芍药内酯苷在制备抗喉癌药物中的用途的制作方法与工艺

芍药内酯苷在制备抗喉癌药物中的用途本申请是申请号为201310180327.7，申请日为2013年5月15日，发明名称为“芍药苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途”的中国发明专利申请的分案申请。技术领域本发明属于抗肿瘤药物领域，涉及芍药苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途，具体涉及芍药内酯苷在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术：
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物，表现为肿块。肿瘤细胞在外部形态、代谢和功能方面不同于正常细胞，多呈现持续性增殖。据有效数据统计，肿瘤是目前威胁全世界人类生命健康的三大因素之首，所以抗肿瘤药物的研发成为近年来的热点。根据抗肿瘤药物的传统分类和研究进展，可将常用的抗肿瘤药物分为以下几大类：一、细胞毒药物，包括破坏DNA结构和功能的药物(如环磷酰胺、伊立替康)、影响核酸生物合成的药物(如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、甲氨喋呤)等；二、影响激素平衡的药物，包括抗雌激素类药物(如托瑞米芬)、抗雄激素类药物(如比卡鲁胺)和芳香化酶抑制剂(如来曲唑)等；三、其它及辅助药物，包括机体免疫功能调节剂(如白介素、干扰素)、生物反应调节剂(如埃罗替尼、吉非替尼)、细胞分化诱导剂(如维甲酸、亚砷酸)、抗叶酸制剂(力比泰)、单克隆抗体(如阿瓦斯汀)和辅助镇痛、止吐、白细胞升高等药物。但是，以上药物或多或少存在着副作用，像细胞毒药物一般会引发患者的中重度消化系统反应(如恶性呕吐、口腔炎)、骨髓抑制(如白细胞减少、血小板减少)和器官毒性(如神经毒性、肝肾毒性)，激素平衡干扰药物则会引起患者的轻中度胃肠道反应、生殖系统损伤甚至精神抑郁症状，多数调节剂和诱导剂等也会引发患者不同程度的皮肤反应和肝肾功能损害。例如伊立替康(IrinotecanHydrochloride)常用于成人转移性大肠癌的治疗，效果比较显著，但是用药后，20％的患者出现胃肠道不良反应——严重腹泻，78.7％的患者均出现过中性粒细胞减少症，9％的患者出现短暂严重的急性胆碱能综合征(BretWallace等.Science,330,2010.；孙祎等.中国药房,18(35),2007.；吴育红等.安徽医药,14(10),2010.)；力比泰(Pemetrexeddisodium，Alimta)是首个抗胸膜间皮瘤药物，它可以引起患者的骨髓抑制，包括中性粒细胞减少、血小板减少、贫血或各类血细胞减少，肝、肾功能不全者忌用(郑航等.肿瘤防治研究,34(4),2007.；王剑英等.中外健康文摘,12,2011.)；阿瓦斯汀(Bevacizumab，Avastin)是血管内皮生长因子VEGF的单克隆抗体，通过结合VEGF并防止其与内皮细胞表面的受体结合，减少了微血管的生成并抑制了转移病灶进展。但是它的副作用很明显，包括胃肠穿孔、伤口开裂综合症、出血、高血压危象、肾病综合征和充血性心力衰竭等(EricO.Gamboa等.ClinicalColorectalCancer,9(1),2010；AMailliez等.BritishJournalofCancer,103,2010；SanjaykumarHapani等.Oncology,79,2010)。相比之下，抗肿瘤中药对机体的损害则较小，抗肿瘤中药的作用机理主要涉及细胞毒作用、提高机体免疫力、诱导肿瘤细胞凋亡及分化和抑制肿瘤血管新生等方面。根据中药的功效和作用特点，可将抗肿瘤中药分成以下几大类：一、清热解毒类，如黄芩、大青叶；二、活血化瘀类，如大黄、丹参；三、扶正培本类，如人参、黄芪、天冬；四、化痰散结类，如半夏、瓜蒌、天南星；五、利水化湿类，如茯苓、车前子、翟麦；六、外用型药物，如雄黄、马钱子。上述抗肿瘤中药中的部分有效成分，像紫杉(Taxusbrevifolia)中的紫杉醇(taxol)常被人们用于抗肿瘤研究，且取得了较好的疗效(唐朝晖等.中国临床康复,27,2006.；江治武等.黑龙江科技信息,7,2010；Pluznik,DH等.CancerResearch,54(15),1994)。