制备油菜花粉有效物质富集物的方法与流程

本发明涉及一种由油菜花粉制备油菜花粉有效物质富集物的方法，所述富集物富含黄酮化合物和中等极性含氮化合物，可以用作治疗良性前列腺增生疾病的原料药。

背景技术：
油菜花粉为十字花科植物油菜(BrassicacampestrisL.)的花粉粒，具有多种营养成分，除了糖、蛋白质、氨基酸、矿物质和维生素等营养成分之外，还包括脂肪酸类、多酚类(包括黄酮类)、植物甾醇类、含氮类等次生代谢产物，它们(分为小极性和中等极性活性组分)通过作用于不同靶点发挥其抗良性前列腺增生的药理作用(孙毅，杨义芳，杨必成，陈琼珊.油菜蜂花粉生理活性及作用机制研究进展[J].中国蜂业，2010，61(9)：5-9；杨必成，杨义芳.花粉治疗前列腺疾病的物质基础研究进展[J].中草药，2009，40(1)：144-145)。其中，中等极性活性组分中起主要药效作用的成分为黄酮类和含氮类化合物。目前，针对这两类成分的抗良性前列腺增生体外活性和作用机制有了部分报道(韩慧英.前列康及其原料油菜花粉活性成分的研究[D].沈阳：沈阳药科大学，2004；杨义芳，金丽丽，杨必成，黄春跃，李坤.一类香豆酰精脒类化合物或其植物提取物的应用[P].中国专利：200910049133.7.2009-04-10)，对油菜花粉中黄酮的富集工艺也有专利公开和报道，但其步骤较复杂且所得黄酮回收率较低，应用于大规模生产的可行性较小。最后也是最重要的是，同时对黄酮类和含氮类化合物进行富集工艺的研究未见任何相关专利和报道。

技术实现要素：
本发明提供一种由油菜花粉制备抗良性前列腺增生的油菜花粉有效物质富集物的方法，该方法通过提取工艺得到油菜花粉浸膏，再通过大孔树脂柱层析工艺得到有效物质富集物，显著提高活性成分黄酮和中等极性含氮化合物的含量，因此能更好地满足作为创新中药药物原料的要求。因此，本发明的第一个目的是提供一种制备油菜花粉有效物质富集物的方法，包括如下步骤：(1)破壁油菜花粉(BrassicacampestrisL.pollen)经水提取以及CO2超临界提取后得到油菜花粉残渣；(2)所述残渣经乙醇水溶液渗漉，得到浸膏；(3)所述浸膏经大孔树脂吸附，用不同浓度乙醇洗脱，得油菜花粉有效物质富集物。本发明所提到的破壁油菜花粉可以在市面上购得或者采用现有的破壁技术(专利申请公开号CN1452888A的酶发酵破壁方法)制得。并且经过充分干燥。根据本发明一个优选的实施方式，步骤(1)所述水提取包括如下步骤：粉碎破壁油菜花粉后，与蒸馏水以1∶1-1∶8(w/w)比例混合，27-70℃下搅拌0.5-8h后，以3000-6000r/min离心30-120min，弃去上清液，沉淀置于40-80℃微波干燥，使含水量为2-4％(w/w)，粉碎并过筛，得花粉渣。根据本发明另一个优选的实施方式，步骤(1)所述CO2超临界提取包括如下步骤：花粉渣置于CO2超临界萃取设备，萃取温度30-50℃，压力20-40MPa，CO2流量20-30L/h；分离釜I：压力4.0-8.0MPa，温度30-45.0℃；分离釜II：压力4.0-6.0MPa，温度30-45.0℃；萃取时间60-120min，取出提取后花粉残渣，粉碎，过筛，得残渣。根据本发明一个优选的实施方式，步骤(2)所述乙醇水溶液渗漉包括以下步骤：首先用固液比(g/mL)为1∶1.5-1∶2的70-95％(v/v)乙醇浸泡残渣12-60h，用固液比(g/mL)为1∶15-1∶25的70-95％(v/v)乙醇渗漉，流速为3-15mL/min/100g残渣，收集渗漉液；然后用固液比(g/mL)为1∶1.5-1∶2的70-95％(v/v)乙醇浸泡残渣12-60h，用固液比(g/mL)为1∶15-1∶25的70-95％(v/v)乙醇渗漉，流速为3-15mL/min/100g残渣，收集渗漉液，合并两次所得渗漉液，减压浓缩蒸干。