发明领域
本发明涉及新的抗纤维蛋白溶解化合物，它们的制备方法，它们的药物组合物，以及它们在医药，特别是治疗出血中的用途。
发明背景
手术以及主要组织损伤治疗的主要目标为避免出血或使出血最小化以确保形成不容易被纤溶酶溶解的稳定且安全的止血栓塞。确保此类栓塞或凝块的迅速且有效的形成是重要的，应限制所述栓塞或凝块的程度以避免非期望的止血后果。抗纤维蛋白溶解剂被广泛用于在大手术中以及在响应与诸如月经过多的病理学相关的出血中防止纤维蛋白溶解并减少与创伤相关的失血。
目前，两种合成的赖氨酸类似物，即ε-氨基己酸(eaca)和氨甲环酸(txa)为在商业上广泛用于控制出血的仅有的抗纤维蛋白溶解剂。这些药剂竞争性地抑制纤溶酶原至纤溶酶的激活，所述纤溶酶为作用于迅速降解纤维蛋白和纤维蛋白原(有助于形成稳定的止血凝块的血浆蛋白)的蛋白水解酶。在有或无其它因子的参与下，纤溶酶原和纤溶酶还具有与伤口愈合、组织再生和增殖不同的另外特殊生理功能。
已知eaca和txa结合纤溶酶原、纤溶酶以及共有某些共同结构特征的多种血浆蛋白。所有这些蛋白中的共同结构特征被称为“kringle”。kringle为由大约80至100个具有高度同源序列的氨基酸组成的，通过三个二硫键保持在一起的蛋白链，其完全赋予含有它们的任何天然蛋白质的这些组分特有的三维结构。通常，含有kringle的蛋白质与纤维蛋白(原)及纤维蛋白形成和降解系统具有一些功能关联。此外，在正常代谢中生成的并且含有两个或更多个kringle的纤溶酶(原)的生理学相关的蛋白水解片段被称为血管抑制素，因为它们作为血管生长的抑制剂起作用。
在其结构阐明之前，已知纤溶酶原和纤溶酶均与单链ω氨基羧酸结合，其中在其结合纤溶酶(原)或影响纤溶酶(原)功能的能力中，5、6或7个氨基-戊酸、己酸或庚酸为最佳。详细的结构-活性研究导致首先是eaca，随后txa被鉴定为与用于减轻纤溶酶介导的纤维蛋白溶解的最佳药剂相同。
氨基己酸(6-氨基己酸)为氨基酸赖氨酸的衍生物和类似物，这使其成为结合该特定残基的酶的有效抑制剂或配体。此种酶包括蛋白水解酶，如纤溶酶(负责纤维蛋白溶解的酶)。出于此原因，其在治疗可以口服或静脉内给予的某些出血病症中是有效的。作为抗纤维蛋白溶解剂，氨基己酸通过阻断血凝块的分裂起作用。其可用于预防和治疗患有引起血凝块溶解快于正常并导致严重出血的医学病况的患者中的严重出血，所述医学病况包括：血友病；再生障碍性贫血；肺癌、前列腺癌、胃癌和宫颈癌；肝硬化；以及手术的某些并发症。
氨基己酸被fda批准用于当纤维蛋白溶解导致出血时增强止血。在危及生命的情况下，可能需要输入合适的血液制品以及其它紧急措施。纤维蛋白溶解性出血通常可能与以下相关：心脏手术(进行或未进行心脏搭桥手术)和门腔静脉分流术后的手术并发症；血液病，如低巨核细胞性血小板减少症(伴随再生障碍性贫血)；急性和危及生命的胎盘早期剥离；肝硬化；以及肿瘤疾病，如前列腺癌、肺癌、胃癌和宫颈癌。尿纤维蛋白溶解通常是正常的生理现象，其可能导致与手术血尿(前列腺切除术和肾切除术之后)或非手术血尿(伴随泌尿生殖系统的多囊性疾病或肿瘤疾病)相关的过度尿路纤维蛋白溶解性出血。局部用凝胶(caprogel)被fda批准的用于治疗眼部外伤性前房积血。
氨甲环酸[反式-4-(氨甲基)环己烷羧酸]为氨基酸赖氨酸的另一合成类似物。其被用于治疗或预防手术期间以及多种医学病况或病症中的失血过多(帮助止血)。其为抗纤维蛋白溶解剂，其通过结合纤溶酶原和纤溶酶两者的特定位点来抑制纤溶酶原至纤溶酶(负责纤维蛋白降解的分子)的激活，所述纤维蛋白为形成血凝块结构的蛋白。氨甲环酸的抗纤维蛋白溶解活性为氨基己酸的大约8倍，并且经常被用于具有高失血风险的手术中，如心脏、肝脏、血管和大的整形手术中。
氨甲环酸500mg片剂被fda批准用于具有增加的纤维蛋白溶解或纤维蛋白原溶解的那些患者中出血或出血风险的的短期使用。局部纤维蛋白溶解发生在以下情况中：前列腺切除术和膀胱手术、月经过多、鼻出血、宫颈锥形切除术、外伤性前房积血、血友病患者拔牙管理和遗传性血管神经水肿。cyklokapron注射剂用于在患有血友病的患者中短期使用(2至8天)以减少或预防出血，并降低拔牙期间和拔牙后对于替代疗法的需求。
其它抗纤维蛋白溶解化合物描述于下述专利和专利申请中：
merck的美国专利第3,526,657号公开了“化合物4-氨甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸具有抗纤维蛋白溶解特性并且能够防护某些出血病况和由患者的病理学纤维蛋白溶解状态造成的其它病症。”
merck的美国专利第3,634,499号公开了“化合物4-氨甲基二环-[2.2.1]-庚烷l-羧酸、4-氨甲基二环-[2.2.2]-辛烷-1-羧酸、5-氨甲基二环-[32.2]-壬烷-1-羧酸以及各自相应的2,5和6,8-二酮化合物可用于抗纤维蛋白溶解化合物。”
merck的美国专利第3,641,128号公开了“化合物4-(a-氨基低级烷基)二环-[2.2.2]-辛烷-1-羧酸及其药学可接受的盐可用作抗纤维蛋白溶解化合物。”
merck的美国专利第3,641,129号公开了“化合物4-氨甲基二环-[2,2,2]-辛烷-乙酸及其药学可接受的盐可用作抗纤维蛋白溶解化合物。”
美国专利第3,754,085号公开了“新的取代或未取代的苯膦酸和环己烷膦酸。本文公开的膦酸为有效的抗纤维蛋白溶解剂。本文还包括含有所述膦酸化合物作为活性成分的药物组合物以及通过施用所述化合物治疗患者的纤维蛋白溶解状态的方法。还涵盖了本领域已知具有新的抗纤维蛋白溶解活性的取代的苯膦酸。”
stanleydrugproducts的美国专利第3,920,833号公开了“本文提供一类新的合成的抗纤维蛋白溶解剂。已经发现某些ω-氨基烷烃磺酸显示出有效的抗纤维蛋白溶解活性。”
laboratoriofides的美国专利第4,689,346号公开了“用于实现止血和抗纤维蛋白溶解作用的化合物，即1-酰氨基萘-4磺酸衍生物和组合物以及实现此类作用的方法。”
proyectodebiomedicinacima的wo2014012964公开了“式(i)的螺环化合物、它们的制备方法以及该方法中使用的中间体。其还涉及包含它们的药物组合物或兽医学组合物，以及它们在医药，特别是作为抗纤维蛋白溶解剂和止血剂中的用途。”
仍需要具有更好的生物活性和/或降低的副作用(如溶栓并发症)的可能性的改善的抗纤维蛋白溶解化合物以治疗经历出血发作的对象(包括出血发作是由于手术、创伤或其它形式的组织损伤的对象)以及处于以过度纤维蛋白溶解为特征的临床情形中的对象。
发明概述
本申请涉及许多化学结构的实施方案，其全部或部分模拟或者为氨基酸赖氨酸的类似物，使得它们结合纤溶酶原和/或纤溶酶和/或纤溶酶原激活物和/或凝血酶结构中特定蛋白亚结构内的特定结合位点。迄今为止，抗纤维蛋白溶解赖氨酸类似物均含有带正电荷的质子化胺或取代的胺官能团。本文提出的赖氨酸类似物的一些实施方案首次掺入含有三价硫的带正电荷的锍基团。本专利申请要求发明申请靶向上述蛋白中的赖氨酸结合位点(lbs)的含有锍基团的抗纤维蛋白溶解化合物的优先权。
