本发明属于医药技术领域，涉及一种脂质体，尤其涉及一种具有大鼠肺主动靶向性的甲强龙免疫纳米脂质体及其制备方法。
背景技术：
现有技术公开了糖皮质激素类药物具有很强的抗炎作用与免疫抑制作用，已被广泛应用于全身各系统炎症性和免疫性疾病的治疗。此类药物也广泛应用于呼吸系统疾病的治疗，如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病、肺血管炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等。许多疾病，如间质性肺疾病、结节病等，需长期应用激素治疗。但糖皮质激素类药物又是一类不良反应十分明显的药物，长期应用或大剂量应用常可导致一系列不良反应，如高血压、血糖升高、消化性溃疡、胃肠道出血、Cushing综合征、骨质疏松、骨无菌性坏死、骨折、伤口愈合延迟、诱发或加重感染、儿童生长迟缓等，严重时可致残或危及生命。正是由于这种“双刃剑”效应严重影响了糖皮质激素类药物的临床疗效及治疗的依从性。因此，如何扬长避短，趋利避害，最大限度地发挥此类药物的治疗效应，同时尽可能地减少其不良反应，已成为临床及基础研究中亟待解决的重要课题。
近年来，纳米靶向技术的发展为这一医学难题的解决带来了希望。纳米技术已广泛应用于材料学、电子学、生物医药等多个领域并获得突破性进展。研究显示，当微粒尺寸进入纳米量级时，由于量子尺寸效应和表面效应，纳米粒子呈现出新奇的物理化学和生物学特性，如纳米技术可增加药物的溶解度，提高其生物利用度，增加药物对特定器官、组织、细胞的靶向作用，从而达到减少药物用量、增强疗效、减少副作用的目的。纳米靶向载体正成为纳米技术与药物控释技术研究的热点，其具有根据生理和智能需要来调控药物的释放，在纳米尺寸形成释药系统的特征。根据刺激信号的不同，释药系统可分为化学、物理和生物信号刺激响应性药物释放系统。生物靶向是利用抗体、细胞膜表面受体或特定基因片段的专一性作用，将配位子结合在纳米载体上，与目标细胞表面的抗原识别器发生特异性结合，使药物或目的基因能准确送到病变组织细胞，在对病变组织细胞取得疗效的同时，又避免对正常细胞的伤害。
近期研究发现，在骆驼、软骨鱼等动物血中存在一种天然缺失轻链的重链抗体，该抗体的可变区单独形成了完整抗原结合位点。克隆该抗体可变区，可得到分子量小、结构稳定、具有完整抗原结合能力的单域抗体，由于该单域抗体的大小在纳米级别，又称纳米抗体(Nb)。纳米抗体不仅分子量小，还具有亲和力高、稳定性好、免疫原性弱、组织穿透力强的独特性质，已在抗肿瘤、抗感染等领域展现出良好的应用前景。
研究还表明，Ⅱ型肺泡上皮细胞是肺组织药物递送的重要靶点之一。Ⅱ型肺泡上皮细胞是肺组织所特有的具有增殖和分泌功能的细胞，约占肺实质细胞总数的16％。Ⅱ型细胞能合成表面活性物质，储存在板层小体中，再分泌至肺泡表面发挥生理作用。肺泡表面活性物质主要成份是约90％的脂质和10％的蛋白，其中蛋白成份为特异性肺表面活性蛋白(surfactant protein,SP)，按其发现先后命名为SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。其中SP-A是由248个氨基酸组成的亲水性糖蛋白，是最早发现且在Ⅱ型肺泡上皮细胞中强烈表达、信号最为丰富的蛋白。研究发现，Ⅱ型上皮细胞除具有合成和分泌SP-A的功能以外，其细胞表面同时还具有高亲和力、特异性的SP-A受体。SP-A在肺外表达量极少，在肺内则为高浓度表达，表现为肺特异性。
基于以上理论，将糖皮质激素载入特定纳米药物载体，与肺表面活性蛋白A纳米抗体进行偶连，即可实现糖皮质激素对肺部的靶向输送。
本研究团队前期已成功研发出一种具有肺靶向性的地塞米松免疫脂质体(SPA-DXM-NLP)(201010263760.3)。但该发明所选择的肺组织靶向剂为SP-A多克隆抗体，存在分子量大(150KD)、特异性差、组织穿透力差、免疫原性强等诸多不足。针对这个问题我们又成功研发出SP-A纳米抗体(SPANb)(CN104109207A)，此纳米抗体具有分子量小(15KD)，水溶性好，不易聚集，穿透力强、免疫原性小等优点。
技术实现要素：
本发明是在上述前期研究的基础上，利用自主研发的SP-A纳米抗体作为新的肺靶向物质，选择具有更好疗效的甲基强的松龙替代地塞米松，研发出了更加优化的肺靶向激素新制剂。
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种具有肺主动靶向性的免疫纳米脂质体，尤其涉及一种具有大鼠肺主动靶向性的甲强龙免疫纳米脂质体。
本发明的另一目的是提供所述免疫纳米脂质体的制备方法。
本发明提供的一种具有肺主动靶向性的甲强龙免疫脂质体，由大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体、治疗药物和纳米脂质体组成；
其中，所述大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体为特异性肺组织靶向剂，所述治疗药物为甲强龙琥珀酸钠，所述纳米脂质体为载体；
负载所述甲强龙琥珀酸钠的所述纳米脂质体，即甲强龙纳米脂质体与所述大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联；
所述纳米脂质体由磷脂、胆固醇和脂质体辅料组成；
所述甲强龙琥珀酸钠与所述纳米脂质体中磷脂的摩尔比值为0.30-0.45。
本发明基于所述的肺表面活性蛋白A的特性，以甲强龙琥珀酸钠(MPS)为治疗药物，以纳米脂质体为载体，以大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体为特异性肺组织靶向剂，制备一种高效、稳定、具有明确肺主动靶向性的免疫纳米脂质体。
