T细胞活化性双特异性抗原结合分子CD3ABD叶酸受体1(FolR1)和PD‑1轴结合拮抗剂的组合疗法的制作方法

序列表本申请含有序列表，其已经以ascii格式电子提交且据此通过援引完整收录。2015年11月11日创建的所述ascii拷贝，名称为32401_sl.txt且大小为527,137字节。发明领域本发明涉及采用t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂及任选的tim3拮抗剂的组合疗法，及这些组合疗法用于治疗癌症的用途。发明背景单克隆抗体是有力的用于治疗癌症的治疗剂，选择性靶向在癌细胞上差异表达的抗原。最近数年对双特异性抗体变得感兴趣，其设计为用一个抗原结合模块结合靶细胞上的表面抗原，而用第二个抗原结合模块结合t细胞受体(tcr)复合物的活化性的，不变的构件。此类抗体对其两种靶物的同时结合会迫使靶细胞和t细胞之间的暂时相互作用，引起任何细胞毒性t细胞活化和随后的靶细胞裂解。因此，免疫应答重定向于靶细胞，而且不依赖于靶细胞的肽抗原呈递或t细胞的特异性，其对于ctl的正常mhc限制性活化会是相关的。在此背景中，至关重要的是ctl仅在靶细胞向其呈递双特异性抗体时活化，即模拟免疫突触。特别期望的是不需要淋巴细胞预条件化或共刺激来引发靶细胞有效裂解的双特异性抗体。关于在某些效应器功能的活化以外tcb如何影响t细胞自身的了解不多。抗原呈递细胞(apc)对静息t淋巴细胞或t细胞的活化看来需要两种信号输入。laffertyetal.,aust.j.exp.biol.med.scl53:27-42(1975)。在主要组织相容性复合体(mhc)的背景中呈递的外来抗原肽的识别后，第一或抗原特异性信号经由t细胞受体(tcr)转导。第二或共刺激信号通过抗原呈递细胞(apc)上表达的共刺激分子投递至t细胞，并且促进t细胞克隆扩充，细胞因子分泌和效应器功能。lenschowetal.,ann.rev.immunol.14:233(1996)。在缺乏共刺激的情况中，t细胞能对抗原刺激变得不应，不发起有效的免疫应答，并且可以导致对外来抗原的耐受性或耗竭。t细胞能接受正和负第二共刺激信号二者。正和负信号的平衡对于在维持免疫耐受性和防止自身免疫的同时引发有效的免疫应答是重要的。负第二信号对于诱导t细胞耐受性看来是必需的，而正信号促进t细胞活化。最近，已经发现了t细胞功能障碍或无反应性与抑制性受体(编程性死亡1多肽(pd-1))的诱导的且持续的表达并行发生。它的配体之一，pd-l1在许多癌症中过表达，并且经常与不良预后关联(okazakitetal.,intern.immun.2007,19(7):813；thompsonrhetal.,cancerres2006,66(7):3381)。令人感兴趣地，与正常组织中的t淋巴细胞和外周血t淋巴细胞形成对比，大多数肿瘤浸润性t淋巴细胞主要表达pd-1，这指示肿瘤反应性t细胞上pd-1的上调可以促成受损的抗肿瘤免疫应答(blood2009114(8):1537)。含有t细胞免疫球蛋白和粘蛋白域的分子3(tim3)在免疫调节中是重要的。这种细胞表面蛋白质优先由1型t辅助细胞表达，而且已经与巨噬细胞活化的调节，炎性状况和癌症联系起来(majetiretal.,pnas,106(2009)3396-3401及wo2009/091547)。tim-3对它的配体之一(例如半乳凝集素-9)的结合能通过诱导编程性细胞死亡而阻抑th1应答，由此支持外周耐受。用tim-3sirna或抗tim-3拮抗剂抗体处理提高来自cd4阳性t细胞的干扰素α分泌，支持tim-3在人t细胞中的抑制性作用。抗tim-3单克隆抗体的例子包括wo2013/06490及us2012/189617(ngiowetal.,cancerres7:6567(2011))中公开的。folr1表达在多种起源的肿瘤细胞上，例如卵巢和肺癌。已经描述了以治疗性抗体，诸如farletuzumab，抗体-药物缀合物，或过继性t细胞疗法靶向folr1来对肿瘤成像的数种办法(kandalaftetal.,jtranslmed.2012aug3；10:157.doi:10.1186/1479-5876-10-157；vandametal.,natmed.2011sep18；17(10):1315-9.doi:10.1038/nm.2472；cliftonetal.,humvaccin.2011feb；7(2):183-90.epub2011feb1；kelemenetal.，intjcancer.2006jul15；119(2):243-50；vaitilingametal.,jnuclmed.2012jul；53(7)；tengetal.,2012aug；9(8):901-8.doi:10.1517/17425247.2012.694863.epub2012jun5)。已经进行了一些尝试以靶向叶酸受体和cd3的构建物来靶向叶酸受体阳性肿瘤(kranzetal.,procnatlacadsciusa.sep26,1995；92(20):9057-9061；royetal.，advdrugdelivrev.2004apr29；56(8):1219-31；huitingcuietalbiolchem.aug17,2012；287(34):28206-28214；lamersetal.,int.j.cancer.60(4):450(1995)；thompsonetal.,mabs.2009jul-aug；1(4):348-56.epub2009jul19；mezzanzancaetal.,int.j.cancer,41,609-615(1988))。仍然需要用于治疗各种癌症，稳定化各种癌症，预防各种癌症，和/或延迟各种癌症形成的此类最佳疗法。发明概述宽泛而言，本发明涉及组合叶酸受体1(folr1)靶向性抗原结合位点与靶向cd3的第二抗原结合位点的双特异性抗体及其与pd-1轴结合拮抗剂组合，例如用于治疗癌症的用途。在一个实施方案中，该组合进一步包含tim3拮抗剂。本发明的方法和组合能够实现增强的免疫疗法。胜过常规治疗的优势在于与pd-1轴结合拮抗剂和任选的tim3拮抗剂的组合所致只在folr1表达的部位处诱导t细胞活化的特异性以及低t细胞介导活性(也称作t细胞耗竭)的减轻和/或逆转。因而，在一个方面，本发明提供一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块和能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的第二抗原结合模块。在一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含至少一种选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)氨基酸序列和至少一种选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr。在一个实施方案中，该第一抗原结合模块包含包含seqidno:36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含能够特异性结合folr1的第三抗原结合模块。在一个实施方案中，该能够特异性结合folr1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(cdr)和轻链cdr序列。在一个实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。在一个实施方案中，该第一，第二和第三抗原结合模块中至少一项为fab分子。在一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的抗原结合模块包含至少一种选自由seqidno:16，seqidno:17和seqidno:18组成的组的重链互补决定区(cdr)氨基酸序列和至少一种选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr。在一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的抗原结合模块包含包含seqidno:15的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的抗原结合模块包含至少一种选自由seqidno:8，seqidno:56和seqidno:57组成的组的重链互补决定区(cdr)氨基酸序列和至少一种选自seqidno:59，seqidno:60，seqidno:65的组的轻链cdr。在一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的抗原结合模块包含包含seqidno:55的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:64的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的抗原结合模块包含至少一种选自由seqidno:8，seqidno:9和seqidno:50组成的组的重链互补决定区(cdr)氨基酸序列和至少一种选自seqidno:52，seqidno:53，seqidno:54的组的轻链cdr。