因此，关于抗肿瘤中药有效成分的深入探索具有重要的理论研究意义和临床指导意义。然而，由于大多数中药中的化合物成分复杂，分离提纯困难，质量控制受限且药效和作用机理尚不清晰，海量筛选抗肿瘤的有效成分非常不易，所以关于抗肿瘤中药有效成分的研究普遍存在着诸多不足和局限。例如从紫杉中提取的紫杉醇是微管的特异性稳定剂，可促进微管的装配和保持微管稳定，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能，特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，从而阻断了细胞的正常分裂，发挥了抗癌的作用。但是紫杉醇对患者的副作用较大，常见不良反应有过敏反应(发生率高达39％)、骨髓抑制(严重中性粒细胞发生率为47％，严重的血小板降低发生率为5％)、神经毒性(周围神经病变发生率为62％)、心血管毒性(发生率为55％)、胃肠道反应(恶心，呕吐，腹泻和黏膜炎发生率分别为59％，43％和39％)和脱发(发生率高达80％以上)等(叶冬梅等.中国药房,29,2011.；马连顺等.医药世界,3,2009；Derry,WB等.CancerResearch,58(6),1998.)。因此，药学研究人员仍在致力于开发新的抗肿瘤中药有效成分。白芍为毛茛科植物芍药(PaeoniaalbifloraPall)的根，已知的药理作用包括镇痛、镇静、抗惊厥、抗炎、抗病原微生物和护肝，还对免疫系统、平滑肌有作用，临床上可应用于抗癫痫、镇痛、戒毒、止眩晕，治疗类风湿性关节炎、细菌性痢疾及肠炎、病毒性肝炎以及老年性疾病，还具有抗硫酸钡絮凝和溶解粘液的作用。白芍的活性成分之一是芍药苷类化合物，以芍药内酯苷(英文名为Albiflorin；英文别名PaeonilactoneC；简称AL)和芍药苷(英文名为Paeoniflorin)为代表。本发明的目的在于提供芍药苷类化合物的新治疗用途，为临床肿瘤的预防和治疗提供新的选择。

技术实现要素：
本发明的目的在于提供芍药内酯苷新的抗肿瘤医药用途。为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：结构式I的芍药内酯苷或其药学上可接受的盐、对映体或外消旋混合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤为喉癌，本发明所述用途中，所述预防肿瘤是指治疗癌前病变。本发明所述用途中，所述药物为临床上可接受的任一剂型。优选的，所述剂型包括经胃肠道给药制剂和非经胃肠道给药制剂。更优选的，所述经胃肠道给药制剂选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、乳剂或混悬剂；所述非经胃肠道给药制剂选自注射剂、喷雾剂、栓剂、灌注剂、贴剂或软膏剂。在本发明所述用途中，芍药内酯苷可以作为所述预防和/或治疗肿瘤药物的唯一活性成分；还可以与其它物质一起制备所述预防和/或治疗肿瘤药物。体外实验表明，芍药内酯苷能够显著抑制肠癌、乳腺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、鼻咽癌、胰腺癌、喉癌、前列腺癌、肺癌、神经母细胞瘤、肾癌和肾上腺皮质瘤等多种肿瘤，具有广谱的抗肿瘤功能；芍药内酯苷尤其能够显著抑制肠癌、胰腺癌、喉癌、宫颈癌、乳腺癌和前列腺癌。具体来说，1、芍药内酯苷抑制肿瘤细胞增殖实验MTT检测结果显示，芍药内酯苷对肠癌细胞HT29、肠癌细胞CT26、横纹肌肉瘤细胞A204、鼻咽癌细胞CNE-2Z、喉癌细胞Hep2、胰腺癌细胞PANC1、前列腺癌细胞DU145、宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA231、乳腺癌细胞T47D和乳腺癌细胞MCF7的增殖具有显著抑制作用。其中，肠癌细胞HT29、胰腺癌细胞PANC1、喉癌细胞Hep2、宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA231和前列腺癌细胞DU145对芍药内酯苷尤其敏感。