本发明中，所述的纳米脂质体以磷脂、胆固醇和聚乙二醇为材料制成。其中，所述的磷脂可以是大豆卵磷脂(SPC)、蛋黄卵磷脂(EPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，所采用的聚乙二醇包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-乙酸碘(DSPE-PEG3400-Iodoacetate)等。
本发明中，制备纳米脂质体所使用的磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-乙酸碘(DSPE-PEG3400-Iodoacetate)的摩尔比为20：14.5：1.8。最终大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-乙酸碘(DSPE-PEG3400-Iodoacetate)的摩尔比为1：168。
本发明中，所述的治疗药物为糖皮质激素家族中具有弱酸两亲性的甲泼尼龙琥珀酸钠，载药方法为pH梯度主动载药法。治疗药物与纳米脂质体中磷脂的最终摩尔比值为0.30-0.45，优选为0.40。
本发明中，甲强龙免疫纳米脂质体形态呈球形，外观光整，大小均一(如图1A所示)。
本发明中，甲强龙免疫纳米脂质体平均粒径为105.8±0.8nm。
本发明中，甲强龙免疫纳米脂质体对甲强龙琥珀酸钠的包封率为92.5±0.3％。
本发明中，甲强龙免疫纳米脂质体稳定性考察结果显示：脂质体混悬液于4℃放置12周后，脂质体对甲强龙琥珀酸钠的包封率无显著性变化(p﹥0.05)，样品放置稳定(如表1所示)。
本发明的大鼠肺主动靶向性的甲强龙免疫纳米脂质体能通过将药物对肺组织的靶向输送，减少用药剂量，提高对肺部疾病的疗效，同时又减少全身不良反应，具有新的临床实用价值。
本发明提供了大鼠肺主动靶向性的甲强龙免疫纳米脂质体的制备方法，其特征在于，其包括步骤：
步骤1)制备甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs)：
以磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-醋酸碘(DSPE-PEG3400-PDP)为原料，采用超声薄膜分散法制备甲强龙纳米脂质体；
步骤2)制备甲强龙免疫纳米脂质体
大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs-SPANb)。
本发明还包括对所述大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体进行表征，包括形态、粒径、包封率和稳定性；以及大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体与甲强龙纳米脂质体的连接验证及活性验证。
具体地：
1、制备甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs)
采用超声薄膜分散法制备甲强龙纳米脂质体。称取二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、DSPE-PEG2000(DSPE-PEG2000)(各组分摩尔比为20：14.5：1.8)，以三氯甲烷/甲醇(体积比为2：1)溶解，置于圆底玻璃试管中，使用氮气吹干在管底成膜，室温下真空干燥过夜，去除有机溶剂。向膜内加入200mM的醋酸钙溶液，65℃下水浴超声30分钟，超声功率200w。将超声后的水化液依次在脂质体挤出器( Mini-Extruder)内依次通过0.4μm、0.2μm、0.1μm的滤膜，每个层级推挤13-17次，即可得脂质体混悬液。再将所得脂质体混悬液置入截留分子量为300kDa的透析管中透析过液,将脂质体外的溶液替换为0.9％的生理盐水，使pH脂质体内<pH脂质体外。称取处方量甲强龙琥珀酸钠(MPS)溶于0.9％生理盐水，配置成摩尔浓度4.2mM的MPS溶液，与上述脂质体混悬液混合(磷脂浓度为14.3mM)，70℃水浴加热1小时，4℃存放。取载药脂质体混悬液，通过凝胶过滤柱(Superose 12 10/300GL)去除游离MPS。
2、甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs)的表征
MPS-NSSL外观呈球形，表面圆滑光整，大小均一(如图1A所示)；
MPS-NSSL平均粒径为98.1±0.5nm；
MPS-NSSL包封率：甲强龙纳米脂质体对甲强龙琥珀酸钠的包封率为91.4±0.6％；
3、制备甲强龙免疫纳米脂质体，即大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs-SPANb)
首先将脂质体表面的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)末端添加醋酸碘功能基团，再利用醋酸碘与大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体His标签中的咪唑基进行反应偶联。其中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)末端添加醋酸碘功能基团是通过将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH2)与碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SIA)进行反应来实现的。
首先将DSPE-PEG3400-NH2与SIA按照摩尔浓度1：150溶于三氯甲烷溶液，常温下避光反应过夜。反应完成后使用PD-10脱盐柱将过量的SIA去除，即可得纯化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-醋酸碘(DSPE-PEG3400-Iodoacetate)(反应过程如图2所示)。