在一个实施方案中，该能够特异性结合folr1的抗原结合模块包含：(a)seqidno:8的互补决定区重链1(cdr-h1)氨基酸序列；(b)seqidno:9的cdr-h2氨基酸序列；(c)seqidno:50的cdr-h3氨基酸序列；(d)seqidno:52的互补决定区轻链1(cdr-l1)氨基酸序列；(e)seqidno:53的cdr-l2氨基酸序列；和(f)seqidno:54的cdr-l3氨基酸序列。在一个此类实施方案中，该能够特异性结合folr1的抗原结合模块包含包含seqidno:49的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:51的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人folr1，食蟹猴folr1和鼠folr1。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导人cd3阳性t细胞增殖。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导人外周血单个核细胞介导的对folr1表达性人肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导t细胞介导的对folr1表达性人肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以介于约36pm和约39573pm之间的ec50诱导t细胞介导的对folr1表达性人肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子诱导t细胞上cd25和cd69中至少一项的细胞表面表达的上调，如通过流式细胞术测量的。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子以约5.36pm至约4nm的表观kd结合人folr1。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子以约4nm的表观kd结合人和食蟹猴folr1。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子以约1.5nm的表观kd结合鼠folr1。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子以至少约1000nm的单价结合kd结合人folr1。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人肿瘤细胞上表达的folr1。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人folr1上的构象表位。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子不结合人叶酸受体2(folr2)或人叶酸受体3(folr3)。在一个实施方案中，该抗原结合模块结合包含人folr1(seqidno:227)的氨基酸25至234的folr1多肽。在一个实施方案中，该folr1抗原结合模块结合包含seqidno:227，230和231的氨基酸序列的folr1多肽，且其中该folr1抗原结合模块不结合包含seqidno:228和229的氨基酸序列的folr多肽。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含a)与包含seqidno:49的可变重链域(vh)和seqidno:51的可变轻链域的参照抗体竞争结合人folr1的第一抗原结合位点；和b)与包含seqidno:36的可变重链域(vh)和seqidno:31的可变轻链域的参照抗体竞争结合人cd3的第二抗原结合位点，其中结合竞争是使用表面等离振子共振测定法测量的。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含形成第一，第二和第三抗原结合模块的第一，第二，第三，第四和第五多肽链，其中该第一抗原结合模块能够结合cd3且该第二和该第三抗原结合模块均能够结合叶酸受体1(folr1)，其中a)该第一和该第二多肽链以氨基(n)端至羧基(c)端方向包含vld1和cld1；b)该第三多肽链以n端至c端方向包含vld2和ch1d2；c)该第四多肽链以n端至c端方向包含vhd1，ch1d1，ch2d1和ch3d1；d)该第五多肽链包含vhd1，ch1d1，vhd2，cld2，ch2d2和ch3d2；其中vld1为第一轻链可变域vld2为第二轻链可变域cld1为第一轻链恒定域cld2为第二轻链恒定域vhd1为第一重链可变域vhd2为第二重链可变域ch1d1为第一重链恒定域1ch1d2为第二重链恒定域1ch2d1为第一重链恒定域2ch2d2为第二重链恒定域2ch3d1为第一重链恒定域3ch3d2为第二重链恒定域3。在一个此类实施方案中，该第三多肽链和该第五多肽链的vhd2和cld2形成该能够结合cd3的第一抗原结合模块；该第一多肽链和该第四多肽链的vhd1和ch1d1形成该能够结合folr1的第二结合模块；且该第二多肽链和该第五多肽链的vhd1和ch1d1形成该能够结合folr1的第三结合模块。在一个此类实施方案中，该第一和第二多肽链包含seqidno:399的氨基酸序列。在一个此类实施方案中，该第三多肽链包含seqidno:86的氨基酸序列。在一个此类实施方案中，该第四多肽链包含seqidno:394的氨基酸序列。在一个此类实施方案中，该第五多肽链包含seqidno:397的氨基酸序列。在一个实施方案中，该第一和第二多肽链包含seqidno:399的氨基酸序列；该第三多肽链包含seqidno:86的氨基酸序列；该第四多肽链包含seqidno:394的氨基酸序列；且该第五多肽链包含seqidno:397的氨基酸序列。在一些实施方案中，该双特异性抗体对于folr1和cd3二者均是二价的。一些实施方案中，该双特异性抗体包含一个或多个包含对cd3特异性的抗原结合位点的fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区是交换的。在一些实施方案中，该双特异性抗体包含fc域，至少一个包含对folr1特异性的抗原结合位点的fab片段，和至少一个包含对cd3特异性的抗原结合位点的fab片段，其中至少一个fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。在一些实施方案中，该双特异性抗体包含：a)fc域，b)均包含对folr1特异性的抗原结合位点的第一和第二fab片段，c)包含对cd3特异性的抗原结合位点的第三fab片段，其中该第三fab片段在可变重链(vh)的c端处连接至该fc域的第二亚基，且其中该第三fab片段在可变重链的n端处连接至该第二fab片段的c端。在一个实施方案中，所述fab片段中至少一项经肽接头连接至该fc域。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含fc域，其包含一处或多处降低对fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。在一个实施方案中，所述一处或多处氨基酸替代在一个或多个选自l234，l235，和p329的组的位置处。在一个实施方案中，该fc域的每个亚基包含三处消除对活化性或抑制性fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为l234a，l235a和p329g。在一些实施方案中，该pd-1轴结合拮抗剂选自由pd-1结合拮抗剂，pdl1结合拮抗剂和pdl2结合拮抗剂组成的组。在一些实施方案中，该pd-1轴结合拮抗剂为pd-1结合拮抗剂。在一些实施方案中，该pd-1结合拮抗剂抑制pd-1结合它的配体结合配偶。在一些实施方案中，该pd-1结合拮抗剂抑制pd-1结合pdl1。在一些实施方案中，该pd-1结合拮抗剂抑制pd-1结合pdl2。在一些实施方案中，该pd-1结合拮抗剂抑制pd-1结合pdl1和pdl2二者。在一些实施方案中，该pd-1结合拮抗剂为抗体。在一些实施方案中，该抗pd-1抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗pd-1抗体为选自由fab，fab’-sh，fv，scfv，和(fab’)2片段组成的组的抗体片段。在一些实施方案中，该pd-1结合拮抗剂为nivolumab，pembrolizumab，ct-011，或amp-224。在一些实施方案中，该pd-1轴结合拮抗剂为pdl1结合拮抗剂。在一些实施方案中，该pdl1结合拮抗剂抑制pdl1结合pd-1。在一些实施方案中，该pdl1结合拮抗剂抑制pdl1结合b7-1。在一些实施方案中，该pdl1结合拮抗剂抑制pdl1结合pd-1和b7-1二者。在一些实施方案中，该pdl1结合拮抗剂为抗pdl1抗体。在一些实施方案中，该抗pdl1抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗pdl1抗体为选自由fab，fab’-sh，fv，scfv，和(fab’)2片段组成的组的抗体片段。在一些实施方案中，该抗pdl1抗体为人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，该pdl1结合拮抗剂选自由yw243.55.s70，mpdl3280a，mdx-1105，和medi4736组成的组。