以超临界流体技术分离与纯化牛樟芝中机能成分的方法与流程

本发明与分离与纯化牛樟芝中机能成分的技术有关，更详而言之是指一种以超临界流体技术分离与纯化牛樟芝中机能成分的方法。

背景技术：

牛樟芝是一种生长在樟科植物(如牛樟树心材)的寄生真菌，具有抗氧化，降血压和增强免疫力等功效，不仅可作为食材，并已被广泛运用于治疗药物中毒、腹泻、腹痛、高血压和癌症。牛樟芝的活性成分为三萜类化合物(triterpenoids)、多醣体(polysaccharides)、腺苷(adenosine)、维生素、蛋白质、胜肽、核酸等。三萜类中主要有麦角甾(ergostane)三萜类(樟菇酸A(zhankuic acid A),樟菇酸C(zhankuic acid C)与樟芝酸C(antcin C),樟芝酸K(antcin K))与羊毛甾烷(lanostane)三萜类(去氢齿孔酸(dehydroeburicoic acid)与去氢硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid))成分。牛樟芝子实体萃取物中的antcin A成分，可抑制老鼠血癌细胞的活性，zhankuic acid A及zhankuic acid C有强的癌细胞毒杀作用。牛樟芝萃取纯化的三萜类成分：dehydrosulphurenic acid、dehydroeburicoic acid的实验结果证明，具有抗肿瘤活性、促使癌细胞凋亡，但不影响人体正常细胞。牛樟芝多醣体成分也被实验证明。

已知从牛樟芝中萃取其活性成分：三萜类化合物与多醣体成分的方法，如中国专利CN 102614195 A与美国专利20100210869 A1，以乙醇溶液、正己烷溶液及乙酸乙酯溶液依次对牛樟芝子实体进行萃取其麦角甾与羊毛甾烷三萜类成分。美国专利7994158B2首先以水或有机溶剂(如乙酸乙酯、己烷、醇类、氯仿)萃取，得到的水或有机溶剂萃取物，再经硅胶、Sephadex吸收、浓缩和纯化。美国专利20100227404 A1以乙酸乙酯、乙醇和水萃取牛樟芝子实体中的多醣体，中国台湾专利I299665以乙醇萃取牛樟芝菌丝体中的多醣体。

由上可知，已知萃取牛樟芝中三萜类化合物与多醣体机能成分的技术，不仅耗时，需使用大量的有机溶剂，且过程中有机溶剂可能会与机能成分产生化学反应，完成后溶剂去除与浓缩过程中，加热蒸发溶剂易造成机能成分部分破坏与溶剂残留于分离物或纯化物中，险有改进之处。

技术实现要素：

本发明的主要目的即在提供一种以超临界流体技术分离与纯化牛樟芝中机 能成分的方法，其可直接取得牛樟芝中三萜类化合物与多醣体机能成分，不需经繁复的溶剂去除与浓缩、分离程序，且无溶剂残留等安全疑虑，成本低，更可保持牛樟芝中生物活性成分的活性，甚为环保、安全，具实用价值。

缘是，为达成前述的目的，本发明提供一种以超临界流体技术分离与纯化牛樟芝中机能成分的方法，主要在预定温度与压力的操作条件下，将牛樟芝萃取液与超临界状态溶剂通入一分馏槽内，用以萃取出牛樟芝的三萜类化合物与多醣体等机能成分，再将萃取出的机能成分与超临界状态溶剂，在预定温度与低于前述压力的操作条件下，持续通入三个分离槽，用以分别于各分离槽中获得牛樟芝萃取液中的三萜类化合物与多醣体机能成分。

优选地，所述牛樟芝萃取液以1:5-10(W/V)的比例将牛樟芝粉末与乙醇混合离心而成。

更优选地，所述牛樟芝粉末为牛樟芝的子实体、菌丝体、皿式培养或固态培养的粉末。

优选地，在压力2000-4000Psi、温度40-60℃的操作条件下，将所述牛樟芝萃取液放置于所述分馏槽，以超临界流体流速3-9L/hr、牛樟芝萃取液流速1-3L/hr流入分馏槽进行萃取，超临界状态溶剂为超临界二氧化碳/乙醇。