锍基团的化学，并且特别是生物化学对于从事设计旨在破坏lbs功能的结构的所有化学家和生化学家是众所周知的，并且对于锍基团的烷基化反应的可能性，对科学实践者将显而易见的是，此类基团提供远优于仅含胺官能团的化合物的破坏lbs的功能性的可能性。然而，迄今为止，尚未提出含有锍盐的化合物在研发抗纤维蛋白溶解剂中的应用。
在第一方面，本发明提供式i的新型化合物
r1-chr2-c(o)-x-chr3-chr4-r5(i)
其中：
r1为-nh2、-nhr6、-nr6r7、-n+r6r7r8或-s+r9r10；
r2为选自精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甘氨酸的氨基酸(包括其天然和非天然光学异构体)的侧链，以及已知通过代谢翻译后修饰，如磷酸化、羟基化、羧基化或甲基化改变的各个侧链；
x为-nr-、-o-或-s-；
r为氢、or’、nr’r”、(c1-c4)烷基、(c3-c7)环烷基或(c1-c4)烷基芳基，其中：芳基为苯基、吡啶基、吲哚基、噻吩、苯基丙烯酰基、吲哚丙烯酰基、吡啶基丙烯酰基、呋喃基丙烯酰基、嘌呤基或嘧啶基；以及r’和r”独立地为氢、(c1-c4)烷基，或连同它们连接的n原子一起形成吖丙啶基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基或吡咯基；
r3为氢、(c1-c4)烷基、苯基或(c3-c7)环烷基；或r3和r4连同它们连接的碳原子一起形成(c3-c7)环烷基；
r4为氢或-nh-c(o)-r11；
r5为-c(o)r12、-so2r13、-p(o)r14r15、硝基或亚硝基；
r6、r7、r8、r9和r10独立地为(c1-c4)烷基或卤代(c1-c4)烷基；或r6和r7连同它们连接的n原子一起形成吖丙啶基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基或吡咯基；
r11为(c1-c4)烷基、苯基、苄基、烟碱基或甲苯磺酰基；以及
r12、r13、r14和r15独立地为羟基、-o-(c1-c4)烷基或-(c1-c4)烷基；
及其药学可接受的盐。
在第一实施方案中，化合物为式(ia)：
r1-chr2-c(o)-nr-chr3-chr4-r5(ia)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式ib：
h2n-chr2-c(o)-nr-chr3-chr4-cooh(ib)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式ic：
h2n-chr2-c(o)-nr-ch2-ch2-cooh(ic)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式id：
r9r10s+-chr2-c(o)-nr-chr3-chr4-r5(id)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式ie：
r9r10s+-chr2-c(o)-nr-chr3-chr4-cooh(ie)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式if:
r9r10s+-chr2-c(o)-nh-ch2-ch2-cooh(if)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r9和r10独立地为(c1-c2)烷基或卤代(c1-c2)烷基。
在优选实施方案中，r9和r10均为甲基。
在第二实施方案中，化合物为式ig：
r1-chr2-c(o)-o-chr3-chr4-r5(ig)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式ih：
h2n-chr2-c(o)-o-chr3-chr4-cooh(ih)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式ii：
h2n-chr2-c(o)-o-ch2-ch2-cooh(ii)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式ij：
r9r10s+-chr2-c(o)-o-chr3-chr4-r5(ij)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式ik：
r9r10s+-chr2-c(o)-o-chr3-chr4-cooh(ik)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式im：
r9r10s+-chr2-c(o)-o-ch2-ch2-cooh(im)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r9和r10独立地为(c1-c2)烷基或卤代(c1-c2)烷基。
在优选实施方案中，r9和r10均为甲基。
在第三实施方案中，化合物为式in：
r1-chr2-c(o)-s-chr3-chr4-r5(in)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式io：
h2n-chr2-c(o)-s-chr3-chr4-cooh(io)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式ip：
h2n-chr2-c(o)-s-ch2-chr4-cooh(ip)
其中r4为-nh-c(o)-r11；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式iq：
r9r10s+-chr2-c(o)-s-chr3-chr4-r5(iq)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式ir：
r9r10s+-chr2-c(o)-s-chr3-chr4-cooh(ir)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，化合物为式is：
r9r10s+-chr2-c(o)-s-ch2-chr4-cooh(is)
其中r4is-nh-c(o)-r11；
及其药学可接受的盐。
在第四实施方案中，化合物为式it：
r9r10s+-chr2-c(o)-x-chr3-chr4-r5(it)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r9和r10独立地为(c1-c2)烷基或卤代(c1-c2)烷基。
在优选实施方案中，r9和r10均为甲基。
在第五实施方案中，化合物为式iu：
r6r7r8n+-chr2-c(o)-x-chr3-chr4-r5(iu)；
及其药学可接受的盐。
在第二方面，本发明提供式ii的新型化合物：