根据本发明另一个优选的实施方式，进行以下黄酮和中等极性含氮化合物富集步骤：将步骤(2)所得浸膏以1∶130-1∶140(w/w)的比例分散至水中，经大孔树脂吸附，先用30-50％(v/v)乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为6-12倍柱体积，弃之；再用60-80％(v/v)乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为6-12倍柱体积，收集洗脱液，减压蒸馏浓缩，干燥，得油菜花粉有效物质富集物。根据本发明一个特别优选的实施方式，步骤(3)所述的大孔树脂为非极性大孔树脂。本发明所述制备油菜花粉有效物质富集物的方法的回收率高达50.7-90.1％。本发明的第二个目的是提供根据上述方法制得的油菜花粉有效物质富集物。本发明方法制得的油菜花粉有效物质富集物，其富含黄酮化合物和含氮化合物，其中所述黄酮化合物的含量高达43.8％-64.9％(w/w)，所述含氮化合物中氮含量高达5.7％-7.9％(w/w)，总有效物质占49％-72％(w/w)。本发明的第三个目的是提供一种药物组合物，其含有根据所述的油菜花粉有效物质富集物和药学可接受的赋形剂。本发明的第四个目的是提供所述的油菜花粉有效物质富集物在制备治疗良性前列腺增生的药物中的应用。本发明方法制得的油菜花粉有效物质富集物与传统的花粉直接入药相比，具有有效成分更加集中，成分更明确，药效更明显的特征。在抗良性前列腺增生药物开发方面，具有明显的优势。附图说明图1为实施例2所述5个化合物结构式；图2为实施例5所得的本发明油菜花粉有效物质富集物的色谱图(350nm)；图3为实施例2所述化合物1(a)、2(b)、3(c)、4(d)、5(e)紫外吸收谱图。具体实施方式实施例1黄酮含量测定方法：仪器：紫外分光光度仪UV-2500PC(岛津，日本)。标准物质与化学试剂：含量98％芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，北京)；亚硝酸钠；硝酸铝；氢氧化钠(国药试剂，上海)。芦丁标准曲线的绘制与黄酮含量测定方法：精密称取芦丁对照品25.8mg至50mL容量瓶中，加入部分95％(v/v)乙醇，在水浴锅中加入至溶解，再用95％(v/v)乙醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为516μg/mL原液。分别精密量取0.0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mL标准液至25mL容量瓶中，分别加入8.0，7.5，7.0，6.0，4.0，0.0mL95％(v/v)乙醇稀释，摇匀，分别加入0.7mL5％(w/w)亚硝酸钠，摇匀，5分钟后加入0.7mL10％(w/w)硝酸铝，摇匀，6分钟后加入5mL10％(w/w)氢氧化钠，摇匀，5分钟后加入50％(v/v)乙醇稀释至刻度，摇匀，静止10min。以水作为参比在508nm波长处测吸光度。以吸光度值作为纵坐标(y)，浓度作为横坐标(x)，绘制标准曲线，线性回归得方程：y＝0.03218+0.00882x(公式一)，R2＝0.9992，浓度范围：0-103.2μg/mL。(公式二)注：其中黄酮浓度由公式一计算得到(公式三)氮含量测定方法：仪器：全自动凯氏定氮分析仪Foss-2300(福斯，瑞典)使用全自动凯氏定氮分析仪Foss-2300对样品中氮含量进行了测定。(公式四)(公式五)实施例2部分黄酮类化合物和中等极性含氮类化合物的鉴定：化学试剂、材料与标准物质：氘代甲醇(CD3OD，99.8％atomD)-SigmaAldrich(St.Louis，USA)；反相C18键合硅胶ODS-A-HG(50μm)-YMCGEL(Japan)；SephadexLH20葡聚糖凝胶-GEHealthcareLifeSciences(USA)；薄层硅胶板(制备型/分析型，GF254)-烟台江友；乙腈(色谱纯)-J&K百灵威(北京)；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等有机试剂-国药试剂。