本发明涉及释放一氧化氮的伤口(wound)处理膜及其制备方法，该膜抑制作为伤口感染主要原因的病原体，并能迅速对伤口进行处理。
背景技术：
：覆盖我们身体外侧的皮肤被暴露于来自日常生活的各种危险和物理伤害中。因此，我们周围的多种因素通过机械伤害、擦伤、烧伤等造成损伤，如皮肤伤口。伤口是指人体组织的解剖学连续性已通过外部作用而失去其原有连续性的状态。我们的皮肤由真皮、表皮和皮下脂肪组成，例如，这些真皮或表皮以及皮下脂肪等通过外部损伤(如割伤或跌倒)而失去其连续性并受伤。通常，使用伤口敷料来有效地对皮肤伤口(如伤口或外伤)进行处理。伤口敷料的要求是：在与伤口接触的表面保持适当湿度的能力；伤口分泌物的控制能力；伤口敷料易于附着和去除；伤口和周围环境之间空气和水蒸气的渗透性；伤口的外部隔热；抵抗细菌入侵；在人体内无毒；以及良好的机械性能。软膏的使用是最流行的伤口愈合方法，其包括Madecassol(DongkukPharmaceutical)、-S(SamjinPharmCo.,Ltd.)和Tinadex(ChongKunDangPharm.)。本发明的现有技术公开于韩国专利公开号2002-0066024中。技术实现要素：技术问题本发明的目的是提供释放一氧化氮的伤口处理膜及其制备方法，该膜包含在人体内自发形成一氧化氮供体的S-亚硝基谷胱甘肽。技术方案为了实现本发明的目的，本发明的一方面提供了释放一氧化氮的伤口处理膜，该膜包含包封在聚合物中的一氧化氮供体。此外，所述一氧化氮供体可选自于由S-亚硝基谷胱甘肽、二醇二氮烯鎓(diazeniumdiolate)、有机硝酸盐/酯和铁-亚硝酰基配合物所组成的组。另外，所述聚合物可以是选自于由壳聚糖、硅酮(silicone)、聚氨酯和海藻酸钙所组成的组中的生物相容性聚合物。另外，在100wt％的所述膜中，可包含2.5wt％-30wt％的一氧化氮供体。本发明的另一方面提供了制备释放一氧化氮的伤口处理膜的方法，该方法包括：通过将聚合物溶解在溶剂中、调节pH并添加增塑剂来制备聚合物溶液；通过将一氧化氮供体添加并混合到聚合物溶液中来制备反应混合物；以及将反应混合物浇铸成膜的形式，并将其在除湿暗室中干燥。此外，所述一氧化氮供体可选自于由S-亚硝基谷胱甘肽、二醇二氮烯鎓、有机硝酸盐/酯和铁-亚硝酰基配合物所组成的组。另外，所述聚合物可选自于由壳聚糖、硅酮、聚氨酯和海藻酸钙所组成的组。另外，所述增塑剂可选自于由聚乙二醇、山梨醇和甘油所组成的组。此外，可通过使用0.1M乙酸缓冲溶液将pH4.0调节至pH6.0来制备聚合物溶液。可将2.5重量份-30重量份的一氧化氮供体添加到100重量份的聚合物溶液中。所述干燥可在25℃-37℃的温度下进行1天至2天。有益效果根据本发明，包含在人体内自发形成一氧化氮供体的S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)的释放一氧化氮的伤口处理膜具有能够使其被施用到人体的机械特性，其缓慢释放一氧化氮并抑制作为伤口感染的主要原因的病原体，并能迅速愈合伤口，因此可将该膜用于对伤口进行处理。附图说明图1阐明了由扫描电子显微镜(SEM)分析测定的(a)壳聚糖膜和(b)GSNO膜的表面形貌。图2是GSNO膜(10)、壳聚糖膜(B)、壳聚糖(C)、GSNO(G)以及GSNO和壳聚糖的混合物(GC)的热性能。图3是GSNO膜的NO释放曲线。图4是释放NO的膜对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性和抗菌功效。图5是经释放NO的膜处理的伤口随处理时间而变化的代表性照片。图6是经释放NO的膜处理的伤口的尺寸减小曲线。图7是经释放NO的膜处理的伤口的上皮化率(epithelializationrate)曲线。图8是经释放NO的膜处理的伤口的代表性组织病理学概况(A-C：纱布对照；D-F：NO0mg；G-I：NO10mg)。具体实施方式通过溶剂蒸发法来制备释放NO的膜。将壳聚糖溶解在丙酮缓冲液(100mM)中，用乙酸将溶液的pH调节至4.4。将甘油加至壳聚糖溶液，以达到1％(w/w)的终浓度。