r1-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-r5(ii)
其中：
r1为-nh2、-nhr6、-nr6r7、-n+r6r7r8或-s+r9r10；
r5为-c(o)r12、-so2r13、-p(o)r14r15、硝基或亚硝基；
r6、r7、r8、r9和r10独立地为(c1-c4)烷基或卤代(c1-c4)烷基；或r6和r7连同它们连接的n原子一起形成吖丙啶基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基或吡咯基；以及
r12、r13、r14和r15独立地为羟基、-o-(c1-c4)烷基或-(c1-c4)烷基或卤代(c1-c4)烷基；
条件是当r2为cooh时，r1不是nh2；
及其药学可接受的盐。
在第一实施方案中，化合物为式iia：
r9r10s+-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-r5(iia)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r9和r10独立地为(c1-c2)烷基或卤代(c1-c2)烷基。
在优选实施方案中，r9和r10均为甲基。
在优选实施方案中，化合物为式iib：
r9r10s+-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-c(o)r12(iib)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r12为羟基、-o-(c1-c4)烷基或卤代(c1-c4)烷基。
在优选实施方案中，化合物为式iic：
r9r10s+-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-so2r13(iic)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r13为羟基或-o-(c1-c4)烷基。
在优选实施方案中，化合物为式iid：
r9r10s+-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-p(o)r14r15(iid)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r14和r15独立地为羟基或-o-(c1-c4)烷基。
在第二实施方案中，化合物为式iie：
r6r7r8n+-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-r5(iie)；
及其药学可接受的盐。
在第三方面，本发明提供式iii的新型化合物：
r1-ch2-x1-r5(iii)
其中：
r1为-nh2、-nhr6、-nr6r7、-n+r6r7r8或-s+r9r10；
r5为-c(o)r12、-so2r13、-p(o)r14r15、硝基或亚硝基；
r6、r7、r8、r9和r10独立地为(c1-c4)烷基或卤代(c1-c4)烷基；或r6和r7连同它们连接的n原子一起形成吖丙啶基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基或吡咯基；
r12、r13、r14和r15独立地为羟基、-o-(c1-c4)烷基或-(c1-c4)烷基；以及
x1为反式环己-1,4-二基；
条件是当r2为cooh时，r1不是nh2；
及其药学可接受的盐。
在第一实施方案中，化合物为式iiia：
r9r10s+-ch2-x-r5(iiia)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r9和r10独立地为(c1-c2)烷基或卤代(c1-c2)烷基。
在优选实施方案中，r9和r10均为甲基。
在优选实施方案中，化合物为式iiib：
r9r10s+-ch2-x1-c(o)r12(iiib)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r12为羟基或-o-(c1-c4)烷基。
在优选实施方案中，化合物为式iiic：
r9r10s+-ch2-x1-so2r13(iiic)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r13为羟基或-o-(c1-c4)烷基。
在优选实施方案中，化合物为式iiid：
r9r10s+-ch2-x1-p(o)r14r15(iiid)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r14和r15独立地为羟基或-o-(c1-c4)烷基。
在第二实施方案中，化合物为式iiie：
r6r7r8n+-ch2-x1-r5(iiie)；
及其药学可接受的盐。
在第四方面，本发明提供式iv的新型化合物：
r1-chr2-c(o)-r16(iv)
其中：
r1为-nh2、-nhr6、-nr6r7、-n+r6r7r8或-s+r9r10；
r2为选自精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甘氨酸的氨基酸(包括其天然和非天然光学异构体)的侧链以及已知通过代谢翻译后修饰，如磷酸化、羟基化、羧基化或甲基化改变的各个侧链；
r6、r7、r8、r9和r10独立地为(c1-c4)烷基或卤代(c1-c4)烷基；或r6和r7连同它们连接的n原子一起形成吖丙啶基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基或吡咯基；以及
r16为2-羟基苯甲酸或其经由羟基连接以形成酯键的(c1-c4)烷基酯；
及其药学可接受的盐。
在第一实施方案中，化合物为式iva：
h2n-chr2-c(o)-r16(iva)；
及其药学可接受的盐。
在第二实施方案中，化合物为式ivb：
r9r10s+-chr2-c(o)-r16(ivb)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r9和r10独立地为(c1-c2)烷基或卤代(c1-c2)烷基。
在优选实施方案中，r9和r10均为甲基。
在第三实施方案中，化合物为式ivc：
r6r7r8n+-chr2-c(o)-r16(ivc)；
及其药学可接受的盐。
在第五方面，本发明提供式v的新型化合物：
r1-ch2-ch2-nr17-ch2-ch2-r5(v)
其中：
r1为-nh2、-nhr6、-nr6r7、-n+r6r7r8或-s+r9r10；
r5为-c(o)r12、-so2r13、-p(o)r14r15、硝基或亚硝基；
r6、r7、r8、r9和r10独立地为(c1-c4)烷基或卤代(c1-c4)烷基；或r6和r7连同它们连接的n原子一起形成吖丙啶基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基或吡咯基；
r17为-l-r18；