采用超声薄膜分散法将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、制备出的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-醋酸碘(DSPE-PEG3400-Iodoacetate)带有乙酸碘功能基团的甲强龙纳米脂质体。制备过程同制备甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs)。
将纯化后的带乙酸碘功能基团的甲强龙纳米脂质体与肺表面活性蛋白A的纳米抗体混合(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-醋酸碘与肺表面活性蛋白A的纳米抗体的反应摩尔浓度比60：1)，混匀后4℃放置过夜。同样使用凝胶过滤法(Superose 12 10/300GL)去除过量的药物与纳米抗体。
4、肺泡表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米质体(MPS-NSSLs-SPANb)的表征及偶联验证
肺泡表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米质体外观呈球形，表面圆滑光整，大小均一(如图1B所示)；
肺泡表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米质体平均粒径为105.8±0.8nm；
肺泡表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米质体对甲强龙琥珀酸钠的包封率为92.5±0.3％；
肺泡表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米质体在4℃下存放12周，脂质体对甲强龙琥珀酸钠的包封率无显著性变化(p﹥0.05)，样品放置稳定(如表1所示)
将大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,得出肺表面活性蛋白A在原始分子量上增加了脂质体的分子量大小，表明甲强龙纳米脂质体与肺泡表面活性蛋白A偶联成功(如图3所示),经ImageJ灰度分析，肺泡表面活性蛋白A的连接效率为35.59±2.37％。
将纯化后的大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体与肺泡表面活性蛋白A抗原进行ELISA检测，大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体较单纯甲强龙纳米脂质体，具有与肺泡表面活性蛋白A抗原的结合活性，p﹤0.05；较肺泡表面活性蛋白A纳米抗体，与肺泡表面活性蛋白A抗原的结合活性无差异，p﹥0.05(如图4所示)。
表1 MPS-NSSLs-SPANb的稳定性考察
5、大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙免疫纳米脂质体(MPS-NSSLs-SPANb)的组肺织靶向性实验
健康雄性SD大鼠105只，体重(102±8)g，随机分为3组：大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙免疫纳米脂质体(MPS-NSSL-SPANb)组、甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSL)组和甲强龙(MPS)组。三组分别经鼠尾静脉注射MPS-NSSL-SPANb、MPS-NSSL、MPS注射液(按甲强龙琥珀酸钠2mg/Kg体重计)。以给药后15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h为时间点。在每个时间点三组各取大鼠5只，异氟烷麻醉后眼眶取血，EDTA抗凝，离心后分离血浆。取血后迅速处死大鼠，取心、肝、脾、肺、肾等组织，生理盐水冲洗，滤纸吸干，精密称重。血浆及各组织-20℃保存备测。使用高效液相色谱仪，测定血浆及组织中甲强龙琥珀酸钠(MPS)浓度。
结果显示，注射MPS-NSSLs-SPANb与MPS-NSSLs的血液循环时间较MPS注射液的延长，血药浓度提高。注射后在各取样点，MPS-NSSLs-SPANb的血药浓度均高于MPS组(p﹤0.05)；在各取样点，MPS-NSSLs-SPANb在肺组织中MPS的浓度明显高于MPS组(p﹤0.01)，在15min、30min、1、2、4、8,MPS-NSSLs组在肺脏中甲强龙琥珀酸钠浓度亦显著高于MPS组(p﹤0.01)，以MPS-NSSLs-SPANb组升高更为明显。MPS-NSSLs-SPANb组、MPS-NSSLs组在肝、脾中甲强龙琥珀酸钠浓度有增高的趋势，但以MPS-NSSLs组增高更明显。在1、2h时间点上，MPS-NSSLs-SPANb组在肾脏中的药物分布显著低于的MPS组(p﹤0.01)，但在8h则稍高于甲强龙组(p﹥0.05)。三组制剂在心脏中的甲强龙琥珀酸钠浓度无明显差异(p﹥0.05)(如图5所示)。
采用峰浓度比(Ce)和相对摄取率(Re)两个指标来考察MPS-NSSLs-SPANb与MPS-NSSLs在大鼠体内各组织器官的靶向情况。
Ce＝(Cp)c/(Cp)s
式中Cp为药物峰值；c表示注射MPS-NSSLs-SPANb或MPS-NSSLs后某一器官组织内的药物分布情况；s表示注射甲强龙琥珀酸钠后在上述相同器官组织内的药物分布情况。每个器官或组织的Ce值表明药物分布的差异性，Ce值愈大，表明药物分布差别越大。
Re＝(AUCi)c/(AUCi)s
式中AUCi是采用OringinPro由浓度-时间曲线计算得第i个器官或组织的药时曲线下面积。Re﹥1表示在该器官或组织具有靶向性，Re越大靶向效果越好；Re﹤1表示在该器官或组织无靶向性。