将10mgGSNO加至该溶液并搅拌20分钟。将所得溶液浇铸在有盖培养皿中，并用装配有除湿器的干燥器在37℃下于暗室中干燥2天。将所制备的膜(以下称为“CS/NO膜”)在7℃、真空下储存。此时，制备不含GSNO的空白(blank)膜作为对照组。特别地，膜的干燥在除湿条件下的暗室中进行以促进蒸发，可获得一氧化氮供体载药率(loadingefficiency)为47％的微红透明均匀膜，而在不具备除湿条件的干燥箱中进行干燥显示出20％以下的载药率。同时，为了比较体内伤口愈合效果，将除壳聚糖以外的另一聚合物聚乙烯醇(polyvinylalcohol；PVA，SigmaAdlrich，MO，USA)用作载体，通过加热来制备1％(w/w)的PVA溶液，按照与CS/NO膜相同的方式制备膜(以下称为“PVA/NO膜”)。下文对本发明进行更详细的说明。本发明的发明人证实了包含在人体内自发形成一氧化氮供体的S-亚硝基谷胱甘肽的释放一氧化氮的伤口处理膜具有能够使其被施用到人体的机械特性，其缓慢释放一氧化氮并抑制作为伤口感染的主要原因的病原体，并能迅速愈合伤口，因此可将该膜用于对伤口进行处理，从而完成了本发明。因此，本发明提供了一种释放一氧化氮的伤口处理膜，该膜包含包封在聚合物中的一氧化氮供体。所述一氧化氮供体可选自于由S-亚硝基谷胱甘肽、二醇二氮烯鎓、有机硝酸盐/酯和铁-亚硝酰基配合物所组成的组，特别地，所述一氧化氮供体优选为S-亚硝基谷胱甘肽，这是因为S-亚硝基谷胱甘肽无害地自发形成于人体内，并在制造和储存过程中具有优异的稳定性。所述聚合物可以是选自于由壳聚糖、硅酮、聚氨酯和海藻酸钙所组成的组中的生物相容性聚合物，所述聚合物优选壳聚糖，这是因为壳聚糖通过自身吸收伤口分泌物并保持伤口表面周围湿润来愈合伤口。在100wt％的所述膜中，可包含2.5wt％-30wt％的一氧化氮供体。一氧化氮供体是在与聚合物溶液混合并干燥后释放一氧化氮(以下称为“NO”)的材料。如果添加的一氧化氮供体少于2.5wt％，则NO释放量低，伤口愈合效果下降，并且无法持续释放NO；如果添加的一氧化氮供体大于30wt％，则伤口处理膜的整体生产效率降低，并且还降低了机械性能和稳定性。另外，本发明提供了通过溶剂蒸发法制备释放NO的伤口处理膜的方法。具体而言，该方法包括：通过将聚合物溶解在溶剂中、调节pH并添加增塑剂来制备聚合物溶液；通过将一氧化氮供体添加并混合到聚合物溶液中来制备反应混合物；以及将反应混合物浇铸成膜的形式，并将其在除湿暗室中干燥。根据本发明的一个实施方式，该方法包括：通过将诸如壳聚糖的聚合物溶解在溶剂中、通过酸化剂调节pH并添加甘油来制备聚合物溶液；通过将诸如S-亚硝基谷胱甘肽(以下称为“GSNO”)的一氧化氮供体添加到聚合物溶液中并搅拌来制备反应混合物；以及将反应混合物浇铸成膜的形式，并将其在除湿暗室中干燥。可通过使用0.1M乙酸缓冲溶液将pH4.0调节至pH6.0来制备聚合物溶液。如果通过弱酸对聚合物溶液的pH进行调节并将一氧化氮供体混合，则可将GSNO均匀地混合在聚合物溶液中，不会影响GSNO的稳定性。所述增塑剂可选自于由聚乙二醇、山梨醇和甘油所组成的组，其中，甘油可通过提高伤口处理膜的可用性(availability)来提高机械性能。可将2.5重量份-30重量份的一氧化氮供体添加到100重量份的聚合物溶液中，搅拌可进行10分钟至60分钟、优选进行20分钟。如果一氧化氮供体的量超过该范围，则发生相分离，引起外观问题并降低机械性能。所述干燥可在25℃-37℃的温度下进行1天至2天。如果干燥温度超出上述范围，则可引起膜透明度问题和GSNO稳定性问题。特别地，在除湿条件下的暗室中干燥浇铸的膜显示出47％的一氧化氮供体载药率；另一方面，在不除湿条件下进行干燥造成了一氧化氮供体载药率至多为20％的问题。下文将根据以下实施例对本发明进行更为详细的说明。然而，这些实施例对本发明并不是限制性的。实施例<实施例1>GSNO的合成如前所述(TetrahedronLett，1985；26：2013-2016)合成GSNO。