优选地，将所述分馏槽内萃取出的机能成分依序输送经过连接的三个分离槽逐步降压，用以可选择性分离与纯化提升三萜类化合物与多醣体机能成分的含量与纯度。

更优选地，在温度40℃或60℃下，依序分别以3000、2000、1000psi的压力在三个所述分离槽快速降压分离超临界状态溶剂。

优选地，在压力为4000Psi、温度为40℃的操作条件下，最适于将牛樟芝三萜类成分分离于所述分馏槽的顶部，而牛樟芝多醣体成分容易被分离于该分馏槽的底部。

优选地，在温度为40℃、压力为4000psi的操作条件下，牛樟芝中三萜类化合物与多醣体成分的选择性值达220，最适于将牛樟芝中三萜类化合物与多醣体成分纯化区分于三个分离槽中。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种以超临界流体技术分离与纯化牛樟芝中机能成分的方法，仅通过控制操作温度与压力，即可分离出牛樟芝三萜类与多醣体，而且，分离与纯化过程中没有溶剂残留与毒性等问题，以简明的牛樟芝三萜类与多醣体分离效率及选择性计算求得，易于操作、量产并可连续式运作。

附图说明

图1为本发明一较佳实施例的压力-牛樟芝总三萜类成分分离效率分析图。

图2为本发明一较佳实施例的压力-牛樟芝三萜类成分分离效率分析图。

图3为本发明一较佳实施例的压力-牛樟芝总多醣体成分分离效率分析图。

图4为本发明一较佳实施例的压力-牛樟芝中三萜类化合物与多醣体成分的选择性值分析图。

图5为本发明一较佳实施例的三萜类化合物与多醣体成分、分馏槽底部残余物(R)与三分离槽F1、F2、F3的浓度分布图。

图6A为本发明一较佳实施例的萃取液的HPLC图谱图。

图6B为本发明一较佳实施例的区分物1的HPLC图谱图。

图6C为本发明一较佳实施例的残余物的HPLC图谱图。

具体实施方式

以下，举本发明一较佳实施例，并配合附图做进一步的详细说明如后：

本发明一较佳实施例以超临界流体技术分离与纯化牛樟芝中机能成分的方法，主要先备取1-2Kg的牛樟芝粉末(可为牛樟芝的子实体、菌丝体、皿式培养或固态培养、粉末)，以1:5-10(W/V)的比例用乙醇混合离心，产生牛樟芝萃取液(Feed)，接着在压力2000-4000Psi、温度40-60℃、超临界流体(二氧化碳SC-CO2/乙醇溶剂)流速3-9L/hr与牛樟芝萃取液流速1-3L/hr的操作条件下，通入一分馏槽内进行分离的处理，用以可在该分馏槽的顶端获取牛樟芝三萜类含量y(triterpenoids)与多醣体含量y(polysaccharides)，该分馏槽底端获取牛樟芝三萜类含量x(triterpenoids)与多醣体含量x(polysaccharides)。该分馏槽内径36mm、高度1000mm的不锈钢槽体，其内充填有不锈钢单体片。

接着，在温度40℃或60℃下，将超临界流体与萃取出牛樟芝的三萜类化合物与多醣体等机能成分，持续地依序输送经过连接的三个分离槽，分别以3000、2000、1000psi的压力逐步降压，也即，第一分离槽3000psi的压力，第二分离槽2000psi的压力，而最后的第三分离槽1000psi的压力，可在该分馏槽底部得到残余物，即牛樟芝萃取液中的三萜类与多醣体等机能成分，三个分离槽分别得到区分物1(F1)，区分物2(F2)和区分物3(F3)。三个分离槽皆为内径36mm、高度500mm的不锈钢槽体。

以下，利用不同的操作条件(改变压力与温度)实施前述方法，取牛樟芝萃取液(Feed)、分馏槽顶部得到的萃取物(Extract)、分馏槽底部得到的残余物(Raffinate)，三个分离槽分别得到的区分物1(F1)，区分物2(F2)和 区分物3(F3)，分析定量以下性质：(1)牛樟芝总三萜类含量、(2)牛樟芝总多醣体含量、(3)牛樟芝中三萜类化合物成分与含量。

总三萜类含量的测量，以熊果酸当为标准品，在波长548nm吸光度换算标准品含量，定量单位以mg/ml表示。总多醣体含量的测量，以苯酚硫酸法测定试剂，在波长490nm吸光度换算葡萄糖的含量，定量单位以mg/ml表示。三萜类化合物的个别成分与含量的测量，以C18管柱的HPLC定量分析，单位以mg/ml表示。实验结果分为二部分：(1)牛樟芝中的机能成分最适分离与纯化条件，(2)总三萜类含量、总多醣体含量与三萜类的个别化合物成分的分离与纯化量产制程，数据分析如图1至图6所示。

首先，将牛樟芝萃取液分离后，收集该分馏槽顶部与底部的样品，分析二者含量并计算出牛樟芝三萜类的分离效率(Ktriterpenoids)、牛樟芝多醣体的分离效率(Kpolysaccharides)与二者含量的选择性值(selectivity)。定义如下：

