一种促进哺乳动物肠道发育的方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种促进哺乳动物肠道发育的方法。
背景技术：
：哺乳动物的肠道发育情况可以在一定程度上影响动物的生长特性和性状，例如，提高仔猪在哺乳期的肠道发育，可以促进仔猪对营养的吸收和利用，进而提高仔猪在哺乳期的生长发育，使仔猪在断奶时具有更高的体重，断奶时体重较高的仔猪生长速度比体重轻的仔猪要快，会更早地达到上市体重，缩短圈养时间，降低饲养成本。在哺乳动物中，胰高血糖素-2(glucagon-likepeptide2，GLP-2)是以胰高血糖素原基因为模板，在肠道L细胞和中枢神经元中经过单链mRNA转录、翻译后处理加工的33个氨基酸组成的保守多肽。GLP-2最显著的功能是作为肠上皮特异性生长因子，可以通过促进隐窝细胞增殖和抑制隐窝细胞凋亡来达到促进绒毛扩张的效果，GLP-2还可以通过促进麦芽糖酶-葡糖淀粉酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶、钠依赖性的葡萄糖转运蛋白-1、和葡萄糖转运蛋白-2的基因表达和蛋白活性来促进营养的吸收。二肽基肽酶-IV(diepeptidylpeptidase-IV，DPP-IV)DPP-IV是一种广泛存在的位于细胞表面的丝氨酸肽酶(serinepeptidase)，活性状态的GLP-2分泌之后很快会被DPP-IV切割N端的组氨酸和丙氨酸从而失去活性变成非活性状态。因此有必要开发一种促进哺乳动物肠道发育的方法，通过降低二肽基肽酶对GLP-2的抑制作用，增加肠道内GLP-2的含量，从而对哺 乳动物的肠道发育进行改善，提供一种改变动物体的生长特性的畜牧业生产方法。技术实现要素：本发明的目的在于开发一种促进哺乳动物肠道发育的方法。为达到以上目的，本发明的发明人对二肽基肽酶-IV(diepeptidylpeptidase-IV，DPP-IV)的性质和活性进行了深入的研究，希望找到一种二肽基肽酶-IV的抑制方法，DPP-IV蛋白在肠道和血液中具有相对较高的含量。本发明的发明人通过大量分析研究发现，在乳蛋白的序列中含有大量的多肽序列与具有DPP-IV抑制作用的序列相吻合。因此想到利用乳蛋白的水解产物对DPP-IV的活性进行抑制。为了证实这一发现，本发明的发明人用胃蛋白酶处理牛乳清蛋白的四种主要成分，即牛α-乳清白蛋白，牛β-乳球蛋白，牛血清白蛋白和牛乳铁蛋白，发现上述四种蛋白的水解产物均可以在体外抑制DPP-IV的酶切活性，其中α-乳清白蛋白(α-LA)的水解产物具有最高的抑制效率。基于以上发现，本发明提供了一种促进哺乳动物肠道发育的方法，所述方法包括，利用α-乳清白蛋白的水解产物抑制二肽基肽酶-IV的酶切活性。可选的，所述水解产物为利用蛋白酶对α-乳清白蛋白进行水解获得的，所述蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶。可选的，所述蛋白酶为胃蛋白酶。可选的，所述水解产物是利用哺乳动物胃液或肠液对α-乳清白蛋白进行水解所获得的水解产物。可选的，所述方法包括：将所述水解产物在36-38℃，pH为8.0-8.4的条件下与二肽基肽酶-IV接触。可选的，相对于1ng的二肽基肽酶-IV，所述水解产物的用量为50μg-150μg。可选的，其特征在于，所述α-乳清白蛋白为人α-乳清白蛋白。本发明的一个方面还提供了所述促进哺乳动物肠道发育的方法在抑制二肽基肽酶-IV的酶切活性中的应用。本发明的一个方面还提供了所述促进哺乳动物肠道发育的方法在畜牧生产中的应用。本发明所提供的方法通过利用α-乳清白蛋白的水解产物特别是人α-乳清白蛋白的水解产物抑制DPP-IV的酶的外切活性减少了DPP-IV对GLP-2的切割作用，从而提高了GLP-2的半衰期，能够达到促进动物肠道发育和营养吸收的目的。