山奈酚(97％)、异鼠李素(97％)、槲皮素(97％)-中国药品食品检定研究院(北京)仪器：INOVA-400型核磁共振仪-Varian(CA，USA)；ESI电离源Q-TOFmicroYAO19型质谱仪-Waters(USA)；UFLCXRsystem液相色谱仪SPD-M20ADAD检测器-Shimadzu(Japan)色谱条件：采用ZorbaxXDB-C18column(2.1mm×150mm，1.8μm，Agilent，USA)，柱温35℃，条件进行分离。溶液A(H2O+0.2％H3PO4，v/v)，溶液B(乙腈)作为洗脱溶液，洗脱程序如下：16％(v/v)B(0-10min)，20％B(10-20min)，26％B(20-28min)，28％B(28-33min)，100％B(33-38min)，16％B(38-41min).分离条件：流速0.3mL/min，进样体积2-5μL。色谱图检测波长350nm，每个峰的紫外谱图扫描波长范围200-400nm。数据记录和分析通过LC-Solutionworkstation软件(ShimadzuCo，.Kyoto，Japan)进行。化合物分离过程：将本发明所得的油菜花粉有效物质富集物溶于水，分别依次用同体积石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取三次，合并萃取液减压蒸干，乙酸乙酯部位浸膏经ODS、LH20、制备型薄层板、制备型HPLC得到化合物(5)；水饱和正丁醇部位浸膏经ODS、LH20、制备型薄层板、制备型HPLC得到化合物(4)。化合物(4)：山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷黄色固体，ESI-MS(正和负)给出准分子离子峰：m/z：633[M+Na]+，609[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CD3OD)：8.01(H-2’，6’)，6.91(H-3’，5’)，6.40(H-8)，6.21(H-6)，5.22(H-1”)，4.80(H-1”’)，3.22-3.82(两个葡萄糖上除端基以外的氢信号)；13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：179.6(C-4)，132.3(C-2’，6’)，116.3(H-3’，5’)，104.9(C-1”)，101.6(C-1”’)，82.9(C-2”)，78.1(C-5”’)，78.0(C-5”)，77.7(C-3”)，77.5(C-3”’)，75.5(C-2”)，71.2(C-4”)，71.0(C-4”’)，62.2(C-6”)，62.1(C-6”’).化合物(5)：N1，N5，N10-三-(E)-香豆酰精脒淡黄色固体，ESI-MS(正和负)给出准分子离子峰：m/z：584[M+H]+，606[M+Na]+，1189[2M+Na]+，582[M-H]-；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.91(NH)，3.19-3.25(H-2，9)，1.72(H-3)，3.34-3.45(H-4，6)，1.45-1.52(H-7，8)，7.34(H-2’，6’)，6.77(H-3’，5’)，7.49(H-7’)，6.40(H-8’)；13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：36.2(C-2)，36.5(C-9)，29.7(C-3)，44.9(C-4)，45.4(C-6)，26.5(C-7)，26.8(C-8)，125.9(C-1’)，129.1(C-2’，6’)，115.6(C-3’，5’)，158.8(C-4’)，141.4(C-7’)，115.5(C-8’)，165.2(C-9’).