简言之，将1.005g还原型L-谷胱甘肽(SigmaAdlrich，MO，USA)在4℃下溶解于2MHCl(Daejung)中，以产生终浓度为0.625mM的溶液。将220.6mg亚硝酸钠(SigmaAdlrich，MO，USA)加至该溶液，并将混合物置于冰浴中搅拌30分钟。用80％冷丙酮对最终溶液进行沉淀40分钟，并另外搅拌20min。将搅拌的溶液在4℃下以20,000g离心30min。将20ml冷的100％丙酮加至沉淀并离心。将20ml100％二乙醚加至所得沉淀并离心。将粉红色粉末GSNO进一步冷冻干燥24小时，并保持在-20℃直至进一步使用。<实施例2>释放NO的膜的制备通过溶剂蒸发法来制备释放NO的膜。简言之，将壳聚糖溶解在丙酮缓冲液(100mM)中，用乙酸将溶液的pH调节至4.4。将甘油加至壳聚糖溶液，以达到1％(w/w)的终浓度。将10mgGSNO加至该溶液并搅拌20分钟。将所得溶液浇铸在有盖培养皿中，并用装配有除湿器的干燥器在37℃下于暗室中干燥2天。将所制备的膜(以下称为“CS/NO膜”)在7℃、真空下储存。此时，制备不含GSNO的空白膜作为对照组。特别地，膜的干燥在除湿条件下的暗室中进行以促进蒸发，可获得一氧化氮供体载药率为47％的微红透明均匀膜，而在不具备除湿条件的干燥箱中进行干燥显示出20％以下的载药率。同时，为了比较体内伤口愈合效果，将除壳聚糖以外的另一聚合物聚乙烯醇(polyvinylalcohol；PVA，SigmaAdlrich，MO，USA)用作载体，通过加热来制备1％(w/w)的PVA溶液，按照与CS/NO膜相同的方式来制备膜(以下称为“PVA/NO膜”)。<实施例3>释放NO的膜的表征1.膜厚度使用数字式外径千分尺(BluebirdMultinationalCo.)，在五个不同的位置处(中心和四角)对实施例2中制备的膜的厚度进行测量。将厚度测量的平均值视为膜厚度。结果是，空白膜和释放NO的膜在中心和四角处的平均厚度分别为61.2±4.5μm和64.6±8.6μm，这表明GSNO的添加未改变膜的厚度。2.扫描电子显微镜(SEM)分析使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM，S4800，Hitachi，日本)对实施例2中制备的膜的表面形貌进行检查。将样品(1.5×1.5cm2)安装在双面碳带(carbontape)上，并在真空下用铂涂覆2min。在FE-SEM下以1kV-5kV的加速电压对样品进行观察。如图1所示，空白膜具有均质、光滑的表面形貌，且GSNO的掺入未改变膜的表面形貌。3.热性能使用示差扫描热量计(DSC，N-650，SCINCO，韩国)对裸(bare)GSNO、空白膜和CS/NO膜的热性能进行检查。在完全密封的铝盘中，将各样品在动态氮气气氛中以5℃/min的速率从30℃加热至200℃。如图2所示，GSNO在195℃显示强的吸热峰；与GSNO的吸热峰相比，壳聚糖显示较弱的吸热峰。然而，在CS/NO膜中GSNO熔点的峰消失，表明GSNO充分溶解并以分子水平分散于膜中。对于两种膜而言，均在低于140℃观察到宽的吸热峰；这可归因于吸收的水分从膜的蒸发。4.机械性能为了考察实施例2中制备的CS/NO膜的机械性能，使用抗张试验机(Instron3345，Norwood，MA，USA)对抗张强度(TS)和断裂伸长率百分比进行测量。首先，将膜切割成特定的狗骨形状(长80mm，宽30mm)。该试验在10mm/min的拉伸速率下进行，在试验前用卡尺对膜的厚度进行测量。由样品的初始长度(30mm)和断裂时的伸展长度之间的差值，对断裂伸长率百分比(E％)进行计算。如表1所示，NO的添加未影响断裂伸长率。与初始长度相比，空白膜被拉伸至134.4土11.5％；释放NO的膜则为约129.9±18.1％。然而，GSNO的添加降低了抗张强度和杨氏模量。[表1]抗张强度(MPa)断裂伸长率(％)杨氏模量(MPa)空白7.87±1.02134.4±11.57.18±0.53NO10mg6.53±0.70129.9±18.15.48±0.315.NO释放研究将CS/NO膜切割成相当于50mg的正方形，并在37℃下浸没于10ml磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)中。