附图说明图1为人α-乳清白蛋白和人乳铁蛋白在体外模拟胃肠道中的消化情况；其中，A为模拟胃液消化产物；B为模拟肠液消化产物；M:购自NEB公司的彩色蛋白预染Marker(7-175kD)；1：人α-乳清白蛋白；2：人α-乳清白蛋白水解产物；3：人乳铁蛋白；4：人乳铁蛋白水解产物。图2为rHLA和rHLF在模拟胃肠道消化之后的水解产物对DPP-IV酶活性的抑制效率；A：rHLA和rHLF经过模拟胃液消化之后的水解产物对DPP-IV酶活性的抑制效率；B:rHLA和rHLF经过模拟肠液消化之后的水解产物对DPP-IV酶活性的抑制效率；数值为最小二乘均值±标准误；实验重复了2次。图3为转基因克隆猪和非转基因猪饲喂的仔猪在哺乳期中不同时间的血液中DPP-IV的酶活性；将转基因克隆猪和非转基因猪饲喂的仔猪在出生后的7天，14天和21天时，在进食1小时后采集血样，离心得到血清后检测DPP-IV的酶活。**，p＜0.01具有显著差异，***，p<0.001，具有极显著差异。图4为转基因克隆猪和非转基因猪饲喂的仔猪在哺乳期结束后肠道组织中DPP-IV的酶活转基因猪和非转基因猪饲喂的仔猪在哺乳期结束时对仔猪进行屠宰，采集十二指肠、空肠、回肠、结肠和直肠的组织样品检测DPP-IV的酶活性，*,p＜0.05,具有显著差异，**,p＜0.01,具有极显著差异。图5为转基因克隆猪和非转基因猪饲喂的仔猪在哺乳期结束时的肠道长度转基因猪和非转基因猪饲喂的仔猪在哺乳期结束时对仔猪进行屠宰，将小肠，结肠和直肠分离并测量长度，*,p＜0.05,具有显著差异。具体实施方式下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。本发明提供了一种促进哺乳动物肠道发育的方法，所述方法包括，利用α-乳清白蛋白的水解产物抑制二肽基肽酶-IV的酶切活性。在本发明的一种实施方式中，所述水解产物为利用蛋白酶对α-乳清白蛋白进行水解获得的，所述蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶。优选的情况下，所述蛋白酶为胃蛋白酶。本发明所提供的方法中，对于蛋白酶的添加量没有特别的限制，只要能够使得α-乳清白蛋白充分水解获得水解产物即可，优选的，相对于100ng的α-乳清白蛋白，所述蛋白酶的添加量为4ng。在本发明的一种实施方式中，所述水解产物是利用哺乳动物胃液或肠液对α-乳清白蛋白进行水解所获得的水解产物。其中，所述胃液既包括获得自哺乳动物胃部的胃液，也包括通过人工模拟方式获得的与哺乳动物胃液成分、酸碱度接近或一致的 含有胃蛋白酶的模拟胃液，本发明中，pH为1.2，100mL模拟胃液中的胃蛋白酶的添加量按照以下公式1计算：公式1：A=5×10619×B]]>A—胃蛋白酶添加量，单位为毫克(mg)；B—胃蛋白酶活力，单位为单位活力每毫克(U/mg)；所述肠液、既包括获得自哺乳动物肠部的肠液，也包括通过人工模拟方式获得的与哺乳动物肠液成分、酸碱度接近或一致的含有胰蛋白酶的模拟肠液。在本发明中，所使用的胰蛋白酶(pancreatin)应满足40℃5min内，能将其质量的25倍的淀粉转化为水溶性的碳水化合物；40℃60min内(pH7.5)，消化掉其质量的25倍的酪蛋白；37℃(pH9.0)，每毫克胰酶每分钟能够从橄榄油中至少水解生成2μmol脂肪酸。本发明所提供的方法中，对于哺乳动物胃液、肠液的添加量没有特别的限制，只要在不过量的情况下能够使得α-乳清白蛋白充分水解获得水解产物即可，优选的，相对于100ng的α-乳清白蛋白，所述哺乳动物肠液的总添加量为4ng。本发明中，对α-乳清白蛋白的水解的条件只要满足所使用的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃液、肠液的水解反应条件即可。