在一些实施方案中，该抗pdl1抗体包含包含seqidno:289的hvr-h1序列，seqidno:290的hvr-h2序列，和seqidno:291的hvr-h3序列的重链；和包含seqidno:292的hvr-l1序列，seqidno:293的hvr-l2序列，和seqidno:294的hvr-l3序列的轻链。在一些实施方案中，该抗pdl1抗体包含包含seqidno:280或seqidno:281的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:383的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，该抗pdl1抗体包含包含seqidno:278的氨基酸序列的重链和/或包含seqidno:279的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，该pd-1轴结合拮抗剂为pdl2结合拮抗剂。在一些实施方案中，该pdl2结合拮抗剂为抗体。在一些实施方案中，该抗pdl2抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗pdl2抗体为选自由fab，fab’-sh，fv，scfv，和(fab’)2片段组成的组的抗体片段。在一些实施方案中，该pdl2结合拮抗剂为免疫粘附素。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的方法进一步包括对该个体施用t细胞免疫球蛋白粘蛋白3(tim3)拮抗剂。在一个实施方案中，该tim3拮抗剂为抗tim3抗体。在一个实施方案中，该抗tim3抗体于37℃120分钟后诱导至少45％的tim3表达性细胞上tim3的内在化，其中内在化是通过facs分析测量的。在一个实施方案中，该抗tim3抗体具有下述特性中的一项或多项：a)与包含seqidno:7的vh和seqidno:8的vl的抗tim3抗体竞争结合tim3b)结合人和食蟹猴tim3c)作为免疫缀合物对tim3表达性细胞显示细胞毒性活性d)诱导干扰素-γ释放。在一个实施方案中，该抗tim3抗体具有下述特性中的一项或多项：a.与包含seqidno:7的vh和seqidno:8的vl的抗tim3抗体竞争结合tim3b.结合人和食蟹猴tim3c.作为免疫缀合物对tim3表达性细胞显示细胞毒性活性d.诱导干扰素-γ释放。在一个实施方案中，该抗tim3抗体为单克隆抗体。在一个实施方案中，该抗tim3抗体为人，人源化，或嵌合抗体。在一个实施方案中，该抗tim3抗体为结合tim3的抗体片段。在一个实施方案中，该抗tim3抗体为fab片段。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含：a)(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:307的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3；或b)(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:314的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3；或c)(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:315的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3；或d)(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:316的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:317的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:318的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:319的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:320的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:321的氨基酸序列的hvr-l3；或e)(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:324的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:325的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:326的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:327的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:328的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:329的氨基酸序列的hvr-l3；或。f)(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:332的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:333的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:334的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:335的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:336的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:337的氨基酸序列的hvr-l3；或g)(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:340的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:341的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:342的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:343的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:344的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:345的氨基酸序列的hvr-l3；或h)(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:348的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:349的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:350的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:351的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:352的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:353的氨基酸序列的hvr-l3；或i)(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:356的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:357的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:358的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:359的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:360的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:361的氨基酸序列的hvr-l3；或j)(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:364的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:365的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:366的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:367的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:368的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:369的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体为具有突变s228p，l235e和p329g的全长igg1抗体，依照kabat编号方式的eu索引。