l为-c(o)ch2ch2c(o)-；以及
r18为7-氨基放线菌素d，其经由氨基连接以形成酰胺键，或者也经由氨基末端肽基残基的α-氨基形成酰胺键中的肽基部分；
及其药学可接受的盐。
在第一实施方案中，化合物为式va：
r9r10s+-ch2-ch2-nr17-ch2-ch2-r5(va)；
及其药学可接受的盐。
在优选实施方案中，r9和r10独立地为(c1-c2)烷基或卤代(c1-c2)烷基。
在优选实施方案中，r9和r10均为甲基。
在第二实施方案中，化合物为式vb：
r6r7r8n+-ch2-ch2-nr17-ch2-ch2-r5(vb)；
及其药学可接受的盐。
在第三实施方案中，化合物为式vc：
h2n-ch2-ch2-nr17-ch2-ch2-r5(vc)；
及其药学可接受的盐。
在第六方面，本发明提供式vi的肽化合物：
x1-x2-r3(vi)
其中：
x1为天然氨基酸，包括其天然存在的翻译后修饰以及其所有光学异构体，其中其α羧基与氨基酸x2的α氨基形成肽键；
x2为选自天冬氨酸、谷氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的氨基酸(包括其各种光学异构体)，其α羧基与r3形成酰胺键；
r3为nr1r2或-x3r4，其中x3为天然氨基酸，包括其天然存在的翻译后修饰以及其所有光学异构体，其中其α羧基与氨基酸r4的α氨基或者与胺nhr1r2形成肽键；
r4为nr1r2或-x4r5，其中x4为天然氨基酸，包括其天然存在的翻译后修饰以及其所有光学异构体，其中其α羧基与氨基酸r5的α氨基或者与胺nhr1r2形成肽键；
r5为nr1r2或-x5r6，其中x5为天然氨基酸，包括其天然存在的翻译后修饰以及其所有光学异构体，其中其α羧基与氨基酸r6的α氨基或者与胺nhr1r2形成肽键；
r6为nr1r2或-x6r7，其中x6为天然氨基酸，包括其天然存在的翻译后修饰以及其所有光学异构体，其中其α羧基与胺nhr1r2形成肽键；
r1为氢、c1-4烷基、苯基、苄基，或者连同r2及其所连接的氮一起形成吗啉基、吖丙啶基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基或吡咯基；以及
r2为氢、c1-4烷基、苯基、苄基，或者连同r1及其所连接的氮一起形成吗啉基、吖丙啶基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基或吡咯基；
及其药学可接受的盐。
在第一实施方案中，化合物为式via：
甘氨酰-(天冬氨酰基/谷氨酰基)-r3(via)；
及其药学可接受的盐。
具体地，氨基酸x3-x4-x5-x6的序列天然存在于人生理蛋白成分中，其起始于三肽序列精氨酰甘氨酰(天冬氨酰基/谷氨酰基)(rgd/e)或赖氨酰甘氨酰(天冬氨酰基/谷氨酰基)(kgd/e)中的甘氨酰残基。
在第二实施方案中，化合物为式vib：
α-含氘d甘氨酰天冬氨酰基-nr1r2(vib)；
及其药学可接受的盐。
在第三实施方案中，化合物为式vc：
α-含氘d甘氨酰天冬氨酰基色氨酰-nr1r2(vc)；
及其药学可接受的盐。
在第七方面，本发明提供药物组合物，其包含如本文所述的任何式的抗纤维蛋白溶解化合物或其药学可接受的盐以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
在第八方面，本发明提供如本文所述的任何式的抗纤维蛋白溶解化合物或其药学可接受的盐，其用作药物。
在第九方面，本发明提供如本文所述的任何式的抗纤维蛋白溶解化合物或其药学可接受的盐，其用作抗纤维蛋白溶解剂或止血剂。
在第十方面，本发明提供如本文所述的任何式的抗纤维蛋白溶解化合物或其药学可接受的盐，其用于治疗病理学和/或先天性过多出血病症、限制由创伤引起的出血、限制手术期间和之后的出血、限制组织生长、减少载脂蛋白a对中风和心脏病事件的贡献或者制备含kringle的蛋白结构的选择性修饰制备物以修饰或限制那些蛋白的功能。
在第十一方面，本发明提供治疗兽医学医学实践中出血创伤或病理学的方法，其包括：向需要此类治疗的哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的任何式的抗纤维蛋白溶解化合物或其药学可接受的盐。
应理解并认识到本发明还考虑上文以及在本申请内别处列出的实施方案的所有允许的组合。
发明详述
除非另有说明，否则本文使用的所有术语均应被理解为本领域已知的其普通含义。本申请中使用的某些术语的其它更具体的定义如以下所述，并且旨在将其一致应用在整个说明书和权利要求中，除非另有明确规定的定义提供更宽泛的定义。
术语“卤素”和“卤代”在单独或与其它基团组合时，指氟、氯、溴和碘。优选的卤素包括氯和氟。
术语“c1-4烷基”和“(c1-c4)烷基”在单独或与其它基团组合时，意指含有1-4个碳原子的支链或直链单价烷基。实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。
术语“卤代c1-4烷基”和“卤代(c1-c4)烷基”是指如本文定义的c1-4烷基，其中一个或多个氢被卤素独立地取代。实例包括-ch2cl、-ch2cf3、-chclcf3、-ch2ccl3和全氟烷基(如，-cf3)。
术语“c3-7环烷基”和“(c3-c7)环烷基”在单独或与其它基团组合时，指具有3-7个环碳的饱和单价环状烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
术语“c1-4烷氧基”在单独或与其它基团组合时，指r’-o-，其中r’为c1-4烷基。
术语“杂环基”在单独或与其它基团组合时，指4-6个环原子的非芳族单环基团，其中一个或两个环原子选自n、o或s(o)n(其中n为0至2的整数)，以及剩余的环原子为c。实例包括哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、吖庚因基(azepinyl)、二氧戊环基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、噁唑烷基、异噁唑基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑基、奎宁环基、噻二唑基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜(thiomorpholinylsulfoxide)和硫代吗啉基砜(thiomorpholinylsulfone)。
术语“杂芳基”是指含有独立地选自氮、氧和硫的1、2或3个环原子的芳香族5至6元单环或9至10元双环。实例包括呋喃基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻唑基、噻吩基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、咪唑基、吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、噻唑基、异噻唑基、1,2,3-噻二唑基、苯并咪唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、噻唑基、苯并噻唑基、异噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基噁唑基以及喹啉基。