Ktriterpenoids＝分馏槽顶部牛樟芝三萜类含量(V*y(triterpenoids))÷分馏槽底部牛樟芝三萜类含量(L*x(triterpenoids))。

Kpolysaccharides＝分馏槽顶部牛樟芝多醣体含量(V*y(polysaccharides))÷分馏槽底部牛樟芝多醣体含量(L*x(polysaccharides))。

选择性值定义：＝Ktriterpenoids÷Kpolysaccharides。

当Kpolysaccharides＝1时，表示该分馏槽顶部的牛樟芝多醣体含量等于分馏槽底部牛樟芝多醣体含量。当Ktriterpenoids＝1时，表示该分馏槽顶部的牛樟芝三萜类含量等于分馏槽底部牛樟芝三萜类含量。因此，Ktriterpenoids>>1时，表示牛樟芝三萜类含量容易被分离于分馏槽的顶部；Kpolysaccharides<<1时，表示牛樟芝多醣体含量容易被分离于该分馏槽底部。操作压力与温度会改变牛樟芝中的三萜类化合物与多醣体成分的分离效率。

分离后的数值结果显示：如图1所示，温度在40℃范围下，压力越高时(即压力达4000psi时)，牛樟芝总三萜类成分的分离效率(Ktriterpenoids)达50左右。以最适温度40℃分析不同压力范围下(2000-4000psi)的牛樟芝三萜类每个成分的分离效率，图2显示牛樟芝三萜类成分在压力4000psi时，如樟菇酸A(zhankuic acid A)与去氢硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)的分离效率达150以上，樟芝酸C(antcin C)与去氢齿孔酸(dehydroeburicoic acid)的分离效率达30以上，而樟芝酸K(antcin K)与樟菇酸C(zhankuic acid C)的分离效率至少达10以上。如图3所示，温度在60℃范围下，压力越高时(即压力达4000psi时)，牛樟芝总多醣体成分的分离效率(Kpolysaccharides)达3.6；相对地，温度在40℃与压力4000psi 时，牛樟芝总多醣体成分的分离效率只有0.23。因此，由图1与图3可知，采用温度40℃与压力4000psi时，最适于将牛樟芝三萜类成分分离于分馏槽的顶部，而，牛樟芝多醣体成分则容易被分离于该分馏槽底部。

如图4所示，当温度在40℃范围下与压力达4000psi时，牛樟芝中三萜类化合物与多醣体成分的选择性值达220，显示在此操作条件下，最适于将牛樟芝中的三萜类化合物与多醣体成分纯化区分在三个分离槽中(F1、F2、F3)。举例而言，选择温度40℃与压力4000psi的操作条件下，将牛樟芝中的三萜类化合物，分离于分馏槽的顶端，再利用降压(即降低压力至3000、2000、1000psi在F1、F2、F3)，可以选择性地分离、区分与纯化牛樟芝中的三萜类化合物与多醣体成分含量与纯度。因此，如图5所示，利用最适合的选择性值实验数值，以牛樟芝萃取液(Feed)在温度40℃与压力4000psi的操作条件下，分离出分馏槽底部得到残余物(R)与分馏槽顶部得到萃取物(Extract)，再将Extract区分至三个分离槽F1、F2、F3中。如图5分析R、F1、F2、F3的三萜类化合物与多醣体成分浓度分布，显示牛樟芝萃取液中的多醣体成分被分配至分馏槽的底部R；同时，牛樟芝萃取液中的三萜类成分被分配至分离槽F1与F2中，牛樟芝三萜类中的樟芝酸C(antcin C)、去氢硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)与樟菇酸A(zhankuic acid A)成分大部分被区分在分离槽F1中。比较牛樟芝萃取液、第一分离槽-区分物1(F1)与分馏槽的底部R中的牛樟芝三萜类成分，图6A至图6C的HPLC图谱显示与证明：牛樟芝萃取液中的三萜类化合物可以经过分馏槽分离后，95％以上的三萜类化合物可以分离与纯化至第一分离槽-区分物1(F1)中。

由上可知，本发明所提供以超临界流体技术分离与纯化牛樟芝中机能成分的方法，其可将牛樟芝萃取液分离出活性成分--三萜类与多醣体，相较于已知萃取与分离牛樟芝中三萜类化合物与多醣体成分的方法，本发明仅通过控制操作温度与压力，即可分离出牛樟芝三萜类与多醣体，而且，分离与纯化过程中没有溶剂残留与毒性等问题，以简明的牛樟芝三萜类与多醣体分离效率及选择性计算求得，易于操作、量产并可连续式运作，甚具实用价值。