2、芍药内酯苷抑制肿瘤细胞迁移实验肿瘤细胞迁移检测实验结果显示，芍药内酯苷对肠癌细胞CT26、宫颈癌细胞Hela、神经母细胞瘤细胞SY5Y、乳腺癌细胞MDA231、乳腺癌细胞T47D、乳腺癌细胞MCF7、横纹肌肉瘤细胞A204、肾癌Wilms细胞G401、鼻咽癌细胞CNE2Z、前列腺癌细胞DU145、喉癌细胞Hep2、肺癌细胞A549、肺癌细胞LLC、胰腺癌细胞PANC1和肾上腺皮质瘤细胞SW13等的迁移具有显著抑制作用。其中，芍药内酯苷对宫颈癌细胞Hela、肠癌细胞CT26、乳腺癌细胞MDA231、鼻咽癌细胞CNE2Z和胰腺癌细胞PANC1迁移的抑制作用尤其显著。3、预防肿瘤发生的作用采用芍药内酯苷处理基因突变剂氧化偶氮甲烷(AOM)诱导小鼠肠炎到原发肠癌转化的实验结果显示，芍药内酯苷在治疗肠癌癌前病变、预防和阻断从重度肠炎到肠癌的转化过程中发挥着显著的作用。附图说明图1：芍药内酯苷对肿瘤细胞迁移能力的影响(Transwell检测)。图2：芍药内酯苷对肿瘤细胞迁移能力的影响(ScratchAnalysis检测)。图3：芍药内酯苷和白芍总苷对肿瘤细胞迁移的影响比较(Transwell检测)。图4：芍药内酯苷对肠炎到肠癌转化的阻断作用实验结果：其中，4A：三组小鼠的结肠照片；4B：三组小鼠的结肠组织HE染色结果。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中所用的芍药内酯苷购自上海鼎瑞化工有限公司(纯度均为98％以上)，白芍总苷胶囊(帕夫林)购自宁波立华制药有限公司。实施例1芍药内酯苷对肿瘤细胞增殖的影响实验方案：采用噻唑蓝(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，MTT)实验，芍药内酯苷分别处理横纹肌肉瘤细胞A204、鼻咽癌细胞CNE-2Z、肠癌细胞CT26、肠癌细胞HT29、神经母细胞瘤细胞SY5Y、喉癌细胞Hep2、胰腺癌细胞PANC1、宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA231、乳腺癌细胞T47D、乳腺癌细胞MCF7、皮肤鳞癌细胞A431、肾癌Wilms细胞G401、前列腺癌细胞DU145约24小时；之后MTT染色4小时，二甲基亚砜(DMSO)溶解，酶标仪570nm下测吸光光度值。实验结果：发现芍药内酯苷对胰腺癌细胞PANC1、肠癌细胞CT26、肠癌细胞HT29、喉癌细胞Hep2、宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA231、前列腺癌细胞DU145、鼻咽癌细胞CNE2Z、横纹肌肉瘤细胞A204、乳腺癌细胞T47D和乳腺癌细胞MCF7细胞的增殖都具有显著的抑制作用。其中，芍药内酯苷对肠癌细胞HT29、胰腺癌细胞PANC1、喉癌细胞Hep2、宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA231和前列腺癌细胞DU145的作用最为敏感，具体结果见表1。表1芍药内酯苷对肿瘤细胞增殖的影响(IC50)实施例2芍药内酯苷对肿瘤细胞迁移的影响(Transwell检测和ScratchAnalysis检测)实验方案：1)采用细胞迁移检测(Transwell)实验，对A549、LLC、Hela、SY5Y、CT26、T47D、MCF7、MDA231、A204、G401、CNE-2Z、DU145、Hep2、PANC1和SW13肿瘤细胞加药芍药内酯苷24小时后(选用安全剂量20μg/ml)，无水冰甲醇固定20分钟，结晶紫染色15分钟，100倍光镜拍照，检测细胞迁移的个数。2)采用细胞迁移检测实验(ScratchAnalysis)，对Hela、LLC、A549、SY5Y、CT26、MCF7、MDA231和T47D细胞加芍药内酯苷6小时和24小时(选用安全剂量20μg/ml)，40倍光镜拍照，检测细胞间距。实验结果：1)Transwell实验结果显示，芍药内酯苷(AL)可以显著抑制肺癌细胞A549、肺癌细胞LLC、宫颈癌细胞Hela、神经母细胞瘤细胞SY5Y、肠癌细胞CT26、乳腺癌T47D、乳腺癌MCF7、乳腺癌MDA231、横纹肌肉瘤细胞A204、肾癌Wilms细胞G401、鼻咽癌细胞CNE-2Z、前列腺癌细胞DU145、喉癌细胞Hep2、胰腺癌细胞PANC1和肾上腺皮质瘤细胞SW13细胞的迁移，表现为给药组中细胞数目相对于对照组显著减少，其中，芍药内酯苷对宫颈癌细胞Hela、肠癌细胞CT26、乳腺癌细胞MDA231、鼻咽癌细胞CNE2Z和胰腺癌细胞PANC1肿瘤细胞迁移的抑制作用尤其显著。