熟练的技工应理解本发明的化合物能够与多种无机酸和有机酸反应以形成药学可接受的酸加成盐。此类药学可接受的酸加成盐以及制备它们的常见方法在本领域众所周知。参见，例如p.stahl等人,handbookofpharmaceuticalsalts:properties,selectionanduse,(vcha/wiley-vch,2002)；和s.m.berge等人,“pharmaceuticalsalts,”journalof^pharmaceuticalsciences,第66卷,第1期,1977年1月。
术语“药学可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适合用于与人和低等动物的组织接触，而无异常毒性、刺激和过敏反应等的那些盐。盐为本发明化合物的有机或无机盐，其保持该化合物的生物活性。盐可以由以下制备：合适的、无毒的与游离碱反应的有机或无机酸，或与本发明化合物的酸基团反应的有机和无机碱。酸加成盐的实例包括来源于无机酸和有机酸的那些盐。无机酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磺酸、磷酸、硝酸；有机酸的实例包括但不限于对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、马来酸、乳酸、富马酸等。碱加成盐的实例包括来源于氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、季铵碱如四甲基氢氧化铵的那些。将酸或碱化合物转化成盐以改善其物理化学特性、化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性在本领域众所周知。
本发明化合物可以呈未溶剂化化合物或溶剂化物(例如水合物)的结晶形式，并且旨在这两种形式均在本发明范围内。溶剂化的方法也是本领域众所周知的。通常，出于本发明的目的，含有药学或兽医学可接受的溶剂如水、乙醇等的溶剂化形式相当于非溶剂化形式。
“药学可接受的”稀释剂、载体或赋形剂是指与向对象施用的化合物相容并且是无毒的那些载体和赋形剂。
本发明化合物的“治疗有效量”意指有效预防或延缓疾病的进展，或减弱、改善疾病的一些症状或延长患者的寿命的化合物的量。治疗有效量的确定取决于医学领域众所周知的多种因素。
治疗有效量或剂量可以在宽范围内变化，并且可以通过本领域已知的技术来确定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的具体化合物的活性，施用途径，治疗持续时间，以及患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食。通常，当口服或肠胃外施用时，化合物的日总剂量的范围可以为10mg至10,000mg，本发明化合物的日总剂量可以以单剂量或多剂量施用。由于本发明的化合物具有比eaca和txa更强的生物活性，所以对于相同的预期施用途径和用途，其有效剂量通常较低。
本发明的化合物优选被配制成通过多种途径施用的药物组合物。此类药物组合物以及制备它们的方法在本领域众所周知。参见，例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy(a.gennaro等人编辑，第19版.mackpublishingco.,1995)。
本发明的化合物可用作止血剂和抗纤维蛋白溶解剂，并且可以用在宽范围的治疗应用中。在手术中，抗纤维蛋白溶解剂(除了减少手术后出血之外)可以例如在心脏、肝脏和整形外科手术，以及另外在富含纤维蛋白溶解激活物的器官(前列腺、子宫、恶性器官&组织)中的肿瘤手术的情况下替代输血和其它血液衍生物(hemoderivatives)。在创伤患者中，抗纤维蛋白溶解剂可以降低由于出血引起的全因死亡率和死亡。此外，本发明的抗纤维蛋白溶解剂也可以用于控制溶栓疗法中的出血，例如，在急性心脏病发作和缺血性中风以及主要或颅内出血的情况下。此外，本发明的抗纤维蛋白溶解剂可用于治疗局部出血，例如拔牙后，特别是患有先天性凝血病(如血友病)的患者或患有糖尿病患者中的局部出血；可用于治疗与先天性或获得性凝血病相关的妇女的月经过多以及产后出血；以及可用于治疗胃肠道和泌尿系统的出血，包括前列腺切除术。最后，应理解，本发明的化合物可以用于与氨基己酸和氨甲环酸相同的fda批准的适应症。
如上所述，eaca和txa均通过阻滞纤溶酶原至纤溶酶的激活来发挥其对纤维蛋白溶解的作用。然而，该实验确定的效果以间接方式发生，包括这些药物与一种或多种纤溶酶原的kringle结构的结合。一些kringle结构具有阴离子结合位点(由质子化的阳离子赖氨酸和/或精氨酸侧链组成)，氯离子以约8mm的kd(app)与所述阴离子结合位点结合，使得纤溶酶原在其100mm氯离子的生理环境下与氯离子几乎完全结合。当与其氯化物结合形式的激活速率相比时，溶液中的无氯的纤溶酶原以约快8倍的速率激活。eaca和txa的阴离子羧基取代结合纤溶酶原的氯离子，而它们的阳离子质子化氨基同时占据asp-x-asp序列中的含有带负电荷的天冬氨酸残基的阳离子结合口袋。
如通过x-射线晶体学所揭示的，txa&eaca均结合纤溶酶(原)kringle上的同一位点。结合位点由在一端带正电荷的口袋、另一端带负电荷的口袋以及中间的疏水结合区域组成。txa和eaca在这些位点分别以大约40μm和200μm的表观kd缔合纤溶酶(原)。还已知纤溶酶(原)经由纤溶酶(原)的kringle结构紧密结合纤维蛋白凝块(不如与纤维蛋白原的结合紧密)，其中kd值在亚纳摩尔范围内(对于纤维蛋白原为微摩尔)。可能的是纤维蛋白(原)可结合除纤溶酶(原)kringle上txa/eaca结合位点之外的以及包括纤溶酶(原)kringle上txa/eaca结合位点在内的纤溶酶(原)上的位点；然而，纤溶酶(原)至纤维蛋白(原)的结合经由也被txa/eaca占据的kringle位点发生。