结果显示(如表2、3，图6所示)，MPS-NSSLs-SPANb在肺表现出明显的靶向性。以峰浓度比(Ce)和相对摄取率(Re)两个指标来考察，注射MPS-NSSLs-SPANb后肺脏甲强龙琥珀酸钠的峰浓度为注射MPS注射液的4.58倍(Ce＝4.58)；12h药时曲线下面积(AUC0-12h)为注射MPS注射液组的17.78倍(Re＝17.78)。由于肝、脾的吞噬作用，MPS-NSSLs-SPANb、MPS-NSSLs在肝、脾中亦有一定程度的富集，但MPS-NSSLs-SPANb组甲强龙琥珀酸钠在肝、脾的聚集较MPS-NSSLs组减少。在心脏、肾脏MPS-NSSLs-SPANb组Re、Ce均小于1，无靶向性。
表2 血浆和组织中MPS的AUC0-12h和峰浓度(Cmax)
注：AUC0-12h，12h药-时曲线下面积
表3 MPS-NSSLs与MPS-NSSLs-SPANb的组织靶向性评价
注：Re，相对摄取率；Ce，峰浓度比
6、小动物活体成像实时观测MPS-NSSLs-SPANb体内代谢情况
选取2周龄裸鼠5只，分为5组，以FITC标记的SP-A纳米抗体(SPANb-FITC)为阳性对照组，以肺靶向甲强龙脂质体(MPS-NSSLs-SPANb-FITC)、单纯肺靶向脂质体未载药(NSSLs-SPANb-FITC)为实验组，设定未偶联SP-A纳米抗体的MPS-NSSLs-NBD，NSSLs-NBD为阴性对照组。经腹腔麻醉后，阳性对照组尾静脉注射100μL SPANb-FITC(荧光蛋白剂量为1mg/kg)，实验组分别注射等量的MPS-NSSLs-SPANb-FITC、NSSLs-SPANb-FITC，阴性对照组分别注射等量的MPS-NSSLs-NBD，NSSLs-NBD，注射后立即开始记时，于注射后15min，1h，3h，6h，8h显像观察其在裸鼠体内分布情况，同时，用小动物活体成像仪进行实时观测分析。
虽然本实验使用的SP-A纳米抗体为大鼠SP-A纳米抗体，但由于大鼠与裸鼠的SP-A氨基酸序列存在高度的同源性(95％)，且裸鼠便于活体成像仪进行显像观察，故实验动物选用裸鼠作为实验动物。如图7，结果表明，经尾静脉注入FITC标记的MPS-NSSLs-SPANb、NSSLs-SPANb后15min开始，即出现明显的肺部聚集，即使在注射后6h，仍可见明显的肺部浓聚影像，且未见肺靶向脂质体在其它脏器的明显浓聚，载药前后二者代谢情况无明显差异。
7、MPS-NSSLs-SPANb对大鼠肺损伤的疗效及安全性验证
雄性SD大鼠60只，体重(98.8±5.0)g，随机分为6组：(1)A组：正常剂量MPS-NSSLs-SPANb治疗ALI组；(2)B组：低剂量MPS-NSSN-SPANb治疗ALI组；(3)C组：MPS-NSSLs治疗ALI组；(4)D组：MPS治疗ALI组；(5)E组：ALI未干预组；(6)F组：正常对照组。每一组再分为两个亚组：干预1周、干预2周亚组，各5只。
A、B、C、D、E组采用气管内注入博莱霉素建立肺损伤动物模型。博莱霉素5mg/kg气管内给药。F组按上述方法气管内注入等量生理盐水。造模后A组每日经鼠尾静脉注射MPS-NSSLs-SPANb 1次(按MPS 1mg/kg体重计)；B组每日经鼠尾静脉注射MPS-NSSLs-SPANb 1次(按MPS 0.5mg/kg体重计)；C组每日经尾静脉注射MPS-NSSLs1次(按MPS 1mg/kg体重计)；D组每日注射MPS 1次(按MPS 1mg/kg体重计)；E组、F组注射等量生理盐水。
干预完成后，分别对各组大鼠肺组织病理学、支气管肺泡灌洗液BALF中的炎症因子(TNF-α、IL-8、TGF-β1等)及肺组织内炎症因子NF-kB的表达情况进行检测，以验证各组大鼠肺损伤的治疗情况，同时对各组大鼠的肝、肾功能进行检测，对各组药物治疗肺损伤的安全性进行评价。
另取60只SD大鼠，分组和处理方法同上，饲养在有菌环境中，以对其肺泡灌洗液BALF进行细菌、真菌培养。
考察动物存活率时，取SD大鼠72只，体重(99±5)g，随机分为6组，分组同上，A、B、C、D、E组博莱霉素10mg/kg气管内给药制作肺损伤模型。每组干预2周，干预方法同上。不设终点，比较各组存活率差异。
结果表明，如图8，博莱霉素造模1周后，未干预组(E组)肺脏炎症反应明显，肺泡壁增厚，肺泡结构破坏，有大量炎细胞浸润，间隔增宽，可及大面积肺实变。各组大鼠的病理组织图片结果显示，在注射MPS治疗后炎症反应有所减轻，但注射MPS-NSSLs-SPANb大鼠(A组、B组)肺损伤改善更为明显。将肺损伤严重程度进行评分，评分的统计学结果显示(表4)，治疗1周后，注射正常剂量MPS-NSSLs-SPANb组(A组)较E组炎症程度减轻(p<0.05)，注射低剂量MPS-NSSLs-SPANb组(B组)、MPS-NSSLs组(C组)、MPS组(D组)较E组炎症程度有减轻，但结果无统计学差异(p<0.05)；
治疗2周后，未干预组(E组)肺损伤仍然严重，各组(A组、B组、C组、D组)经过2周的治疗后炎症程度均较未干预组(E组)有改善(p<0.05)。其中，注射MPS治疗组(D组)肺损伤较治疗1周时无明显改善，注射低剂量MPS-NSSLs-SPANb组(B组)、MPS-NSSLs组(C组)组的炎症情况则较治疗1周时有明显的持续减轻。
表4 各组大鼠肺损伤严重程度的病理评分
*vs Group E：p<0.05
A组：正常剂量MPS-NSSLs-SPANb治疗组；B组：低剂量MPS-NSSLs-SPANb治疗组；C组：MPS-NSSLs治疗组；D组：MPS治疗组；E组：ALI未干预组；F组：正常对照组
肺泡灌洗液BALF中各细胞因子的测定结果显示(如图9，10，11)，E组大鼠在博莱霉素造模干预1周后，BALF中TNF-α、IL-8、TGF-β1水平均较对照组(F组)显著升高(p<0.05)；造模干预2周后三者水平较1周时均有所下降；
干预2周后，A、B、C、D、E组中IL-8水平较干预1周后均进一步降低，其中，干预1周、2周后，A组IL-8水平明显低于C、D、E组(p<0.05)，B组IL-8水平较D组、E组亦显著降低(p<0.05)；