使用Griess试剂对从膜释放的NO进行分析。以预定的时间间隔将100μlPBS去除并用新鲜PBS替换。适当稀释后，以1∶1的比例添加Griess试剂。将100μl所得混合物加至96孔板的孔中，并在室温下于黑暗中放置30min。最后，使用微板读数器在540nm的波长处对亚硝酸盐的量进行测量。如图3所示，释放NO的膜的NO释放曲线显示一阶指数函数。在初始的1小时中，NO从膜的释放缓慢，然后根据线性方程完成。初始的缓慢释放可归因于膜的水合所需的时间。由于CS/NO膜需要膨胀来释放NO，NO释放的初始几小时中的滞后时间是预期的。假定CS/NO膜在伤口处理期间能够释放最足量的NO，在加载有不同剂量的GSNO的膜中，包含20wt％GSNO的CS/NO膜以持续方式在超过48小时的时间内释放了最高量的NO。6.抗菌活性分析图4是释放NO的膜对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性和抗菌功效。用于该研究的细菌菌株是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1(野生型原养型微生物，Peerson等，1997)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)RN4220(Kreiswirth等，1983)或耐甲氧西林葡萄球菌。将金黄色葡萄球菌在剧烈振荡下培养在3mlLB肉汤中，使其生长过夜。然后，将细胞接种在12孔板的盖玻片上，并在包含2μl抗生素的2mlLB肉汤培养基中于37℃下孵育。然后，将空白膜和CS/NO膜(1.3×1.3cm2)放置在玻璃盖玻片的孔上。以预定的时间间隔，将玻璃盖玻片用无菌水轻轻洗涤，以将未贴附的金黄色葡萄球菌细菌去除。在荧光显微镜下对玻璃盖玻片上的细菌进行观察。对于铜绿假单胞菌而言，将包含25μl抗生素的2ml等份的基本培养基和质粒诱导物接种在12孔板的玻璃盖玻片上。将40μl铜绿假单胞菌接种在每个孔板的玻璃盖玻片上，并将膜加至孔板。以预定的时间间隔，将玻璃盖玻片用无菌水轻轻洗涤，以将未贴附的铜绿假单胞菌细菌去除。在荧光显微镜下对玻璃盖玻片上的细菌进行观察。在8小时内，与壳聚糖(CS)膜相比，观察到包封了GSNO的CS/NO膜降低了铜绿假单胞菌的生存力；并且24小时后，观察到更突出的降低。24小时后，与CS膜相比，观察到CS/NO膜显著更突出地降低了金黄色葡萄球菌的生存力。7.体内伤口愈合试验为了评价CS/NO膜的体内伤口愈合功效，选择体重250g-280g的雄性Sprague-Dawley大鼠作为动物模型。在发展背部区域上的伤口之前，以5:2的比例使用Zoletil(替来他明/唑拉西泮)和(盐酸甲苯噻嗪)将大鼠麻醉。用电动剃刀将背部毛发去除。随后，将背部皮肤切除，以产生全层伤口(full-thicknesswound)(1.5cm×1.5cm)。将50μl铜绿假单胞菌溶液(3.2×1088888个细胞/ml)滴至每个伤口并孵育24小时以产生感染性伤口。用(Mundipharma，对照)、实施例2中制备的PVA/NO膜或CS/NO膜将每个伤口覆盖。用弹性胶带(Micropore，3MConsumerHealthCare，StPaul，MN，USA)将所有材料覆盖并固定。在适当时间用新敷料替换伤口病灶上的每一个敷料。将所有老鼠照料在单独的笼中，使用数字照相机每3天对病灶的数字图像进行收集。伤口出现后4天、7天、10天、13天和16天，通过数字图像对伤口中的宏观变化进行检测。如下确定并计算伤口尺寸减小和上皮化率。上皮化率(％)＝Et/(Wt+W0)×100其中，Et是时间t时的上皮形成面积，Wt是时间t时的伤口面积，以及W0是初始时间时的伤口面积。图5是手术后伤口根据短暂性变化(temporarychanges)的宏观外形，在手术后4天(POD4)，在各组大鼠的伤口区域中观察到严重炎症，而经CS/NO膜处理的伤口显示出更快的闭合。