对txa/eaca药理学重要的事实是关于以下的事实：在txa/eaca治疗后纤溶酶原被激活至纤溶酶的速率，以及一旦形成后，纤溶酶的催化效率。如果我们设定溶液中纤溶酶原的相对激活速率，并且在存在生理水平的氯离子和纤维蛋白原(100％)的情况下下，则在不存在或存在治疗水平的txa/eaca的情况下获得的激活速率为：在不存在纤维蛋白的情况下下为100(250-300)，以及在存在纤维蛋白的情况下为5,000-8,000(200-600)。因此，在纤维蛋白凝块表面的纤溶酶原以比溶液中的纤溶酶原快50-80倍的速率激活成纤溶酶。在存在txa/eaca和纤维蛋白的情况下，激活速率比在溶液中的纤溶酶原(在不存在纤维蛋白但存在txa/eaca的情况下)快2-6倍(相较于溶液中的纤溶酶原的1.0的速率)。总体上，效果是将相对纤维蛋白溶解速率从50-80降低至2-6，或者抑制了80％或更高。在机理上，txa/eaca结合至参与纤维蛋白与纤溶酶(原)结合的同一位点，或以其他方式(如经由构象变化)竞争性抑制纤维蛋白-纤溶酶(原)的结合。应强调两个最终的事实：(1)kringle上txa/eaca结合位点的天然配体是未知的，以及(2)与非常紧密的结合(亚纳摩尔至皮摩尔解离常数)相比，txa和eaca均相当差地结合(解离常数在毫摩尔至微摩尔范围内)。幸运的是，这两种药物在常用的相对高的剂量下几乎没有报道严重的副作用。然而，这两个基本事实导致了本申请涵盖的药物候选物的发现。
本申请中的发明大致分为六个单独的方面。在所有方面，化合物解决需要控制、调节或限制纤维蛋白溶解的病状。为了这个目的，一些化合物比其它化合物更有效，并且一些化合物具有比其它化合物更长期的效果。请记住当前药物学仅提供一种真正有效的化合物(呈各种剂型的氨甲环酸，其中ε氨基己酸远居第二)，并且半个多世纪以来，本领域未发生显著变化，在药理学领域存在广阔的创新机会。例如，当本申请中的一些化合物与控制弥散性血管内凝血(dic)的其它方法结合使用时可很好地用来减少与诸如埃博拉病毒(ebov)感染引起的出血疾病相关的非常高的死亡率。下面描述这些化合物的具体优势。
本发明的六个方面中的第一方面为式i的化合物：
r1-chr2-c(o)-x-chr3-chr4-r5(i)
在代表与eaca最接近的等效结构时，这提供：
h2n-chr2-c(o)-nr-ch2-ch2-cooh(ic)
其代表n-(α-氨酰基)n-取代的β-丙氨酸二肽家族，其中最简单的代表为n-甘氨酰β-丙氨酸(ia)，其优选实施方案为n-(α-含氘d甘氨酰)β-丙氨酸：
h2n-dchd-c(o)-nh-ch2-ch2-cooh
该化合物家族包括与kringle结合极好的候选物，因为关于官能团的几何结构，它们与eaca和txa具有接近的结构相似性，以及另外，如申请人所确定的，由于肌肽和鹅肌肽(β-丙氨酰组氨酸及其甲基化的咪唑衍生物)能够取代eaca/txa。在末端氨基酸中d-构型为优选的以保护这些二肽免于肽酶。这些二肽具有比eaca和txa更进一步的优势，它们与来源于诸如受体蛋白的结构的蛋白在结构上更相关，并且因此可以引起比由eaca/txa获得的更多的生理反应。
本申请中α-氘化d甘氨酸的制备和使用是出于通过肽酶阻滞末端氨基酸的代谢的目的的发明。(ib)中化合物的另外优势为此种锍化合物可以向羧基抗衡离子提供甲基，导致其酯化和中和。因此，因为已知结合eaca/txa结合的kringle含有具有asp-x-asp序列的结合位点，其中天冬氨酸残基的羧基与eaca/txa的铵基形成盐键，所以诸如(ib)的化合物将通过将那些天冬氨酰基羧基转化成甲酯而消除母体蛋白(如纤溶酶(原))与txa/eaca和纤维蛋白的结合。这为这些化合物添加了eaca/txa中不存在的非常有效且新的亲和标记抗纤维蛋白溶解功能。可以通过例如，用这些锍配体处理患者的纤溶酶原，并且将处理的纤溶酶原返回至患者中用于更长期控制纤维蛋白溶解来进一步利用该功能。
在第二方面，本发明提供式ii的化合物：
r1-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-r5(ii)
这些中值得注意的是eaca(iib)的锍类似物。如上文所讨论的，其也在eaca结合位点充当亲和标记配体，酯化羧基残基并消除母体蛋白(如纤溶酶原)的纤维蛋白结合能力。此外，作为硫酸酯(r5＝so3r’)的这些化合物也可以通过烷基化(用r’基团)来修饰kringle结合位点。因此，利用这些实施方案，在两端修饰kringle结合位点将是可能的。eaca和txa均不能提供这样的能力来改变纤维蛋白溶解。
在第三方面，本发明提供式iii的新型化合物：
r1-ch2-x1-r5(iii)
该系列的化合物为txa的类似物，其中最少修饰的为二甲基锍盐(iiib)。它与txa一样在抑制纤维蛋白溶解中起作用，其通过消除纤溶酶原的纤维蛋白结合能力而具有更长的持续作用的更多的优势。结合位点也可以被含有硫酸酯的化合物烷基化。由于这些原因，这些是比txa更好的控制纤维蛋白溶解相关出血的候选物。
在第四方面，本发明提供式iv的新型化合物：
r1-chr2-c(o)-r16(iv)
该系列的化合物为氨酰水杨酸酯(aminoacylsalicylate)，其中放置水杨酸的羧基和氨基酸的α-氨基以结构上模拟eaca/txa。因此，这些化合物通过其kringle结合纤溶酶原。这些化合物的另外的优势来自于它们是水杨酸酯(salicylate)，因此能为抗炎剂。如果与阿司匹林(乙酰水杨酸)类似，则这些化合物也起到酰化血小板的作用，氨基酰基血小板将保留其电荷(与乙酰化不同)，从而避免出血作为使用其的并发症。
在第五方面，本发明提供式v的新型化合物：
r1-ch2-ch2-nr17-ch2-ch2-r5(v)
本发明的这些实施方案利用本文所述的配体的kringle结合能力以递送药物，如放线菌素c(癌症的化疗剂，至纤维蛋白溶解的部位)，其在这种情况下普遍与恶性肿瘤相关。该优势将通过附加具有已知特异性或治疗价值的具体配体而扩展到其它靶标。在这一点，出于治疗目的，本发明的该实施方案中的标题化合物远优于eaca/txa。
在第六方面，本发明提供式vi的肽化合物：
x1-x2-r3(vi)
本发明的第六方面基于例如纤连蛋白中的已知的识别肽序列赖氨酰甘氨酰天冬氨酰基(kgd)和精氨酰甘氨酰天冬氨酰基(rgd)，以及它们在组织修复和生长中的作用。发明人认识到，在赖氨酰或精氨酰残基处裂解这两个序列中的任一个时，释放出开始于甘氨酰天冬氨酰基等的新序列，并且该末端序列完全模拟eaca结构，其能够结合适当的kringle结构。基于该认识，本发明的该方面涵盖从氨基末端起第二位置具有天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸之一的多达六个氨基酸残基的肽。肽的随后氨基酸组成获自与来自序列数据库的kgd/e和rgd/e序列中天冬氨酸(或谷氨酸)残基之后的下游序列相关的序列信息。
合成程序
本申请涵盖的化合物可以通过本领域众所周知的常规有机合成方法制备。这些包括简单肽以及酯和硫酯、烷基/芳基磺酸盐和磷酸盐以及烷基化胺和硫化物的合成。以下提供了通常用于制备式i-vi化合物的代表性方法的实例。
制备和实施例
下面提供与本申请有关的制备的具体化合物的代表性合成。
1.t-bocd-α-含氘甘氨酸:在第一实例中，如下制备d-α-含氘甘氨酸：将2-氧代乙酸(7.6gm,0.1mol)溶解在硼酸盐缓冲液(0.1m,ph9.0)中。加入氨水至两倍摩尔过量。历经10分钟，向氨醛(ammoniacalaldehyde)的搅拌混合物中分批添加(2xmol)硼氢化钠，并在随后的两小时搅拌该混合物直至所有反应停止。在处理后，获得90％收率的d,lα-含氘甘氨酸。根据公开的程序用l氨基酸氧化酶处理含氘甘氨酸的外消旋混合物，以及在处理后获得60％收率的呈铜盐的未氧化的d异构体(方法详见：chemistryoftheaminoacids,greenstein&winitz,vol.2)。在下一步中，根据制造商提供的方法(sigmaaldrich)用市售的t-boc酸酐处理氘化的d甘氨酸，得到21mmolet-bocd-α-含氘甘氨酸。