在一个实施方案中，该抗tim3抗体为wo2011/155607，wo2013/006490，wo03/063792，wo2009/097394，和wo2011/159877中描述的抗体中任一项。在一个实施方案中，该抗tim3抗体为f38-2e2。在一个实施方案中，该癌症含有akras野生型。在一个实施方案中，该癌症含有活化性kras突变。在一个实施方案中，该治疗在该治疗停止后在该个体中导致持久响应。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子和该pd-1轴结合拮抗剂中至少一项是连续施用的。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子和该pd-1轴结合拮抗剂中至少一项是间歇施用的。在一个实施方案中，该pd-1轴结合拮抗剂在该folr1tcb之前施用。在一个实施方案中，该pd-1轴结合拮抗剂与该folr1tcb同时施用。在一个实施方案中，该pd-1轴结合拮抗剂在该folr1tcb之后施用。在一个实施方案中，该癌症选自由卵巢癌，肺癌，乳腺癌，肾癌，结直肠癌，子宫内膜癌组成的组。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子和该pd-1轴结合拮抗剂中至少一项是静脉内，肌肉内，皮下，表面，口服，经皮，腹膜内，眶内，通过植入，通过吸入，鞘内，室内，或鼻内施用的。在一个实施方案中，该个体中的t细胞具有相对于施用该组合之前增强的活化，增殖和/或效应器功能。在一个实施方案中，该个体中的t细胞具有相对于单独施用该t细胞活化性双特异性抗原结合分子增强的活化，增殖和/或效应器功能。在一个实施方案中，t细胞效应器功能为分泌il-2，ifn-γ和tnf-α中至少一项。在一个实施方案中，该个体包含少于约15％的pd-1高表达性肿瘤浸润性t细胞。在一个方面，本发明提供一种在具有folr1阳性癌症的个体中增强免疫功能的方法，其包括对该个体施用有效量对叶酸受体1(folr1)和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂的组合。在一个实施方案中，该个体中的t细胞具有相对于施用该组合之前增强的活化，增殖和/或效应器功能。在一个实施方案中，该个体中的t细胞具有相对于单独施用该t细胞活化性双特异性抗原结合分子增强的活化，增殖和/或效应器功能。在一个实施方案中，t细胞效应器功能为分泌il-2，ifn-γ和tnf-α中至少一项。在一个实施方案中，该个体包含少于约15％的pd-1高表达性肿瘤浸润性t细胞。在另一个方面，本发明提供一种用于为对叶酸受体1(folr1)和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂的组合治疗选择患者的方法，其包括测量pd-1表达的水平，其中为该组合治疗选择具有少于约15％的pd-1高表达性t细胞的患者。在另一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含对叶酸受体1(folr1)和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子及包装插页，该包装插页包含关于与pd-1轴结合拮抗剂一起使用该t细胞活化性双特异性抗原结合分子在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的用法说明书。在一个实施方案中，该试剂盒进一步包含关于与tim3拮抗剂一起使用该t细胞活化性双特异性抗原结合分子的用法说明书。在另一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含对叶酸受体1(folr1)和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂及包装插页，该包装插页包含关于使用该t细胞活化性双特异性抗原结合分子和该pd-1轴结合拮抗剂在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的用法说明书。在一个实施方案中，该试剂盒进一步包含tim3拮抗剂。在一个实施方案中，该pd-1轴结合拮抗剂为抗pd-1抗体或抗pdl-1抗体。在一个实施方案中，该pd-1轴结合拮抗剂为抗pd-1免疫粘附素。在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含对叶酸受体1(folr1)和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，pd-1轴结合拮抗剂和药学可接受载剂。在一个实施方案中，该药物组合物进一步包含tim3拮抗剂。在另一个方面，本发明提供对叶酸受体1(folr1)和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗卵巢癌，肺癌，乳腺癌，肾癌，结直肠癌，子宫内膜癌。在本发明的所有方面的某些实施方案中，有利的是，所述t细胞活化性双特异性抗原结合分子和/或pd-1轴结合拮抗剂是人的或人源化的。在一些实施方案中，该双特异性抗体包含fc域，至少一个包含对folr1特异性的抗原结合位点的fab片段，和至少一个包含对cd3特异性的抗原结合位点的fab片段。在一个方面，本发明提供一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和tim3拮抗剂。在一些实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含fc域，两个均包含对folr1特异性的抗原结合位点的fab片段，和一个包含对cd3特异性的抗原结合位点的fab片段。在又一个方面，本发明提供结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途。在又一个方面，本发明提供结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，pd-1轴结合拮抗剂和tim3拮抗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途。现在会参考附图通过举例而非限制的方式描述本发明的实施方案。然而，鉴于本公开文本，本发明的各种别的方面和实施方案对于本领域技术人员会是显而易见的。“和/或”在本文中使用时要视为具体公开两个规定特征或组件的每一个，具有或没有另一个。例如，“a和/或b”要视为具体公开(i)a，(ii)b和(iii)a和b中的每一个，就像在本文中单独列出每一个一样。除非上下文另有规定，上文列出的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，而且同等地应用于所描述的所有方面和实施方案。附图简述图1a-i图示本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子(tcb)的例示性构造。除(图1i)中的κ-λ型式以外的所有构建物均具有p329glala突变且包含具有节入穴修饰的节入穴fc片段。(图1a)“folr1tcb2+1倒转的(共同轻链)”的图示。folr1结合物在fab重链的c端融合至包含节修饰的fc域的第一亚基的n端。这些构建物不是交叉的且具有三份相同的vlcl轻链。(图1b)“folr1tcb1+1头至尾(共同轻链)”的图示。这些构建物不是交叉的且具有两份相同的vlcl轻链。(图1c)“folr1tcb1+1经典的(共同轻链)”的图示。这些构建物不是交叉的且具有两份相同的vlcl轻链。(图1d)“folr1tcb2+1经典的(共同轻链)”的图示。cd3结合物在fab重链的c端融合至包含节修饰的fc域的第一亚基的n端。这些构建物不是交叉的且具有三份相同的vlcl轻链。(图1e)“folr1tcb2+1crossfab经典的”的图示。这些构建物对于cd3结合物包含ck-vh链代替常规的ch1-vh链。cd3结合物在fab重链的c端融合至包含节修饰的fc域的第一亚基的n端。(图1f)“folr1tcb2+1crossfab倒转的”的图示。这些构建物对于cd3结合物包含ck-vh链代替常规的ch1-vh链。folr1结合物在fab重链的c端融合至包含节修饰的fc域的第一亚基的n端。(图1g)“folr1tcb1+1crossfab头至尾”的图示。这些构建物对于cd3结合物包含ck-vh链代替常规的ch1-vh链。(图1h)“folr1tcb1+1crossfab经典的”的图示。这些构建物对于cd3结合物包含ck-vh链代替常规的ch1-vh链。图1i图示cd3/folr1κ-λ抗体型式。这些构建物包含交叉的共同轻链vlch1和一个对cd3特异性的交叉的vhcl链和一个对folr1特异性的交叉的vhcl链。图2a-c描绘汇总folr1igg结合物对hela细胞的结合的图。