富集物色谱图及部分化合物指认：化合物：山奈酚(1)、槲皮素(2)、异鼠李素(3)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷(4)、N1，N5，N10-三-(E)-香豆酰精脒(5)的结构如图1所示。本发明油菜花粉有效物质富集物色谱图，5个化合物的指认以及它们的紫外谱图如图2和3所示。可知，本发明所得的油菜花粉有效物质富集物中含有大量黄酮类化合物和中等极性含氮类化合物。实施例3大孔树脂：LS305(陕西蓝深)粉碎破壁油菜花粉后，与蒸馏水以1∶4(w/w)比例混合，40℃下搅拌0.5h后，以3000r/min离心30min，弃去上清液，沉淀置于40℃微波干燥，使含水量为4％(w/w)，粉碎并过40目筛，得花粉渣。所得花粉渣，置于CO2超临界萃取设备，萃取温度30℃，压力20MPa，CO2流量20L/h；分离釜I：压力4.0MPa，温度30.0℃；分离釜II：压力4.0MPa，温度30.0℃；萃取时间60min，得萃取物得率为11.12％(w/w)。取出提取后花粉残渣，粉碎，过12目筛，得残渣。10g残渣用15mL70％(v/v)乙醇浸泡12h，然后用150mL(固液比1∶15)70％(v/v)乙醇渗漉，流速为0.3mL/min，收集渗漉液，残渣继续用20mL80％(v/v)乙醇浸泡12h，然后用200mL(固液比1∶20)80％(v/v)乙醇渗漉，流速为1.5mL/min，收集渗漉液，合并两次渗漉液，减压浓缩蒸干得浸膏3.59g，黄酮含量13.7％(w/w)，氮含量6.5％(w/w)。取浸膏1.5g，分散至200mL水中制成水溶液，水浸泡过的大孔树脂装柱(2×26cm)，6柱体积(1柱体积＝25mL)水溶液经大孔树脂吸附，流速为0.5柱体积/h，然后，用30％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为12倍柱床体积(300mL)，所得洗脱液弃之不用；再用浓度60％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为6倍柱床体积，收集洗脱液，减压蒸馏浓缩，干燥，得油菜花粉抗良性前列腺增生有效物质富集物，经测得其黄酮含量为54.9％(w/w)，回收率为52.1％(w/w)，氮元素含量为7.9％(w/w)，其有效物质组成超过60％(w/w)。实施例4大孔树脂：LS305(陕西蓝深)粉碎破壁油菜花粉后，与蒸馏水以1∶1(w/w)比例混合，40℃下搅拌4h后，以6000r/min离心120min，弃去上清液，沉淀置于80℃微波干燥，使含水量为2％(w/w)，粉碎并过80目筛，得花粉渣。所得花粉渣，置于CO2超临界萃取设备，萃取温度30℃，压力40MPa，CO2流量30L/h；分离釜I：压力8.0MPa，温度45.0℃；分离釜II：压力5.0MPa，温度45.0℃；萃取时间120min，得萃取物得率为11.12％(w/w)。取出提取后花粉残渣，粉碎，过18目筛，得残渣。10g残渣用20mL80％(v/v)乙醇浸泡12h，然后用200mL(固液比1∶20)80％(v/v)乙醇渗漉，流速为1.5mL/min，收集渗漉液，继续用15mL95％(v/v)乙醇浸泡12h，然后用250mL(固液比1∶25)95％(v/v)乙醇渗漉，流速为0.75mL/min，收集渗漉液，合并两次渗漉液，减压浓缩蒸干得浸膏3.96g，黄酮含量8.7％(w/w)，氮含量4.1％(w/w)。取浸膏1.5g，分散至200mL水中制成水溶液，水浸泡过的大孔树脂装柱(2×26cm)，6柱体积(1柱体积＝25mL)水溶液经大孔树脂吸附，流速为0.5柱体积/h，然后，用50％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为6倍柱床体积(250mL)，所得洗脱液弃之不用；再用浓度80％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为10倍柱床体积，收集洗脱液，减压蒸馏浓缩，干燥，得油菜花粉抗良性前列腺增生有效物质富集物，经测得其黄酮含量为55.2％(w/w)，回收率为50.7％(w/w)，氮元素含量为7.6％(w/w)，其有效物质组成超过60％(w/w)。