2.d-α-含氘甘氨酰β-丙氨酸(1aa):[修改自chemistryoftheaminoacids,greenstein&winitz]用含二环己基碳二亚胺(10mmol)和t-bocd-α-含氘甘氨酸(10mmol)的乙腈依序处理含β-丙氨酸叔丁酯(10mmol)的乙腈，并使反应在室温进行2小时。通过过滤去除沉淀的二环己脲，以及进一步的处理获得80％收率的二肽。去除保护基团(聚苯乙烯磺酸树脂)，并获得90％收率的二肽。
3碘乙酰基β-丙氨酸：上述程序用于从碘乙酸和β丙氨酸叔丁酯制备具有极好收率的碘乙酰基β-丙氨酸，并且如上去除保护性酯。
4.s,s二甲基硫代甘醇基(thioglycoly)β-丙氨酸sultane(1b)：目标化合物通过以下获得：用含二甲硫醚的三氟乙酸(tfa)处理碘乙酰基β-丙氨酸，从乙醚中沉淀产物并从混合物中分离。
5.6-(s,s二甲基硫代)己酸sultane(iib)：其为eaca的锍类似物，并且易于由6-溴己酸和二甲硫醚制备。在温和加热并搅拌过夜下，将反应物(各为10mmol)在作为溶剂的tfa中一起混合。通过从乙醚中沉淀获得多于90％收率的产物。由4-硫代甲基丁基-1-l硝酸盐类似地获得相应的磺酸和膦酸，同样也获得锍盐。在与如上含二烷基硫醚的tfa反应之前，通过在回流下例如用甲醇盐酸首先酯化6-溴己酸来制备6-(s,s二甲基硫代)己酸sultane的酯。通过用摩尔当量的三氟甲磺酸甲酯处理来获得磺酸和膦酸的酯(分别针对磺酸甲酯和膦酸甲酯)。
6.4-(s,s二甲基硫代)甲基环己烷-1-甲酸sultane(iiib)：其为txa的锍类似物；其易于由商购获得的4-反式溴甲基环己烷甲酸甲酯制备。用等量的氢氧化钠皂化酯，随后萃取至乙酸乙酯中以及干燥，这提供了游离酸。用如上含二甲硫醚的tfa进一步处理游离酸以得到期望的sultane，其从乙醚中沉淀出。
a)反式-(4-氨甲基)环己烷-1-甲酸甲酯盐酸盐[txa-ome.hcl]的合成。通过两条途径示出氨甲环酸(txa)的锍类似物的合成。两条途径共有的是txa转化成其甲酯，随后通过桑德迈尔反应(sandmeyerreaction)转化成相应的4-羟甲基化合物。这通过下述实现：首先用催化过量(10+mmole)的亚硫酰氯处理txa(20mmole)的甲醇溶液(以生成甲醇hcl)，并将溶液保持回流1小时。通过蒸发去除溶剂以得到txa甲酯盐酸盐。
b)反式-(4-羟甲基)环己烷-1-甲酸甲酯[thmx-ome]的合成。将以上获得的产物txa甲酯盐酸盐(12mmole)溶解在冷的亚硝酸钠水溶液中，随后酸化冷溶液，以及一旦氮气释放停止，使溶液升温至室温。将产物萃取至乙酸乙酯中，并且通常的处理提供70％收率的产物羟甲基甲酸甲酯。
c)反式-(4-氯甲基)环己烷-1-甲酸甲酯[cmx-ome]的合成：将以上获得的羟甲基甲酯(4mmole)溶解在氯仿中并冷却至-10°。历经30min，向乙醇的冷溶液等份添加亚硫酰氯(10mmole)，之后使搅拌的反应混合物回到室温，并放置过夜。将反应混合物倒入水(100ml)中，并用氯仿萃取，经硫酸镁干燥并通过蒸发去除溶剂以提供氯甲酯。
d)反式-(4-二甲基硫代甲基)环己烷-1-甲酸甲酯碘化锍[txas]的合成：将在上文6中获得的氯甲酯溶解在三氟乙酸中，并用过量的碘化钾过夜处理搅拌的溶液。将tfa溶液从不溶性盐中滤出，并向其添加两倍摩尔过量的二甲硫醚，同时升温回流。在反应2小时后，用冷的二乙醚处理该溶液，于是在过滤、用乙醚洗涤和风干后获得呈灰白色粉末的沉淀产物碘化锍。
作为txa-s的合成的替代途径如下文所概述和描述。在该实例中，将上文获得的4-反式羟甲基环己烷甲酸甲酯转化成其o-甲磺酰基硫酸酯，随后用二甲硫醚烷基化以在皂化和酸化之后获得期望的sultaine盐产物：
e)反式-(4-o-甲磺酰基羟甲基)环己烷-1-甲酸甲酯[mhmx_ome]的合成：将上文获得的羟甲基甲酯(4mmole)溶解在吡啶中并冷却至-10°。历经30min，向乙醇的冷溶液等份添加甲磺酰氯(10mmole)，随后使搅拌的反应混合物回到室温，并放置过夜。将反应混合物倒入冷水(100ml)中，用乙酸乙酯萃取，洗涤有机层并从水中反复萃取，最终经硫酸镁干燥以得到产物(2mmole)。作为替代，对甲苯磺酰氯可以通过类似方案替代甲磺酰氯。
f)反式-(4-二甲基硫代甲基)环己烷-1-甲酸甲酯碘化锍[dmtxome]的合成：将在上文6中获得的氯甲酯溶解在三氟乙酸中，并用过量的碘化钾过夜处理搅拌的溶液。将tfa溶液从不溶性盐中滤出，并向其添加两倍摩尔过量的二甲硫醚，同时升温回流。在反应2小时后，用冷的二乙醚处理该溶液，于是在过滤、用乙醚洗涤和风干后获得呈灰白色粉末的沉淀产物碘化锍。
g)反式-(4-二甲基硫代甲基)环己烷-1-甲酸氯化锍[txa-s]的合成：将获自上述两个程序的产物锍盐合并，并将一部分(约4mmole)溶解在乙醇中。将溶液在冰浴中冷却，并历经30分钟向其等份添加摩尔当量的乙醇氢氧化钠。使混合物达到室温，同时搅拌，并用过量的乙醇盐酸处理，使钠盐沉淀，通过过滤去除所述钠盐。向过滤的乙醇溶液添加冷的乙醚以使产物氯化锍沉淀，将所述产物氯化锍过滤、用冷的乙醚洗涤并风干。
除了上述两种方法之外，也可以经由许多其它途径制备txa-s，一些途径在文献中描述，而另一些途径适于已建立的化学合成方法。其中前者是开始于对苯二甲酸单腈(terriphthalicacidmononitrile)的那些以及基于相应的对位取代的苯的氢化的方法。例如，4-甲基硫代甲基苯甲酸的在高压下的氢化可以提供相应的环己烷化合物，其在用甲基碘、或其它烷基碘或甲苯磺酰酯、甲磺酰酯或三氟甲磺酰酯烷基化后也将得到期望的sultane。
b.赖氨酰水杨酸酯(ivb)：赖氨酸的水杨酸酯以及其它氨基酸的水杨酸酯与其它氨基酸水杨酸酯一样，通过用水杨酸叔丁酯的酚基将用于肽合成的tboc保护的氨基酸(具有酸不稳定的侧链保护基团)酯化来制备。在第一实例中，用相等部分的含二环己基碳二亚胺的二氯甲烷处理溶解在乙腈中的二tboc赖氨酸(10mmol)和商购获得的水杨酸叔丁酯(否则由叔丁基溴和水杨酸银来制备)(10mmol)。使反应继续，同时在室温下搅拌2-4小时，随后，通过过滤去除沉淀的二环己脲，以及在减压下从溶剂中干燥保护的酯。将产物用5％的碳酸氢钠洗涤并经硫酸镁干燥之后，用冷的含50％三氟乙酸的乙醚处理，以及通过过滤获得呈其二三氟乙酸盐的沉淀的产物赖氨酰水杨酸酯。
c.n-(2-n’,n’二甲氨基乙基)β-丙氨酸叔丁酯:如下制备该中间体。将β丙氨酸叔丁酯(10mmol)溶解在酒精碳酸钠(0.1m)中，向其添加10mmol2-n’,n’二甲胺基溴乙烷氢溴酸盐，并在室温下搅拌，同时监测ph并根据需要利用添加氢氧化钠水溶液(1m)将ph维持在8.5至9.0。在碱消耗停止后，冻干反应混合物，并将产物置于丙醇中，不含无机盐。