通过流式细胞术测定新生成的folr1结合物对hela细胞上表达的folr1的结合。用荧光标记的抗人二抗检测结合的抗体。图3a-b描绘汇总folr1结合物对folr1的特异性的图。通过流式细胞术分析folr1igg对用folr1或folr2任一瞬时转染的hek细胞的结合以鉴定特异性结合folr1且不结合folr2的克隆。用荧光标记的抗人二抗检测抗体。图4a-b描绘汇总folr1结合物对cyfolr1的交叉反应性的图。通过流式细胞术在用cyfolr1瞬时转染的hek细胞上解析folr1抗体对食蟹猴folr1的交叉反应性。用荧光标记的抗人二抗检测抗体。图5描绘图示结合后folr1tcb的内在化的图。在hela细胞上测试结合folr1后四种folr1tcb的内在化。在于37℃温育指定时间点之后用荧光标记的抗人二抗检测表面上的剩余folr1tcb。计算内在化的百分比。图6a-e描绘汇总folr1igg对具有不同folr1表达水平的细胞的结合的图。通过流式细胞术分析9d11，16d5和mov19igg对具有不同folr1表达水平的肿瘤细胞的结合。包括dp47igg作为同种型对照，且包括mkn-45作为folr1阴性细胞系。用荧光标记的抗人二抗检测抗体。图7a-l描绘汇总t细胞介导的对ht-29和skov3细胞的杀伤的图。使用folr1tcb来测试t细胞介导的对ht-29和skov3肿瘤细胞的杀伤和杀伤后t细胞上活化标志物的上调。(图7a-d)在24小时和48小时之后通过ldh释放测量在9d11folr1tcb和16d5folr1tcb存在下t细胞介导的对ht-29和skov3细胞的杀伤。包括dp47tcb作为阴性对照。在48小时温育之后通过流式细胞术评估skov3(图7e-h)或ht-29(图7i-l)肿瘤细胞杀伤后cd8t细胞和cd4t细胞上活化标志物cd25和cd69的上调。图8描绘显示对红细胞的抗folr1结合的缺失的图。红细胞作为cd235a阳性群体设定门，并通过流式细胞术测定9d11igg，16d5igg，mov19igg和dp47igg对这个群体的结合。用荧光标记的抗人二抗检测抗体。图9a-d描绘汇总全血中的活化标志物上调的图。通过流式细胞术分析在添加9d11folr1tcb，16d5folr1tcb，mov19folr1tcb和dp47tcb之后24小时cd4t细胞和cd8t细胞的cd25和cd69活化标志物上调。图10a-c显示由36f2tcb，16d5tcb，16d5tcb经典的，16d5tcb1+1和16d5tcbht诱导的对hela(高folr1)(图24a)，skov-3(中等folr1)(图24b)和ht-29(低folr1)(图24c)人肿瘤细胞的t细胞杀伤(e:t＝10:1，效应人pbmc，温育时间24小时)。包括dp47tcb作为非结合对照。图11a-b显示肿瘤浸润性t细胞上抑制性受体的表达。通过流式细胞术对肿瘤样品中的cd8+和cd4+t细胞表征它们的抑制性受体表达。图12a-o显示暴露于folr1-tcb后肿瘤消化物和恶性渗出液中cd8+t细胞的活化。将肿瘤消化物或恶性渗出液在folr1-tcb或对照tcbdp-47存在或缺失下培养24小时。通过流式细胞术测定cd8+t细胞上活化标志物或t细胞功能标志物的表达(图12a-m)。图12j-k显示代表性facs图，显示高响应(bs-269)或低响应(bs-212)患者中folr1-tcb诱导的t细胞活化。图12l描绘facs图，显示来自一名代表性患者的t细胞中folr1-tcb诱导的活化标志物表达。图12m中的图以均值和标准偏差描绘folr1-tcb处理后标志物表达的升高。作为比较，将来自健康供体的pbmc与skov3肿瘤细胞系一起共培养，并用folr1-tcb刺激。图12n描绘细胞培养物上清液中的ifn-γ，il-2，tnf和穿孔素，是通过细胞术珠阵列或elisa测定并针对培养物中1x105个cd3+t细胞(ifn-γ，tnf，il-2)或cd3+cd8+t细胞(穿孔素)的量标准化的。图12o显示肿瘤消化物和恶性渗出液中folr1-tcb诱导的肿瘤细胞杀伤大大变化。folr1阳性和阴性肿瘤消化物，恶性渗出液或来自健康供体的pbmc与外源添加的荧光标记的folr1+skov3细胞一起以e:t比1:1在folr1-tcb存在或缺失下共培养24小时。通过测量活化的胱天蛋白酶3和活/死标志物-近ir，通过流式细胞术测定folr1-tcb诱导的对skov3细胞的特异性杀伤。如下计算folr1-tcb介导的杀伤：％特异性杀伤＝100–[(％folr1-tcb处理样品中的skov3活细胞/％未处理样品中的skov3活细胞)x100]。facs图显示一名代表性患者中的folr1-tcb诱导的杀伤。p值是使用不配对mann-whitney检验计算的。图13a-c显示folr1-tcb诱导的t细胞活化显示与e:t比(图13a)或folr1+肿瘤细胞的量(图13b)没有关联。将肿瘤消化物或恶性渗出液在folr1-tcb存在或缺失下培养24小时。folr1-tcb诱导的cd25表达与e:t比或靶细胞的量关联起来。mfi：均值荧光强度。图14a-l显示folr1-tcb诱导的t细胞活化与pd-1和tim-3的表达逆相关。将肿瘤消化物或恶性渗出液在folr1-tcb存在或缺失下培养24小时。通过流式细胞术测定cd8+t细胞上活化标志物或t细胞功能标志物的表达。将folr1-tcb诱导的cd25(图4a-c)，cd137(图14d-f)，icos(图14g-i)和粒酶b(图14j-l)表达与抑制性受体pd-1和tim-3的基线单一或共表达关联起来。图15a-c显示folr1-tcb诱导的il-2分泌与pd-1和tim-3的共表达逆相关。将肿瘤消化物或恶性渗出液在folr1tcb存在或缺失下培养24小时。通过elisa测定细胞培养物上清液中的il-2，并针对t细胞的量标准化。将folr1tcb诱导的il-2分泌与抑制性受体pd-1和tim-3的基线单一或共表达关联起来。图16a-f显示folr1-tcb诱导的肿瘤细胞杀伤与pd-1和tim-3的共表达逆相关。将肿瘤消化物或恶性渗出液与外源添加的荧光标记的skov3细胞一起以t细胞对靶细胞比1:1在folr1tcb存在或缺失下共培养24小时。通过测量活化的胱天蛋白酶3和活/死标志物live/dead-近ir，通过流式细胞术测定folr1-tcb对skov3细胞的特异性杀伤。将特异性杀伤与抑制性受体pd-1，tim-3和ctla-4的基线单一或共表达关联起来。图17a-h显示暴露于catumaxomab后肿瘤浸润性cd8+t细胞的活化。将肿瘤消化物或恶性渗出液在catumaxomab存在或缺失下培养24小时。(图17a-d)通过流式细胞术测定cd8+t细胞上活化标志物或t细胞功能标志物的表达。(图17e-h)显示抑制性受体的基线表达的图。图18a-r显示catumaxomab诱导的t细胞活化与抑制性受体的共表达逆相关。将肿瘤消化物或恶性渗出液在catumaxomab存在或缺失下培养24小时。将t细胞活化和效应器功能与pd-1(图18a-f)，tim-3(图18g-l)或pd-1和tim-3的组合(图18m-r)的表达关联起来。图19a-h显示非小细胞肺癌患者中的肿瘤浸润性t细胞上抑制性受体的表达。通过流式细胞术对肿瘤样品中的cd8+和cd4+t细胞表征它们的抑制性受体表达(图19a-f)。图19g显示用于一名代表性供体的设门策略。图19h显示指定细胞子集基于表达百分比的分析结果和热图绘制，使用excel条件格式程序进行。图20a-e显示cd3/cd28抗体的多克隆刺激后t细胞活化和效应器功能。分析用激动性cd3和cd28抗体刺激整个肿瘤消化物后来自经过消化的肿瘤样品的t细胞中分别作为t细胞活化和效应器功能的标志物的cd25和粒酶b(图20a-b)以及il-2，ifn-γ和tnf-α(图20c-e)的表达。图21a-n显示抑制性受体的表达和t细胞功能障碍。抗cd3/抗-cd28抗体的多克隆刺激后cd25和粒酶b(图21a-b)以及il-2，ifn-γ和tnf-α(图21c-e)的表达与通过ir得分指示的抑制性受体的累积表达有关。图21f显示ir得分的一种例示性计算。分析所有nsclc样品中pd-1，tim-3，ctla-4，lag-3和btla表达的百分比，并确定中值以及四分位间范围。对于ir得分的计算，每名患者得到每种所测定抑制性受体的表达的点，该点基于表达所占的四分位。最多能达到15个点；将每份样品的计算得分针对这个最大点量标准化。图21g-k显示抑制性受体的表达随肿瘤阶段而升高。将cd8+肿瘤浸润性t细胞上抑制性受体的表达与tnm阶段关联起来。图21l-n显示升高的抑制性受体累积表达及肿瘤进展。将以ir得分代表的抑制性受体pd-1，tim-3，ctla-4，lag-3和btla的累积表达与节结状态和tnm阶段关联起来。图22a-i显示pd-1和tim-3的表达与t细胞功能障碍有关。cd3/cd28的多克隆刺激后cd25和粒酶b(图22a-c)以及il-2，ifn-γ和tnf-α(图22d-f)的表达与肿瘤浸润性t细胞上pd-1(图22a-c)，tim-3(图22d-f)或pd-1/tim-3(图22g-i)的表达有关。图23a-e显示pd-1或组合pd-1/tim-3阻断的影响在患者之间变化。用激动性抗cd3/抗cd28抗体刺激消化物，将阻断性抗体添加至单独的或与tim-3组合的pd-1。通过elisa测定ifn-γ，tnf-α和il-2的分泌，并针对1x106个t细胞标准化。