干预1周后，A组、B组TGF-β1水平与D组比较无显著降低，但较未干预组E组有降低(p<0.05)；治疗2周后A组、B组TGF-β1水平较D组、E组均有明显降低(p<0.05)。A组与B组之间比较未见显著差异。
干预1周后，A组TNF-α水平较C组、E组显著降低(p<0.05)，B组较C组、D组、E组均有显著降低(p<0.05)，干预2周后，A、B两组水平较B、C、D组水平均有显著降低(p<0.05)。A、B两组之间比较未见显著差异。
大鼠肺组织NF-kB的mRNA相对表达量结果(如图12)显示：造模干预1周后，未干预组(E组)NF-kB mRNA表达量较正常对照组显著增高(p<0.01)，A组NF-kB mRNA表达量较C、D、E三组均显著降低(p<0.05)，B组NF-kB mRNA相对表达量明显低于D组及E组；造模干预2周后A组仍明显低于C、D、E组(p<0.05)，B组则较E组显著降低(p<0.05)，较C组、D组无明显差异。
肺泡灌洗液BALF细菌培养结果提示，干预1周后，注射MPS-NSSLs组(C组)见3例表皮葡萄球菌生长。干预2周后，注射MPS-NSSLs组(C组)见1例表皮葡萄球菌、1例大肠杆菌生长；注射MPS组(D组)见1例表皮葡萄球菌、1例彭氏变形杆菌生长。其余各组(包括干预1周、2周)细菌及真菌培养均为阴性。
大鼠在博莱霉素10mg/kg气管内给药制作肺损伤模型后，分组进行干预2周，同时观察10周，各组大鼠生存曲线见图13，各组生存率如表格5所示，10周后，A组存活率显著高于E组(p<0.05)；B、C、D组与E组比较存活率有升高，但均无显著性差异(p>0.05)；A、B、C、D组之间两两比较存活率，亦无显著性差异。
表5 各组大鼠10w后的存活率
*vs E组，p<0.05
A组：正常剂量MPS-NSSLs-SPANb治疗组；B组：低剂量MPS-NSSLs-SPANb治疗组；C组：MPS-NSSLs治疗组；D组：MPS治疗组；E组：ALI未干预组；F组：正常对照组。
实验结果表明，本发明制得的大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs-SPANb)的优点有：
具有明确肺靶向性，且高效、稳定，能实现甲强龙琥珀酸钠对肺部的靶向输送，使肺脏中MPS峰浓度较常规制剂提高4.58倍，12h药-时曲线下面积提高17.78倍，治疗大鼠肺损伤模型时可以有效减少肺泡灌洗液及肺组织内炎症因子的表达，减轻肺组织病理损伤，提高大鼠存活率，具有高效、低毒、减少糖皮质激素用药剂量、提高对肺部疾病的疗效的作用，同时又减少全身不良反应。
本发明还提供了一种上述所述的具有大鼠肺主动靶向性的甲强龙免疫纳米脂质体在治疗肺部疾病的药物中的应用。
其中，所述的肺部疾病包括支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病、肺血管炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征或结节病。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的具有肺主动靶向性的免疫脂质体进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs)、大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙免疫纳米脂质体(MPS-NSSLs-SPANb)即时冷冻透射电镜下的形态观察照片
图2合成DSPE-PEG3400-Iodoacetate的方法及其与大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体His标签偶联的基本原理图
图3大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体与甲强龙纳米脂质体偶联成功的验证
图4大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体与肺表面活性蛋白A结合活性的ELISA验证
图5静脉注射MPS、MPS-NSSLs与MPS-NSSLs-SPANb后血浆及各组织中甲强龙琥珀酸钠的浓度分布。
图6肺组织中MPS的12h药时曲线下面积
图7不同药物的小动物活体成像
图8分组干预后各组大鼠肺组织病理损伤情况
其中，MPS：甲强龙琥珀酸钠注射液；
MPS-NSSLs：甲强龙纳米脂质体；
MPS-NSSLs-SPANb：大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体；
A组：正常剂量MPS-NSSLs-SPANb治疗组；B组：低剂量MPS-NSSLs-SPANb治疗组；C组：MPS-NSSLs治疗组；D组：MPS治疗组；E组：ALI未干预组；F组：正常对照组。
图9分组干预1周、2周后各组大鼠BALF中IL-8水平(ng/L)
图10分组干预1周、2周后各组大鼠BALF中TGF-β水平(ng/L)
图11分组干预1周、2周后各组大鼠BALF中TNF-α水平(ng/L)
图12分组干预1周、2周后各组大鼠肺组织mRNA相对表达量
图13各组大鼠生存曲线
具体实施方式
实施例1
1、制备甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs)