如下制备n-(2-n’,n’二甲氨基乙基),n-琥珀-(2’-n”羟基琥珀酰亚胺酯)酰氨基丙氨酸β-叔丁酯。将n-(2-n’,n’二甲氨基乙基)β-丙氨酸叔丁酯(4mmol)溶解在乙腈中，并在乙腈中向其添加琥珀酸、二n羟基琥珀酰亚胺酯(4mmole)。使反应在室温进行2小时，同时搅拌。
d.n-(2-n’,n’二甲氨基乙基),n-琥珀-(2’-7-氨基放线菌素酰胺)酰氨基β丙氨酸(vb)：取出1/4等份的上述反应混合物，向其添加7-氨基放线菌素c(1mmol)，同时连续搅拌，并允许进行进一步反应过夜。将反应混合物倒入冷水中，通过萃取至乙酸乙酯获得产物叔丁酯，经硫酸镁干燥，并在减压下干燥。通过用聚苯乙烯磺酸树脂处理酯在乙腈中的溶液来去除叔丁酯基团，以及在从树脂过滤后通过去除溶剂获得终产物。
e.n-(2-n’,n’二甲氨基乙基),n-琥珀-(2’-精氨酰甘氨酰天冬氨酰基酰胺)酰氨基β丙氨酸(vc)：用三肽精氨酰甘氨酰天冬氨酰基酰胺(rgd酰胺,3mmol)处理来自上述#9的残余反应混合物，并允许进一步进行反应过夜。如上述#10中的处理提供60％收率的产物三肽衍生物。
f.d-α-含氘甘氨酰天冬氨酰基酰胺(vib):如上述#2中针对d-α-含氘甘氨酰β-丙氨酸(1aa)所述获得该目标二肽酰胺，除了使用天冬氨酸β-叔丁基酯酰胺代替β-丙氨酸。也与先前一样去除保护性酯基，提供了70％收率的二肽酰胺。
生化分析：体外纤维蛋白溶解分析
下述实验尝试确定作为基于氨基己酸(aca)和氨甲环酸(txa)的抗纤维蛋白溶解疗法的替代物制备的一些合成化合物的相对抑制作用。这些分析的原理和程序如下。
a)这些纤维蛋白溶解分析中联合的酶反应：分析由四个主要的反应组成。存在以下反应：
(a)凝血酶催化的纤维蛋白原至不溶性纤维蛋白凝块的转化。可溶性人纤维蛋白原为这些分析的成分。通过添加人凝血酶起始分析，引起纤维蛋白原的已知部分蛋白水解以产生纤维蛋白，其聚合以得到不溶性不透明“凝块”。这与生理上获得的纤维蛋白凝块不同，因为它缺乏生理凝块的许多性质。然而，它具有血液凝块的基本成分不溶性纤维蛋白聚合物。
(b)纤溶酶原与聚合的纤维蛋白的结合。人纤溶酶原为这些分析的混合物的成分。已知其以非常高的亲和力结合不溶性聚合的纤维蛋白，而对纤维蛋白原具有弱的多的亲和力。虽然溶液中的纤溶酶原通过其激活物被激活成纤溶酶，但已明确确定与纤维蛋白结合的纤溶酶原以比溶液中纤溶酶原更高数量级的速率被相同激活物激活。
(c)尿激酶(uk)或组织纤溶酶原激活物(tpa)催化的纤维蛋白结合的纤溶酶原至纤溶酶的转化。uk或tpa为完全分析孵育混合物的一部分，使得纤溶酶原可以被激活成纤维蛋白溶解酶纤溶酶，并且通过其对不溶性纤维蛋白的作用溶解这些分析过程中形成的纤维蛋白凝块。
(d)在这些分析过程中产生的纤溶酶对形成的纤维蛋白凝块的作用：在分析孵育(uk或tpa)中存在的纤溶酶原激活物激活分析中包含的纤溶酶原，选择性激活与分析过程中形成的纤维蛋白结合的纤溶酶原。
b)分析混合物的组成及其成分。这些纤维蛋白溶解分析具有下述成分；全部在由100mmolarnacl、10mmolarcacl2、50mmolarhepes-naoh的缓冲液(ph7.4，在37°下)中制备。所有成分均以适当较高储备液浓度制备，从中取出等分试样并混合至400μl的终体积。包含的成分及其最终(分析)浓度为：纤维蛋白原(8μmolar)、纤溶酶原(0.2μmolar)、uk(10nmolar)或tpa(5nmolar)、凝血酶(500nih单位)以及纤维蛋白溶解抑制剂(如果包括的话(50μmolar，或在5μmolar至5mmolar变化的浓度))。
c)分析方案。在96孔微量滴定板中进行分析。将板放置在维持于37°的读板仪样品室中。在进行或不进行纤维蛋白溶解抑制剂与感兴趣的蛋白预孵育过夜的情况下进行分析。这两个方案如下：
(a)在不进行预孵育的情况下的实验：这些分析由如下构成：将等份的纤维蛋白原和纤溶酶原添加至分析孔中，随后添加感兴趣的纤维蛋白溶解抑制剂化合物和足够的缓冲液以使体积达到380μl。混合并搅拌分析溶液，并将微量滴定板置于读板仪上。通过递送含有凝血酶以及尿激酶或tpa的溶液(20μl)起始分析。以30秒的间隔记录在405nm下测量的分析孔的吸光度(由于形成白色凝胶样纤维蛋白凝块而导致孔的不透明所引起的)。
(b)进行蛋白与抗纤维蛋白溶解化合物预孵育的实验：用如上构成的分析溶液进行这些实验，至380μl体积的，并将分析溶液在室温保持密封过夜(16小时)。在预孵育后，将分析溶液在读板仪中升温至37°，并如上文(a)进行分析，由添加凝血酶以及tpa或尿激酶起始。
图1中示出了抗纤维蛋白溶解剂在减缓凝块溶解中的作用，其示出了从上述方案3(a)和3(b)中描述的联合的纤维蛋白溶解分析获得的数据类型。在不存在任何纤维蛋白溶解抑制剂的情况下(对照，以红色显示)，分析混合物的光密度迅速增加，其在5-10分钟内达到峰值。这表示分析中纤维蛋白的形成。随着纤维蛋白在分析混合物中积聚，其为纤溶酶原提供增加量的结合位点，从而向其激活物酶提供增加量的纤维蛋白结合的纤溶酶原，导致纤溶酶的加速形成和随后的纤维蛋白溶解。因此，观察到分析中存在的纤维蛋白的量的指数衰减。在不存在抗纤维蛋白溶解化合物的情况下，在对照分析中，历经10至30分钟时段示出上述过程。作为一个粗略的近似，这些可以被视为两个连续的指数过程-第一，纤维蛋白或凝块的形成，在第二-凝块分解或纤维蛋白溶解过程。如在这些联合分析中测定的，纤维蛋白溶解抑制剂的功效的粗略度量为在反应第二部分中分析混合物的光密度的伪指数下降的半衰期。通过记录观察到的纤维蛋白溶解半衰期作为纤维蛋白溶解抑制剂浓度的函数，可以获得化合物抑制纤维蛋白溶解，以及通过推断生理溶栓过程的有效性的更精确的度量。出于这些研究的目的，在单一浓度下足以确定相对抑制潜能，以及将其与相同浓度下的aca和txa的抑制作用进行比较。
除了获得关于合成的纤维蛋白溶解抑制剂候选物的抑制数据之外，在这些分析中还在抑制剂化合物(和aca&txa)与蛋白质预孵育之后进行相同分析。已知凝血酶、尿激酶、tpa和纤溶酶原具有至少一个与其结构相关的kringle结构。因为aca和txa均已显示结合kringle结构，并且也已知它们在共同结合位点结合kringle结构(x-射线数据)，所以确定与aca&txa相比，预孵育对合成的抑制剂的抑制功效的影响是重要的。这是因为与这些已建立的抗溶栓剂不同，候选化合物由于具有替代aca和txa中的质子化的铵基团的二甲基锍基团而能够使它们结合的蛋白甲基化，并且因此消除此类化合物以及另外纤维蛋白的结合位点。这是将这些候选化合物设计和合成为抗溶栓剂以替代aca和txa作为抗溶栓治疗剂的主要原理。表1中显示了获得的结果。
表1
这些结果的粗略查阅清晰地显示，这些初步实验表明使用这些锍盐获得的抗纤维蛋白溶解效果比可以通过使用aca或txa产生的抗纤维蛋白溶解效果有效得多。这些观察结果是建立下一代抗纤维蛋白溶解药剂的非常强大且引人注目的基础。