实施例5大孔树脂：LS305(陕西蓝深)粉碎破壁油菜花粉后，与蒸馏水以1∶6(w/w)比例混合，40℃下搅拌4h后，以5000r/min离心60min，弃去上清液，沉淀置于60℃微波干燥，使含水量为3％(w/w)，粉碎并过60目筛，得花粉渣。花粉渣，置于CO2超临界萃取设备，萃取温度50℃，压力35MPa，CO2流量20L/h；分离釜I：压力8.0MPa，温度45.0℃；分离釜II：压力5.0MPa，温度35.0℃；萃取时间90min，得萃取物得率为20.76％(w/w)。取出提取后花粉残渣，粉碎，过12目筛，得残渣。10g残渣用15mL95％(v/v)乙醇浸泡60h，然后用200mL(固液比1∶20)95％(v/v)乙醇渗漉，流速为0.3mL/min，收集渗漉液，继续用20mL70％(v/v)乙醇浸泡36h，然后用200mL(固液比1∶20)70％(v/v)乙醇渗漉，流速为0.75mL/min，收集渗漉液，合并两次渗漉液，减压浓缩蒸干得浸膏3.68g，黄酮含量10.4％(w/w)，氮含量6.8％(w/w)。取浸膏1.5g，分散至200mL水中制成水溶液，水浸泡过的大孔树脂装柱(2×26cm)，6柱体积(1柱体积＝25mL)水溶液经大孔树脂吸附，流速为0.5柱体积/h，然后，用40％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为10倍柱床体积(250mL)，所得洗脱液弃之不用；再用浓度70％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为12倍柱床体积，收集洗脱液，减压蒸馏浓缩，干燥，得油菜花粉抗良性前列腺增生有效物质富集物，经测得其黄酮含量为64.9％(w/w)，回收率为59.9％(w/w)，氮元素含量为6.7％(w/w)，其有效物质组成超过70％(w/w)。实施例6大孔树脂：LS305(陕西蓝深)粉碎破壁油菜花粉后，与蒸馏水以1∶6(w/w)比例混合，27℃下搅拌4h后，以5000r/min离心60min，弃去上清液，沉淀置于60℃微波干燥，使含水量为4％(w/w)，粉碎并过60目筛，得花粉渣。花粉渣，置于CO2超临界萃取设备，萃取温度40℃，压力20MPa，CO2流量25L/h；分离釜I：压力8.0MPa，温度45.0℃；分离釜II：压力6.0MPa，温度35.0℃；萃取时间90min，得萃取物得率为10.07％(w/w)。取出提取后花粉残渣，粉碎，过12目筛，得残渣。100g残渣用150mL70％(v/v)乙醇浸泡12h，然后用1500mL(固液比1∶15)70％(v/v)乙醇渗漉，流速为3mL/min，收集渗漉液，继续用150mL95％(v/v)乙醇浸泡12h，然后用2500mL(固液比1∶25)95％(v/v)乙醇渗漉，流速为7.5mL/min，收集渗漉液，合并两次渗漉液，减压浓缩蒸干得浸膏39.6g，黄酮含量9.7％(w/w)，氮含量4.8％(w/w)。取浸膏21g，分散至3L水中制成水溶液，水浸泡过的大孔树脂装柱(5×65cm)，6柱体积(1柱体积＝500mL)水溶液经大孔树脂吸附，流速为0.5柱体积/h，然后，用40％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为10倍柱床体积(5L)，所得洗脱液弃之不用；再用浓度70％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为6倍柱床体积，收集洗脱液，减压蒸馏浓缩，干燥，得油菜花粉抗良性前列腺增生有效物质富集物，经测得其黄酮含量为44.1％(w/w)，回收率为89.3％(w/w)，氮元素含量为6.0％(w/w)，其有效物质组成超过50％(w/w)。