采用超声薄膜分散法制备甲强龙纳米脂质体。称取二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、DSPE-PEG2000(DSPE-PEG2000)(各组分摩尔比为20：14.5：1.8)，以三氯甲烷/甲醇(体积比为2：1)溶解，置于圆底玻璃试管中，使用氮气吹干在管底成膜，室温下真空干燥过夜，去除有机溶剂。向膜内加入200mM的醋酸钙溶液，65℃下水浴超声30分钟，超声功率200w。将超声后的水化液依次在高压均质机( Mini-Extruder)内依次通过0.4μm、0.2μm、0.1μm的滤膜，每个层级推挤13-17次，即可得脂质体混悬液。再将所得脂质体混悬液置入截留分子量为3kDa的透析管中透析过液,将脂质体外的溶液替换为0.9％的生理盐水，使pH脂质体内<pH脂质体外。称取处方量甲强龙琥珀酸钠(MPS)溶于0.9％生理盐水，配置成摩尔浓度4.2mM的MPS溶液，与上述脂质体混悬液混合(磷脂浓度为14.3mM)，70℃水浴加热1小时，4℃存放。取载药脂质体混悬液，通过凝胶过滤柱(Superose 12 10/300GL)去除游离MPS。
2、甲强龙纳米脂质体的表征
1)形态观察：
取脂质体悬液适量，经液氮速冻，通过即时冷冻透射电镜(cryo-TEM)观察其形态。可见脂质体呈球形，外观圆滑光整，大小均一。
2)粒径测定:
脂质体悬液适量以蒸馏水适当稀释后于25℃下经激光粒径测定仪测定其粒径分布。甲强龙纳米脂质体平均粒径为98.1±0.5nm。
3)包封率测定：
使用高效液相色谱仪测定甲强龙琥珀酸钠的浓度。甲强龙琥珀酸钠在1～200μg·ml-1范围内其浓度(X)与峰面积比(Y)构成良好的线性关系，标准曲线Y＝17618.1X+15992.2,相关系数R2＝0.9972。甲强龙纳米脂质体对甲强龙琥珀酸钠的包封率为91.4±0.6％。
3、制备大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs-SPANb)
首先将脂质体表面的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)末端添加醋酸碘功能基团，再利用醋酸碘与大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体His标签中的咪唑基进行反应偶联。其中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)末端添加醋酸碘功能基团是通过将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH2)与碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SIA)进行反应来实现的。
首先将DSPE-PEG3400-NH2与SIA按照摩尔浓度1：150溶于三氯甲烷溶液，常温下避光反应过夜。反应完成后使用PD-10脱盐柱将过量的SIA去除，即可得纯化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-醋酸碘(DSPE-PEG3400-Iodoacetate)。
采用超声薄膜分散法将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、制备出的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-醋酸碘(DSPE-PEG3400-Iodoacetate)带有乙酸碘功能基团的甲强龙纳米脂质体。制备过程同制备甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs)。
将纯化后的带乙酸碘功能基团的甲强龙纳米脂质体与肺表面活性蛋白A的纳米抗体混合(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-醋酸碘与肺表面活性蛋白A的纳米抗体的反应摩尔浓度比60：1)，混匀后4℃放置过夜。同样使用凝胶过滤法(Superose 12 10/300GL)去除过量的药物与纳米抗体。
1)形态观察：
取脂质体悬液适量，经液氮速冻，通过即时冷冻透射电镜(cryo-TEM)观察其形态。可见脂质体呈球形，外观圆滑光整，大小均一。
2)粒径测定:
脂质体悬液适量以蒸馏水适当稀释后于25℃下经激光粒径测定仪测定其粒径分布。大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体平均粒径为105.8±0.8nm；
3)包封率测定：
使用高效液相色谱仪测定甲强龙琥珀酸钠的浓度。甲强龙琥珀酸钠在1～200μg·ml-1范围内其浓度(X)与峰面积比(Y)构成良好的线性关系，标准曲线Y＝17618.1X+15992.2,相关系数R2＝0.9972。大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体对甲强龙琥珀酸钠的包封率为92.5±0.3％；
4)稳定性考察：
大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体在4℃下存放12周，脂质体对甲强龙琥珀酸钠的包封率无显著性变化(p﹥0.05)，样品放置稳定。
5)大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体与甲强龙纳米脂质体偶联成功的验证
将大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,得出肺表面活性蛋白A在原始分子量上增加了脂质体的分子量大小，表明甲强龙纳米脂质体与肺泡表面活性蛋白A偶联成功,经ImageJ灰度分析，肺泡表面活性蛋白A的连接效率为35.59±2.37％。
6)大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体的活性验证
将纯化后的大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体与肺泡表面活性蛋白A抗原进行ELISA检测，大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体较单纯甲强龙纳米脂质体，具有与肺泡表面活性蛋白A抗原的结合活性，p<0.05；较肺泡表面活性蛋白A纳米抗体，与肺泡表面活性蛋白A抗原的结合活性无差异，p>0.05。