图6示出了经释放NO的膜处理的伤口的尺寸减小曲线。在POD10，经CS/NO膜处理的大鼠的伤口几乎闭合，伤口尺寸与对照中的大鼠的伤口相比显著不同。另外，经PVA/NO膜处理的大鼠的伤口在伤口愈合过程中也显示出有益效果，该过程慢于经CS/NO膜处理的伤口的愈合过程。图7示出了伤口的上皮化率曲线。在POD4，与Mediform覆盖的伤口相比，CS/NO膜处理的伤口显示更高的上皮化率。尤其是，CS/NO膜处理的伤口显示最高的上皮化率，而且在POD7-POD10，与经Mediform对照处理的伤口相比，经CS/NO膜处理的伤口表现出显著更高的上皮化率。因此，释放NO的膜具有优异的伤口愈合效果，与将PVA用作基质的PVA/NO膜相比，将壳聚糖用作基质的CS/NO膜显示更优异的伤口愈合效果。这一结果表明，壳聚糖具有包封并稳定释放NO的能力，从而引起壳聚糖本身的抗菌功效和伤口愈合的协同效应。8.组织形态测定1)组织形态测定过程收集包含真皮和皮下组织的皮肤伤口组织，对基于伤口肉芽组织样品的一个或两个区域、优选中间区域进行切割。将切割皮肤固定在10％中性缓冲福尔马林中。石蜡包埋后，制备3μm-4μm的切片。将每个切片用苏木精和伊红(H&E)染色以用于光学显微镜研究，或将每个切片的胶原蛋白纤维用Masson三色染色。然后，在光学显微镜(E400，Nikon，日本)下通过组织形态测定法对各个皮肤进行观察。2)组织形态测定法为了确定更详细的组织病理学变化，通过使用基于计算机的自动化数字图像分析仪(iSolutionFLver9.1，IMTi-solutionInc.，Quebec，加拿大)，对所制备的各横切组织皮肤样品的剥落上皮(desquamatedepithelial)区域(mm)、肉芽组织中的微血管数量(血管/mm2视野)、肉芽组织中的浸润炎性细胞数量(细胞/mm2视野)、肉芽组织中的胶原蛋白占据区域的百分比(％/mm2视野)以及肉芽组织面积(mm2/横切伤口的中间区域)进行测量。每组中的八个伤口被考虑用于这一实验中的进一步分析。另外，还按照加以修改的以前已知的方法(BiolPharmBull2007，Dec，30(12)：2406-2411)对再上皮化率进行了计算。再上皮化率(％)＝[伤口的总长度(mm)-剥落上皮区域(mm)]/伤口的总长度(mm)×1003)结果图8和表2阐明了伤口中的组织形态测定变化，在组织病理学和组织形态测定对比中，与对照组相比，膜处理组中的剥落上皮区域显著下降，而再上皮化率显著提高。尤其是，释放NO的膜的处理对伤口愈合产生更有利且更显著的加速效果；与空白膜和纱布对照组相比，在释放NO的膜处理组中观察到伤口更快速再生、肉芽组织更快速重建、炎性细胞浸润更低且新血管形成更少。此外，在释放NO的膜处理组中观察到更有利的快速胶原蛋白纤维再生率。[表2]组织形态测定纱布对照空白膜CS/NO膜剥落上皮区域(mm)2.93±0.681.44±0.220.61±0.1ce再上皮化率(％)70.66±6.7985.58±2.1993.91±0.98ce微血管数量154.24±28.3666.38±16.15a30.25±11.72ab浸润炎性细胞数量441.13±122.71139.00±21.53c79.75±14.27ce胶原蛋白占据区域(％)34.32±8.8849.55±7.19a62.34±6.41ab肉芽组织面积(mm2)6.39±1.584.25±0.55c2.46±0.46ce上述值表示为八个大鼠伤口的平均值土SD。a经LSD检验，与纱布对照相比p＜0.01。b经LSD检验，与0mgNO相比p＜0.01。c经MW检验，与纱布对照相比p＜0.01；d经MW检验，与纱布对照相比p＜0.05。e经MW检验，与0mgNO相比p＜0.01。虽然已参考实施例和附图对本发明进行了详细说明，但本发明不限定于此。本领域技术人员能够在所附权利要求书中记载的本发明的精神和范围的等同范围内作出各种修改及变化。当前第1页1 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