本发明中，所述哺乳动物胃液和肠液可以为任何年龄段哺乳动物的胃液和肠液，优选的情况下，所述哺乳动物胃液和肠液为发育成熟的哺乳动物的胃液或肠液。本发明中所述的胃液为胃内分泌物的总称。包括水、电解质、脂类、蛋白质和多肽激素。纯净胃液为无色透明液体，pH0.9～1.5，比重为1.006～1.009，每日分泌量为1.5～2.5升，含固体物约0.3～0.5％，无机物主要为Na+、K+、H+和Cl-，有机物为胃粘膜层各种不 同上皮细胞分泌额胃蛋白酶原、粘液蛋白和“内因子”。肠液：由肠腺和上皮细胞分泌的，离心处理时黄色透明，碱性(pH7.7)，比重在1.007上下，大部分为水分，含NaCl0.58—0.67％，碳酸钠0.22％，含有磷蛋白性粘液。这个肠液是消化食物的酶，含有氨肽酶、蔗糖酶、乳糖酶、麦牙糖酶、核酸分解酶以及卵磷脂酶等，此外也含有磷酸酯酶。所述哺乳动物可以为人类、猪、牛或羊，优选的所述哺乳动物为猪或人类。在本发明的一种实施方式中，所述方法包括：将所述水解产物在36-38℃，pH8.0-8.4，的条件下与二肽基肽酶-IV接触。优选的，接触过程在0.1MTris-HCl缓冲液中进行。本发明中，对于接触的方式没有特别的限制，只要能够使得二者混合均匀、水解充分进行即可，可选的，在接触的过程中可以在恒温箱中对混合物进行搅拌，接触的时间可以为45-70min，当接触的时间为50-60分钟时，获得的水解产物对DPP-IV的抑制效率最高。在本发明中，所述含有α-乳清白蛋白的底物包括含有α-乳清白蛋白的动物乳汁或含有α-乳清白蛋白的水溶液。本发明所述的含有α-乳清白蛋白的底物还包括含有α-乳清白蛋白的制剂，所述制剂包括但不限于动物饲料、保健食品、添加剂、蛋白粉、乳制品等。在本发明所提供的方法中，相对于1ng的二肽基肽酶-IV，所述水解产物的用量为50μg-150μg，优选的，相对于1ng的二肽基肽酶-IV，所述蛋白酶水解产物的用量为80μg-120μg，特别优选的，所述水解产物的用量为100μg。本发明所提供的α-乳清白蛋白包括但不限于牛α-乳清白蛋白、猪α-乳清白蛋白和人α-乳清白蛋白，当所述α-乳清白蛋白为人α-乳清白蛋白时，所获得的抑制DPP-IV的效果最好。本发明中，所述的人α-乳清白蛋白基因基因位于第十二号染色体短臂上(Daviesetal.,1987)，编码区的全长为2363bp，包括四个外显子和三个内含子。本发明还提供了所述促进哺乳动物肠道发育的方法在促进哺乳动物肠道发育中的应用。下面通过实施例的方式对本发明进行进一步的说明，在以下实施例中：胃蛋白酶、胰蛋白酶、Gly-Prop-nitroanilidehydrochloride为Sigma公司产品；人α-乳清白蛋白(humanα-lactalbumin，rHLA)和人乳铁蛋白(humanlactoferrin，rHLF)由北京济福霖生物技术公司提供。实施例1在体外对人α-乳清白蛋白和乳铁蛋白进行模拟胃肠道消化(1)按照中华人民共和国农业部发布的《转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法》配置模拟胃液和肠液。(2)分别取1.5g人α-乳清白蛋白和乳铁蛋白，溶于10ml水溶液中，并且每种蛋白溶液分别调节成pH1.2和pH7.5两种类型，按照酶和底物的比例为4：100加入模拟消化液(胃液和肠液)和蛋白水溶液，之后放置在37℃恒温培养箱中反应1小时；吸取500μL样品用于SDS-PAGE检测水解程度；将模拟肠液的消化液pH使用0.2MNaOH调节为9.5使酶失活；上述消化液以12100g离心10min(25℃)，收集上清液进行冷冻干燥。