实施例2
大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体的组织靶向性实验
MPS-NSSLs-SPANb组织靶向性实验
健康雄性SD大鼠105只，体重(102±8)g，随机分为3组：大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙免疫纳米脂质体(MPS-NSSLs-SPANb)组、甲强龙纳米脂质体(MPS-NSSLs)组和甲强龙(MPS)组。三组分别经鼠尾静脉注射MPS-NSSLs-SPANb、MPS-NSSLs、MPS注射液(按甲强龙琥珀酸钠2mg/Kg体重计)。以给药后15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h为时间点。在每个时间点三组各取大鼠5只，异氟烷麻醉后眼眶取血，EDTA抗凝，离心后分离血浆。取血后迅速处死大鼠，取心、肝、脾、肺、肾等组织，生理盐水冲洗，滤纸吸干，精密称重。血浆及各组织-20℃保存备测。使用高效液相色谱仪，测定血浆及组织中甲强龙琥珀酸钠(MPS)浓度。
结果显示，注射MPS-NSSLs-SPANb与MPS-NSSLs的血液循环时间较MPS注射液的延长，血药浓度提高。注射后在各取样点，MPS-NSSLs-SPANb的血药浓度均高于MPS组(p﹤0.05)；在各取样点，MPS-NSSLs-SPANb在肺组织中MPS的浓度明显高于MPS组(p﹤0.01)，在15min、30min、1、2、4、8h,MPS-NSSLs组在肺脏中甲强龙琥珀酸钠浓度亦显著高于MPS组(p﹤0.01)，以MPS-NSSLs-SPANb组升高更为明显。MPS-NSSLs-SPANb组、MPS-NSSLs组在肝、脾中甲强龙琥珀酸钠浓度有增高的趋势，但以MPS-NSSLs组增高更明显。在1、2h时间点上，MPS-NSSLs-SPANb组在肾脏中的药物分布显著低于的MPS组(p﹤0.01)，但在8h则稍高于甲强龙组(p﹥0.05)。三组制剂在心脏中的甲强龙琥珀酸钠浓度无明显差异(p﹥0.05)。
采用峰浓度比(Ce)和相对摄取率(Re)两个指标来考察MPS-NSSLs-SPANb与MPS-NSSLs在大鼠体内各组织器官的靶向情况。
Ce＝(Cp)c/(Cp)s
式中Cp为药物峰值；c表示注射MPS-NSSLs-SPANb或MPS-NSSLs后某一器官组织内的药物分布情况；s表示注射甲强龙琥珀酸钠后在上述相同器官组织内的药物分布情况。每个器官或组织的Ce值表明药物分布的差异性，Ce值愈大，表明药物分布差别越大。
Re＝(AUCi)c/(AUCi)s
式中AUCi是采用OringinPro由浓度-时间曲线计算得第i个器官或组织的药时曲线下面积。Re﹥1表示在该器官或组织具有靶向性，Re越大靶向效果越好；Re﹤1表示在该器官或组织无靶向性。
结果显示，MPS-NSSLs-SPANb在肺表现出明显的靶向性。以峰浓度比(Ce)和相对摄取率(Re)两个指标来考察，注射MPS-NSSLs-SPANb后肺脏甲强龙琥珀酸钠的峰浓度为注射MPS注射液的4.58倍(Ce＝4.58)；12h药时曲线下面积(AUC0-12h)为注射MPS注射液的17.78倍(Re＝17.78)。由于肝、脾的吞噬作用，MPS-NSSLs-SPANb、MPS-NSSLs在肝、脾中亦有一定程度的富集，但MPS-NSSLs-SPANb组甲强龙琥珀酸钠在肝、脾的聚集较MPS-NSSLs组减少。在心脏、肾脏MPS-NSSLs-SPANb组Re、Ce均小于1，无靶向性。
结果表明，本发明的大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙免疫纳米脂质体具有明确肺靶向性，且高效、稳定，能实现甲强龙琥珀酸钠对肺部的靶向输送，使肺脏中MPS峰浓度较常规制剂提高4.58倍，12h药时曲线下面积提高17.78倍，能达到减少糖皮质激素用药剂量、提高对肺部疾病的疗效，同时又减少全身不良反应的目的。
小动物活体成像实时观测MPS-NSSLs-SPANb体内代谢情况
选取2周龄裸鼠5只，分为5组，以FITC标记的SP-A纳米抗体(SPANb-FITC)为阳性对照组，以肺靶向甲强龙脂质体(MPS-NSSLs-SPANb-FITC)、单纯肺靶向脂质体未载药(NSSLs-SPANb-FITC)为实验组，设定未偶联SP-A纳米抗体的MPS-NSSLs-NBD，NSSLs-NBD为阴性对照组。经腹腔麻醉后，阳性对照组尾静脉注射100μL SPANb-FITC(荧光蛋白剂量为1mg/kg)，实验组分别注射等量的MPS-NSSLs-SPANb-FITC、NSSLs-SPANb-FITC，阴性对照组分别注射等量的MPS-NSSLs-NBD，NSSLs-NBD，注射后立即开始记时，于注射后15min，1h，3h，6h，8h显像观察其在裸鼠体内分布情况，同时，用小动物活体成像仪进行实时观测分析。
虽然本实验使用的SP-A纳米抗体为大鼠SP-A纳米抗体，但由于大鼠与裸鼠的SP-A氨基酸序列存在高度的同源性(95％)，且裸鼠便于活体成像仪进行显像观察，故实验动物选用裸鼠作为实验动物。结果表明，经尾静脉注入FITC标记的MPS-NSSLs-SPANb、NSSLs-SPANb后15min开始，即出现明显的肺部聚集，即使在注射后6h，仍可见明显的肺部浓聚影像，且未见肺靶向脂质体在其它脏器的明显浓聚，载药前后二者代谢情况无明显差异。
实施例3
大鼠肺表面活性蛋白A纳米抗体偶联甲强龙纳米脂质体治疗大鼠肺损伤实验