图23a-c显示来自t细胞功能能通过添加阻断性抗体(bs-268)来挽救的一名患者的t细胞和来自对pd-1或pd-1/tim-3阻断没有响应的一名患者的t细胞。显示了表达差异([％表达抗体处理的]-[％表达未处理的])。图23d显示pd-1高和pd-1中子集各自的流式细胞术图。图23e显示来自六名患者的t细胞的il-2，tnf-α和ifn-γ分泌的汇总，如通过elisa测定并针对1x106个cd3+t细胞标准化的。图24a-f显示pd-1或组合pd-1/tim-3阻断的影响在pd-1高和pd-1中子集中不同。pd-1或组合pd-1/tim-3阻断引起的细胞因子生成的升高与pd-1高和pd-1中子集的关联以pd-1高/pd-1中比指示。图25a-i显示暴露于folr1-tcb后肿瘤消化物和恶性渗出液中cd4+t细胞的活化。将肿瘤消化物或恶性渗出液在folr1-tcb或对照tcbdp-47存在或缺失下培养24小时。通过流式细胞术测定cd8+t细胞上活化标志物或t细胞功能标志物的表达。图26a-c显示folr1-tcb诱导的t细胞活化不依赖于ctla-4，lag-3和btla表达。将肿瘤消化物或恶性渗出液在folr1-tcb存在或缺失下培养24小时。通过流式细胞术测定cd8+t细胞上cd25的表达。将folr1-tcb诱导的cd25表达与ctla-4，lag-3和btla的基线表达关联起来。图27a-c显示folr1-tcb仅仅在具有低百分比的pd-1高表达性cd8+t细胞的患者中诱导细胞因子分泌。将肿瘤消化物或恶性渗出液在folr1-tcb存在或缺失下培养24小时。测定细胞培养物上清液中的ifn-γ，tnf和il-2，并针对培养物中1x105个t细胞的量标准化。将folr1-tcb诱导的细胞因子分泌与基线pd-1高表达关联起来。图28a-f显示pd-1阻断性抗体的处理未能在来自具有pd-1高表达性细胞百分比低的肺和卵巢癌的患者的肿瘤消化物或恶性渗出液中诱导细胞因子分泌。将肿瘤消化物或恶性渗出液与folr1-tcb一起在pd-1阻断性抗体(图28a-c)或pd-1和tim-3阻断性抗体的组合(图28d-f)存在或缺失下培养24小时。测定细胞培养物上清液中的ifn-γ，tnf和il-2，并针对培养物中1x105个t细胞的量标准化。将与单独的folr1-tcb处理相比由阻断性抗体诱导的细胞因子分泌与基线pd-1高表达联系起来。图29a-b显示来自基于facs的内在化测定法的结果。数据显示于37℃温育后抗tim3抗体tim3_0022(缩写为<tim-3>ab(022))的fab片段(<tim-3>fab)以与完整igg格式的抗体相似的动力学内在化入表达hutim-3的重组chok1细胞。图30a-b显示抗tim3抗体对rpmi-8226细胞的结合(抗体名称克隆0016指抗体tim3_0016，克隆0016指抗体tim3_0016变体(抗体tim3_0018)，克隆0022指抗体tim3_00122，等)。图30b显示抗tim3抗体对pfeiffer细胞的结合(抗体名称克隆0016指抗体tim3_0016，克隆0016指抗体tim3_0016变体(抗体tim3_0018)，克隆0022指抗体tim3_00122，等)。图31显示不同患者aml细胞样品上tim-3的表达水平，根据使用抗tim-3单抗的facs。图32显示nsclc上与til有关的抑制性受体表达的热图。对指定免疫检查点呈阳性的肿瘤浸润性cd8+t细胞上抑制性受体的共表达以热图显示，展示另外的受体的表达的百分比。图33显示nsclc上与til有关的抑制性受体表达的雷达图。对指定免疫检查点呈阳性的肿瘤浸润性cd8+t细胞上抑制性受体的共表达以雷达图显示，指示四种其它受体的均值表达和标准偏差。图34a-d显示表达另外的免疫检查点的pd-1高或pd-1中cd8+t细胞的百分比。每个点代表一份患者样品。p值是使用wilcoxon秩和检验计算的。图35a-f显示肿瘤内t细胞抑制性受体表达和t细胞功能。图35a显示用于鉴定来自两名代表性患者的t细胞的pd-1高，pd-1中，和pd-1阴性cd8+子集的设门策略。图35b显示所分析的肿瘤样品中指定t细胞子集的分布。图35c显示通过抗cd3/cd28刺激诱导的t细胞功能取决于cd8+t细胞的pd-1表达水平。将肿瘤消化物和恶性渗出液在激动性抗cd3/cd28抗体存在或缺失下培养24小时。测定pd-1高贫乏和丰富肿瘤中cd8+t细胞上cd25表达的升高(图35c)和效应器细胞因子ifn-γ，il-2，和tnf的升高(图35d)。p值是使用不配对mann-whitney检验计算的。肿瘤样品依照pd-1高表达性cd8+细胞的百分比分成分别具有pd-1高贫乏和丰富表达的两组(图35e)。通过流式细胞术测定来自肿瘤消化物或恶性渗出液的cd8+t细胞上抑制性受体pd-1，tim-3，ctla-4，lag-3，和btla的表达水平(图35f)。图36a-e显示贫乏和丰富cd8+t细胞的抑制性受体表达样式和百分比。图36a-d显示pd-1高，pd-1中，和pd-1阴性cd8+t细胞上tim-3，ctla-4，lag-3，和btla的共表达。p值是使用单因素anova及bonferroni事后检验计算的。图36e：folr1+肿瘤样品依照pd-1高表达cd8+细胞的百分比分成分别具有pd-1高贫乏和丰富表达的两组。图37a-h显示folr1-tcb诱导的t细胞功能取决于cd8+t细胞的pd-1表达水平。将folr1+肿瘤消化物和恶性渗出液在folr1-tcb存在或缺失下培养24小时。在pd-1高贫乏和丰富的肿瘤中测定cd8+t细胞上活化标志物表达的升高(图37a-c)和效应器细胞因子ifn-γ，il-2，tnf，和穿孔素的升高(图37d-g)。图37h显示靶细胞杀伤。通过添加folr1+skov3细胞系至e:t比1:1来调整folr1阳性和阴性肿瘤样品二者，并比较pd-1高贫乏和丰富肿瘤中的杀伤。p值是使用不配对mann-whitney检验计算的。图38a-e显示pd-1阻断仅仅提高来自pd-1高贫乏肿瘤的t细胞中的细胞因子生成而非它们的溶胞功能。图38a-d：将folr1+肿瘤消化物或恶性渗出液与folr1-tcb一起在pd-1阻断性抗体存在或缺失下培养24小时。通过细胞术珠阵列(cytometricbeadarray)或elisa测定细胞培养物上清液中的ifn-γ，il-2，tnf，和穿孔素，并针对1x105个cd3+t细胞(ifn-γ，il-2，tnf，图38a-c)或cd3+cd8+t细胞(穿孔素，图38d)的量标准化。测定pd-1高贫乏和丰富肿瘤中组合folr1-tcb和抗pd-1处理后细胞因子分泌与单独的folr1-tcb相比的升高。图38e：将肿瘤消化物或恶性渗出液与外源添加的荧光标记的skov3细胞一起以e:t比1:1在pd-1阻断性抗体和folr1-tcb存在或缺失下共培养24小时。比较pd-1高贫乏和丰富肿瘤中抗pd-1抗体所致特异性杀伤的升高。p值是使用不配对mann-whitney检验计算的。图39显示详细的患者特征。图40a-c显示暴露于渐增浓度的folr1-tcb后cd8+t细胞的活化。将pbmc与skov3细胞一起在folr1-tcb或非特异性对照dp-47-tcb存在或缺失下共培养24小时。图40a显示skov3上folr1的表达。阴影柱状图：同种型对照；空心柱状图：抗folr1抗体。图40b：通过流式细胞术测定cd8+t细胞上活化标志物cd25，cd137，和icos的表达。图40c：通过elisa测定细胞培养物上清液中的ifn-γ，il-2，和tnf，并针对1x105个cd3+t细胞的量标准化。发明详述i.定义出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(vl)框架或重链可变域(vh)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，vl受体人框架与vl人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以用解离常数(kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(hvr)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。术语“特异性结合叶酸受体1(folr1)和cd3的双特异性抗体”，“对folr1和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子”和“folr1tcb”在本文中可互换使用，而且指如下的双特异性抗体，其能够以足够亲和力结合folr1和cd3，使得该抗体可用作将cd3+t细胞靶向folr2+靶细胞的治疗剂和/或诊断剂。术语“抗tim3抗体”和“tim3抗体”在本文中同义地用来指特异性结合tim3的抗体。本文中描述的抗tim3抗体指如下的抗体，其能够以足够亲和力结合tim3，尤其是在细胞表面上表达的tim3多肽，使得该抗体可用作诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，特异性结合tim3的抗体结合无关非tim3蛋白质的程度小于该抗体对tim3的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定法(ria)或流式细胞术(facs)测量的。