具体见图1。2)ScratchAnalysis实验结果显示，相对于对照组而言，芍药内酯苷给药组的划痕宽度相对正常对照组均明显增大，证明芍药内酯苷可以抑制所测肿瘤细胞的迁移。具体见图2。综上所述，实验结果提示芍药内酯苷对肿瘤细胞的迁移具有广泛的、显著的抑制作用。实施例3芍药内酯苷与白芍总苷抑制肿瘤的效果比较1、芍药内酯苷和白芍总苷对肿瘤细胞增殖的影响比较(MTT)实验方案：采用噻唑蓝(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，MTT)实验，芍药内酯苷和白芍总苷分别处理A204、CNE-2Z、CT26、Hep2和PANC1肿瘤细胞24小时，之后MTT染色4小时，二甲基亚砜(DMSO)溶解，酶标仪570nm下测吸光光度值。实验结果：发现芍药内酯苷和白芍总苷对横纹肌肉瘤细胞A204、鼻咽癌细胞CNE-2Z、肠癌细胞CT26、喉癌细胞Hep2和胰腺癌细胞PANC1的增殖都具有抑制作用，但是芍药内酯苷对这些肿瘤的IC50(半数抑制率)值全部低于白芍总苷，说明芍药内酯苷对横纹肌肉瘤细胞A204、鼻咽癌细胞CNE-2Z、结肠癌细胞CT26、喉癌细胞Hep2和胰腺癌细胞PANC1肿瘤细胞增殖的抑制作用强于白芍总苷。具体结果见表2。表2芍药内酯苷和白芍总苷对肿瘤细胞增殖的影响(IC50)2、芍药内酯苷和白芍总苷对肿瘤细胞迁移的影响比较(Transwell)实验方案：采用细胞迁移检测(Transwell)实验，对A204、CNE-2Z、CT26、DU145、Hep2、PANC1和SW13肿瘤细胞分别加入芍药内酯苷和白芍总苷作用24小时(选用安全剂量10μM)，无水冰甲醇固定20分钟，结晶紫染色15分钟，100倍光镜拍照并检测迁移细胞的个数。实验结果：芍药内酯苷和白芍总苷都可以显著抑制对横纹肌肉瘤细胞A204、鼻咽癌细胞CNE-2Z、肠癌细胞CT26、前列腺癌细胞DU145、喉癌细胞Hep2、胰腺癌细胞PANC1和肾上腺皮质瘤SW13肿瘤细胞迁移，表现为给药组中细胞数目相对于对照组显著减少；但芍药内酯苷对横纹肌肉瘤细胞A204、鼻咽癌细胞CNE-2Z、肠癌细胞CT26、前列腺癌细胞DU145、喉癌细胞Hep2、胰腺癌细胞PANC1和肾上腺皮质瘤SW13肿瘤细胞迁移的抑制作用全部强过白芍总苷。具体见图3。实施例4芍药内酯苷对肠癌癌前病变的治疗作用实验方案：BALB/C小鼠分为3组：正常组，模型组和芍药内酯苷干预组，每组5只。模型组和干预组小鼠腹腔注射基因突变剂氧化偶氮甲烷(AOM，20mg/Kg)。芍药内酯苷干预组在AOM注射的第2天腹腔注射给药(100mg/Kg)，两天一次，共3次。模型组无任何药物处理。AOM给药一周后用3％硫酸葡聚糖钠(DSS)取代正常饮用水，小鼠连续饮用7天；之后换回正常饮用水，小鼠连续饮用14天。从AOM注射、饮用DSS水到饮用正常水14天的周期共重复3次，芍药内酯苷干预组在3个周期中都正常给药。正常组小鼠正常喂食和饮水，不加任何处理。第3周期结束时，处死小鼠，剖出肠组织，制备病理切片，进行HE染色。实验结果：外观显示，正常小鼠的结肠粗细均匀，黏膜没有充血。相对于正常小鼠，模型组小鼠结肠黏膜充血明显，肠道粗细不均，且已经生成若干个肿瘤；而芍药内酯苷干预组小鼠结肠粗细较为均匀，无明显出血点，也未见肿瘤生成，具体见附图4A。病理切片HE染色结果显示，正常小鼠肠组织腺体结构完整且分布均匀，无明显炎性细胞浸润，无黏膜下出血和溃疡现象。模型组小鼠肠组织出现黏膜溃疡，多个腺体缺失伴炎性细胞浸润，癌细胞浸润至肠黏膜层和黏膜下层，呈现原位肠癌的典型特征。而芍药内酯苷干预组小鼠肠组织虽出现灶性炎性细胞浸润，个别腺体缺失，但无明显癌细胞浸润现象，显示肠炎的典型特征，具体见附图4B。结果显示，芍药内酯苷在小鼠从重度肠炎到肠癌的转化过程中发挥着有效的阻断作用，对治疗癌前病变具有重要作用。总结，芍药内酯苷能够有效抑制肠癌、肺癌、胰腺癌、喉癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、横纹肌肉瘤、肺癌、神经母细胞瘤、肾癌和肾上腺皮质瘤的生长和转移，特别能够有效抑制肠癌、胰腺癌、喉癌、宫颈癌、乳腺癌和前列腺癌的生长和转移。芍药内酯苷还能够治疗肠癌癌前病变，阻断重度肠炎向肠癌的转化。