雄性SD大鼠60只，体重(98±5)g，随机分为6组：1)A组：正常剂量MPS-NSSLs-SPANb治疗ALI组；2)B组：低剂量MPS-NSSLs-SPANb治疗ALI组；3)C组：MPS-NSSLs治疗ALI组；4)D组：MPS治疗ALI组；5)E组：ALI未干预组；6)F组：正常对照组。每一组再分为两个亚组，分别干预1周、干预2周，每亚组各5只大鼠。A、B、C、D、E组采用气管内注入盐酸博莱霉素建立肺损伤动物模型。博莱霉素按照5mg/kg使用大鼠喉镜进行气管内给药。F组按相同方法于气管内注入等量生理盐水。造模后A组每日经鼠尾静脉注射MPS-NSSLs-SPANb 1次(按MPS 1mg/kg体重计)；B组每日经鼠尾静脉注射MPS-NSSLs-SPANb 1次(按MPS 0.5mg/kg体重计)；C组每日经尾静脉注射MPS-NSSLs1次(按MPS 1mg/kg体重计)；D组每日注射MPS 1次(按MPS 1mg/kg体重计)；E组、F组注射等量生理盐水。
干预完成后，分别对各组大鼠肺组织病理学、支气管肺泡灌洗液BALF中的炎症因子(TNF-α、IL-8、TGF-β1等)及肺组织内炎症因子NF-kB的表达情况进行检测，以验证各组大鼠肺损伤的治疗情况，同时对各组大鼠的肝、肾功能进行检测，对各组药物治疗肺损伤的安全性进行评价。
另取60只SD大鼠，分组和处理方法同上，饲养在有菌环境中，以对其肺泡灌洗液BALF进行细菌、真菌培养。
考察动物存活率时，取SD大鼠72只，体重(99±5)g，随机分为6组，分组同上，A、B、C、D、E组博莱霉素10mg/kg气管内给药制作肺损伤模型。每组干预2周，干预方法同上。不设终点，比较各组存活率差异。
肺组织病理标本HE染色结果显示，博莱霉素造模1周后，未干预组(E组)肺脏炎症反应明显，肺泡壁增厚，肺泡结构破坏，有大量炎细胞浸润，间隔增宽，可及大面积肺实变。各组大鼠的病理组织图片结果显示，在注射MPS治疗后炎症反应有所减轻，但注射MPS-NSSLs-SPANb大鼠(A组、B组)肺损伤改善更为明显。将肺损伤严重程度进行评分，评分的统计学结果显示，治疗1周后，注射正常剂量MPS-NSSLs-SPANb组(A组)较E组炎症程度减轻(p<0.05)，注射低剂量MPS-NSSLs-SPANb组(B组)、MPS-NSSLs组(C组)、MPS组(D组)较E组炎症程度有减轻，但结果无统计学差异(p<0.05)；
治疗2周后，未干预组(E组)肺损伤仍然严重，各组(A组、B组、C组、D组)经过2周的治疗后炎症程度均较未干预组(E组)有改善(p<0.05)。其中，注射MPS治疗组(D组)肺损伤较治疗1周时无明显改善，注射低剂量MPS-NSSLs-SPANb组(B组)、MPS-NSSLs组的(C组)炎症情况则较治疗1周时有明显的持续减轻。
结果表明，博莱霉素造模1周后，未干预组(E组)肺脏炎症反应明显，肺泡壁增厚，肺泡结构破坏，有大量炎细胞浸润，间隔增宽，可及大面积肺实变。各组大鼠的病理组织图片结果显示，在注射MPS治疗后炎症反应有所减轻，但注射MPS-NSSLs-SPANb大鼠(A组、B组)肺损伤改善更为明显。将肺损伤严重程度进行评分，评分的统计学结果显示，治疗1周后，注射正常剂量MPS-NSSLs-SPANb组(A组)较E组炎症程度减轻(p<0.05)，注射低剂量MPS-NSSLs-SPANb组(B组)、MPS-NSSLs组(C组)、MPS组(D组)较E组炎症程度有减轻，但结果无统计学差异(p<0.05)；
治疗2周后，未干预组(E组)肺损伤仍然严重，各组(A组、B组、C组、D组)经过2周的治疗后炎症程度均较未干预组(E组)有改善(p<0.05)。其中，注射MPS治疗组(D组)肺损伤较治疗1周时无明显改善，注射低剂量MPS-NSSLs-SPANb组(B组)、MPS-NSSLs组(C组)组的炎症情况则较治疗1周时有明显的持续减轻。
肺泡灌洗液BALF中各细胞因子的测定结果显示，E组大鼠在博莱霉素造模干预1周后，BALF中TNF-α、IL-8、TGF-β1水平均较对照组(F组)显著升高(p<0.05)；造模干预2周后三者水平较1周时均有所下降；
干预2周后，A、B、C、D、E组中IL-8水平较干预1周后均进一步降低，其中，干预1周、2周后，A组IL-8水平明显低于C、D、E组(p<0.05)，B组IL-8水平较D组、E组亦显著降低(p<0.05)；
干预1周后，A组、B组TGF-β1水平与D组比较无显著降低，但较未干预组E组有降低(p<0.05)；治疗2周后A组、B组TGF-β1水平较D组、E组均有明显降低(p<0.05)。A组与B组之间比较未见显著差异。
干预1周后，A组TNF-α水平较C组、E组显著降低(p<0.05)，B组较C组、D组、E组均有显著降低(p<0.05)，干预2周后，A、B两组水平较B、C、D组水平均有显著降低(p<0.05)。A、B两组之间比较未见显著差异。
大鼠肺组织NF-kB的mRNA相对表达量结果显示：造模干预1周后，未干预组(E组)NF-kB mRNA表达量较正常对照组显著增高(p<0.01)，A组NF-kB mRNA表达量较C、D、E三组均显著降低(p<0.05)，B组NF-kB mRNA相对表达量明显低于D组及E组；造模干预2周后A组仍明显低于C、D、E组(p<0.05)，B组则较E组显著降低(p<0.05)，较C组、D组无明显差异。
肺泡灌洗液BALF细菌培养结果提示，干预1周后，注射MPS-NSSLs组(C组)见3例表皮葡萄球菌生长。干预2周后，注射MPS-NSSLs组(C组)见1例表皮葡萄球菌、1例大肠杆菌生长；注射MPS组(D组)见1例表皮葡萄球菌、1例彭氏变形杆菌生长。其余各组(包括干预1周、2周)细菌及真菌培养均为阴性。
大鼠在博莱霉素10mg/kg气管内给药制作肺损伤模型后，分组进行干预2周，同时观察10周，各组大鼠生存状况提示，10周后，A组存活率显著高于E组(p<0.05)；B、C、D组与E组比较存活率有升高，但均无显著性差异(p>0.05)；A、B、C、D组之间两两比较存活率，亦无显著性差异。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。