在某些实施方案中，特异性结合tim3的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m至10-13m，例如，10-9m至10-13m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，特异性结合tim3的抗体结合在来自不同物种的dr5间保守的tim3表位。优选地，所述抗体结合人和猕猴tim3。术语“特异性结合tim3的抗体”还涵盖能够结合tim3和第二抗原的双特异性抗体。本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中的如下部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于fv，fab，fab’，fab’-sh，f(ab’)2；双抗体；cross-fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，scfv抗体记载于huston,j.s.,methodsinenzymol.203(1991)46-96。另外，抗体片段包含具有vh域或vl域的特征(即能够与vl域或vh域一起装配成功能性抗原结合位点，并且由此提供全长抗体的抗原结合特性)的单链多肽。如本文中使用的，“fab片段”指包含轻链片段(其包含vl域和轻链恒定域(cl))及vh域和重链第一恒定域(ch1)的抗体片段。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含至少一个fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。由于可变区或恒定区任一的交换，所述fab片段也称作“cross-fab”片段或“xfab”片段或“交换fab”片段。交换fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，fab重和轻链的可变区是交换的，即交换fab分子包含由轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)构成的一条肽链及由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的一条肽链。这种交换fab分子也称作crossfab(vlvh)。另一方面，当fab重和轻链的恒定区交换时，交换fab分子包含由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的一条肽链及由轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)构成的一条肽链。这种交换fab分子也称作crossfab(clch1)。包含交换fab片段的双特异性抗体型式已有描述，例如在wo2009/080252，wo2009/080253，wo2009/080251，wo2009/080254，wo2010/136172，wo2010/145792和wo2013/026831中。“单链fab片段”或“scfab”是由抗体重链可变域(vh)，抗体恒定域1(ch1)，抗体轻链可变域(vl)，抗体轻链恒定域(cl)和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头n端至c端方向具有下述次序之一：a)vh-ch1-接头-vl-cl，b)vl-cl-接头-vh-ch1，c)vh-cl-接头-vl-ch1或d)vl-ch1-接头-vh-cl；且其中所述接头是至少30个氨基酸，优选介于32和50个氨基酸之间的多肽。所述单链fab片段a)vh-ch1-接头-vl-cl，b)vl-cl-接头-vh-ch1，c)vh-cl-接头-vl-ch1和d)vl-ch1-接头-vh-cl经cl域和ch1域之间的天然二硫键稳定化。另外，通过经插入半胱氨酸残基(例如可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100，依照kabat编号方式)生成链间二硫键可以进一步稳定化这些单链fab分子。术语“n端”表示n端最后一个氨基酸，术语“c端”表示c端最后一个氨基酸。“融合”或“连接”表示各成分(例如fab分子和fc域亚基)是通过肽键相连接的，或是直接的或是经由一个或多个肽接头。如本文中使用的，术语“接头”指肽接头且优选是具有长度为至少5个氨基酸，优选长度为5-100个，更优选10-50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(gxs)n(seqidno:384和385)或(gxs)ngm(seqidno:429和430)，其中g＝甘氨酸，s＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3，4，5或6且m＝0，1，2或3)或(x＝4且n＝2，3，4或5且m＝0，1，2或3)，优选地x＝4且n＝2或3，更优选地x＝4且n＝2。在一个实施方案中，所述肽接头是(g4s)2(seqidno:386)。术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，igg类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从n端至c端，每条重链具有可变区(vh)，也称为可变重域或重链可变域，接着是3个恒定域(ch1，ch2和ch3)，也称为重链恒定区。类似地，从n端至c端，每条轻链具有可变区(vl)，也称为可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻(cl)域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称为α(iga)，δ(igd)，ε(ige)，γ(igg)或μ(igm)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(igg1)，γ2(igg2)，γ3(igg3)，γ4(igg4)，α1(iga1)和α2(iga2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个fab分子和fc域组成。与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含特异性结合部分或整个抗原并与部分或整个抗原互补的区域的部分。在抗原较大的情况中，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。术语“嵌合”抗体指其中重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体，其通常通过重组dna技术来制备。包含家兔可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是那些其中恒定区已经自初始抗体的恒定区修饰或改变以生成依照本发明的特性(特别地关于c1q结合/或fc受体(fcr)结合)的。此类嵌合抗体又称为“类转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的dna区段和编码免疫球蛋白恒定区的dna区段的免疫球蛋白基因的表达产物。用于生成嵌合抗体的方法牵涉常规的重组dna和基因转染技术，其是本领域中公知的。参见例如morrison,s.l.等,proc.natl.acad.sci.usa81(1984)6851-6855；美国专利no.5,202,238和5,204,244。在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如at211，i131，i125，y90，re186，re188，sm153，bi212，p32，pb212和lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)c，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。“效应器功能”指那些可归于抗体fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)，fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，细胞表面受体(例如b细胞受体)下调和b细胞活化。如本文中使用的，术语“工程化”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列，糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰，以及这些办法的组合。如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代，缺失，插入和修饰。可以进行取代，缺失，插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低的对fc受体的结合，或与另一种肽的增加的联合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如fc区的结合特征，特别优选非保守性的氨基酸替代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸，3-甲基组氨酸，鸟氨酸，高丝氨酸，5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变，pcr，基因合成等。