘烤工艺改进样品的化学协调性更好。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。