(3)将4种消化液(人α-乳清白蛋白的胃液消化液、人α-乳清白蛋白的肠液消化液、乳铁蛋白的胃液消化液、乳铁蛋白的)分别和5×变性上样缓冲液等体积混合，上样；连接电源，开始电压设置为60V，待溴酚蓝前沿进入分离胶后，提高电压至110V，至预染Marker 中最小的的条带跑到底部，将凝胶从胶板中取出，用蒸馏水漂洗后，放入考马斯亮蓝染色液中，将微波炉调至最大功率，加热凝胶和染色液1min，重复一次，最后转到摇床，温和摇动，染色6-8h；用蒸馏水漂洗染色后的凝胶，加入脱色液，置于摇床上，温和摇动，脱色至背景清晰，进行拍照和分析，结果如图1A所示，人α-乳清白蛋白和乳铁蛋白的消化性良好。实施例2人-α-乳清白蛋白水解产物对DPP-IV酶活的抑制(1)将实施例1中获得的冷冻干燥后的水解产物使用0.1MTris-HCl(pH8.0)分别稀释成终浓度为6mg/mL，2mg/mL和0.2mg/mL的溶液，反应缓冲液为0.1MTris-HCl(pH8.0)。DPP-IV酶活检测反应体系见表1(单位μL)表1分组底物DPP-IV提取物水解产物反应缓冲液实验组76.162561.84实验组对照7—2568酶活性组76.16—86.84酶对照组7——93(2)在96孔板中，先加入底物，水解产物和反应缓冲液，放置于37℃恒温培养箱中10分钟，之后加入DPP-IV提取物，将反应体系放置在37℃恒温培养箱中反应10分钟；加入25％的冰醋酸使反应停止，在分光光度计的405nm波长读取数据作为酶活指标，结果如图2A和2B所示，人α-乳清白蛋白和乳铁蛋白的模拟胃液和模拟肠液的消化产物均对DPP-IV酶活具有抑制作用。实施例3以转基因克隆猪为实验对象，进行动物实验，检测体内的DPP-IV酶活。(1)以乳腺表达人α-乳清白蛋白的转基因克隆长白猪为实验对象，设计动物实验。转基因克隆猪乳中人α-乳清白蛋白的平均表达量为2567.0±1276.39μg/ml，转基因克隆猪与非转基因长白母猪一起 配种，之后检测受孕的母猪用于动物实验。分娩之后，母猪和出生的仔猪要仔细护理；在分娩后的24小时内，确保每窝仔猪的数量为6只。仔猪的哺乳期为21天，在这期间，猪乳是仔猪唯一的营养来源，所有仔猪自由饮水。(2)哺乳期的第7、14和21天，在仔猪进食1小时后，对仔猪进行前腔静脉采血0.5ml，3000g离心10min得到血清，储存于-80℃，用于检测DPP-IV酶活。(3)在仔猪出生后的第22天，对其进行屠宰，将小肠和大肠分离出来，测量其长度(结果如图5所示，实验组仔猪的小肠，结肠和直肠长度要长于对照组)，之后采集十二指肠，空肠，回肠，结肠和直肠的组织样品，储存于-80℃，用于提取蛋白，检测DPP-IV酶活。(4)取组织样，按照每20毫克组织加入150-250μlNP-40裂解液的比例加入裂解液。匀浆器1500g，5分钟，重复3次；充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清；使用BCA法测量蛋白浓度。(5)对血清样品和肠道蛋白样品进行DPP-IV酶活检测。反应体系中血清样品上样量10μL，组织样蛋白样品上样量为100μg，反应体系如表2和表3所示：表2分组底物血清样品反应缓冲液实验组7μL10μL83μL实验组对照—10μL90μL表3分组底物组织样反应缓冲液实验组7μL100μg适量实验组对照—100μg适量在96孔板中，先加入样品和反应缓冲液，放置于37℃恒温培养箱中10分钟，再加入底物，将反应体系放置在37℃恒温培养箱中反应10分钟；加入25％的冰醋酸是反应停止，在分光光度计的405nm波长读 取数据作为酶活指标(结果如图3和4所示)，实验组仔猪在第14天和21天的血液中DPP-IV酶活要低于对照组，同时第22天中，实验组的空肠，回肠，结肠和直肠中的DPP-IV酶活也低于对照组。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3