实施例7大孔树脂：LS305(陕西蓝深)粉碎破壁油菜花粉后，与蒸馏水以1∶6(w/w)比例混合，70℃下搅拌4h后，以5000r/min离心60min，弃去上清液，沉淀置于60℃微波干燥，使含水量为4％(w/w)，粉碎并过60目筛，得花粉渣。花粉渣，置于CO2超临界萃取设备，萃取温度50℃，压力35MPa，CO2流量20L/h；分离釜I：压力8.0MPa，温度45.0℃；分离釜II：压力5.0MPa，温度35.0℃；萃取时间90min，得萃取物得率为20.76％(w/w)。取出提取后花粉残渣，粉碎，过12目筛，得残渣。100g残渣用150mL95％(v/v)乙醇浸泡60h，然后用2000mL(固液比1∶20)95％(v/v)乙醇渗漉，流速为3mL/min，收集渗漉液，继续用200mL70％(v/v)乙醇浸泡36h，然后用2000mL(固液比1∶20)70％(v/v)乙醇渗漉，流速为7.5mL/min，收集渗漉液，合并两次渗漉液，减压浓缩蒸干得浸膏38.9g，黄酮含量11.1％(w/w)，氮含量6.2％(w/w)。取浸膏29g，分散至4L水中制成水溶液，水浸泡过的大孔树脂装柱(5×65cm)，6柱体积(1柱体积＝500mL)水溶液经大孔树脂吸附，流速为0.5柱体积/h，然后，用蒸馏水洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为10倍柱床体积(5L)，所得洗脱液弃之不用；用40％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为10倍柱床体积(5L)，所得洗脱液弃之不用；再用浓度70％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为6倍柱床体积，收集洗脱液，减压蒸馏浓缩，干燥，得油菜花粉抗良性前列腺增生有效物质富集物，经测得其黄酮含量为45.2％(w/w)，回收率为90.1％(w/w)，氮元素含量为6.1％(w/w)，其有效物质组成超过50％(w/w)。实施例8大孔树脂：LS305(陕西蓝深)粉碎破壁油菜花粉后，与蒸馏水以1∶8(w/w)比例混合，40℃下搅拌4h后，以5000r/min离心60min，弃去上清液，沉淀置于60℃微波干燥，使含水量为3％(w/w)，粉碎并过60目筛，得花粉渣。花粉渣，置于CO2超临界萃取设备，萃取温度50℃，压力35MPa，CO2流量20L/h；分离釜I：压力8.0MPa，温度45.0℃；分离釜II：压力5.0MPa，温度35.0℃；萃取时间90min，得萃取物得率为20.76％(w/w)。取出提取后花粉残渣，粉碎，过12目筛，得残渣。100g残渣用150mL95％(v/v)乙醇浸泡60h，然后用2000mL(固液比1∶20)95％(v/v)乙醇渗漉，流速为3mL/min，收集渗漉液，继续用200mL70％(v/v)乙醇浸泡36h，然后用2000mL(固液比1∶20)70％(v/v)乙醇渗漉，流速为7.5mL/min，收集渗漉液，合并两次渗漉液，减压浓缩蒸干得浸膏37.6g，黄酮含量11.2％(w/w)，氮含量6.6％(w/w)。取浸膏24.5g，分散至3L水中制成水溶液，水浸泡过的大孔树脂装柱(5×65cm)，6柱体积(1柱体积＝500mL)水溶液经大孔树脂吸附，流速为0.5柱体积/h，然后，用蒸馏水洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为10倍柱床体积(5L)，所得洗脱液弃之不用；用40％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为10倍柱床体积(5L)，所得洗脱液弃之不用；再用浓度70％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为1柱体积/h，洗脱体积为6倍柱床体积，收集洗脱液，减压蒸馏浓缩，干燥，得油菜花粉抗良性前列腺增生有效物质富集物，经测得其黄酮含量为43.8％(w/w)，回收率为85.9％(w/w)，氮元素含量为5.7％(w/w)，其有效物质含量49.5％(w/w)。