通过与遗传工程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如，从fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的取代可指示为329g，g329，g329，p329g或pro329gly。药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。本文中术语“fc域”或“fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的c端区域。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。虽然igg重链的fc区的边界可以略微变化，但是人igg重链fc区通常定义为自cys226或pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在fc区的c端赖氨酸(lys447)。除非本文中另外指定，fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照eu编号系统，也称为eu索引，如记载于kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版publichealthservice，nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991的。如本文中使用的，fc域的“亚基”指形成二聚体fc域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的c端恒定区的多肽。例如，iggfc域的亚基包含iggch2和iggch3恒定域。“促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的，具体地，促进联合的修饰包括对期望联合的两个fc域亚基(即fc域的第一和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个fc域亚基的联合。例如，促进联合的修饰可以改变一种或两种fc域亚基的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此，异二聚化在包含第一fc域亚基的多肽和包含第二fc域亚基的多肽之间发生，其在融合至每个亚基的别的组分(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中，促进联合的修饰包含在fc域中的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中，促进联合的修饰包含fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。“框架”或“fr”指除高变区(hvr)残基外的可变域残基。一般地，可变域的fr由4个fr域组成：fr1，fr2，fr3，和fr4。因而，hvr和fr序列在vh(或vl)中一般以如下的顺序出现：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的fc区的重链的抗体。术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。正如关于依照本发明的嵌合和人源化抗体也提及的，如本文中使用的，术语“人抗体”也包含恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性的此类抗体，尤其在c1q结合和/或fcr结合方面，例如通过“类转换”即fc部分的改变或突变(例如自igg1至igg4和/或igg1/igg4突变)。如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备，表达，创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如ns0或cho细胞或者自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或抗体而言转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的vh和vl区的氨基酸序列是虽然自人种系vh和vl序列衍生及与其相关，但可以不天然存在于体内的人抗体种系全集内的序列。“人共有框架”指代表人免疫球蛋白vl或vh框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白vl或vh序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版,nihpublication91-3242,bethesdamd(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于vl，亚组是如kabat等，见上文中的亚组κi。在一个实施方案中，对于vh，亚组是如kabat等，见上文中的亚组iii。“人源化”抗体指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有hvr(例如，cdr)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有fr对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中的恒定区已经另外自初始抗体的恒定区进行过修饰或改变以生成依照本发明的特性(特别地关于c1q结合/或fc受体(fcr)结合)的。在用于本文时，术语“高变区”或“hvr”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个hvr；三个在vh中(h1，h2，h3)，且三个在vl中(l1，l2，l3)。hvr一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(cdr)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性高变环存在于氨基酸残基26-32(l1)，50-52(l2)，91-96(l3)，26-32(h1)，53-55(h2)，和96-101(h3)(chothiaandlesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))。例示性cdr(cdr-l1，cdr-l2，cdr-l3，cdr-h1，cdr-h2和cdr-h3)存在于氨基酸残基24-34(l1)，50-56(l2)，89-97(l3)，31-35b(h1)，50-65(h2)，和95-102(h3)(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice，nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))。高变区(hvr)也称作互补决定区(cdr)，而且这些术语在述及形成抗原结合区的可变区部分时在本文中可交换使用。此特定区域已由kabat等，u.s.dept.ofhealthandhumanservices,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(1983)及由chothia等，jmolbiol196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的cdr意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的cdr的适宜的氨基酸残基在下表a中列出作为比较。涵盖特定cdr的确切残基编号将随着cdr的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定cdr。表a：cdr定义11表a中所有cdr定义的编号方式依照由kabat等(见下文)提出的编号惯例。2如表a中使用的具有小写字母“b”的“abm”指由oxfordmolecular的“abm”抗体建模软件定义的cdr。kabat等还定义针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此“kabat编号”系统用于任何可变区序列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的，“kabat编号方式”指由kabat等,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,“sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”(1983)提出的编号系统。除非另外说明，提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照kabat编号系统。除了vh中的cdr1外，cdr一般包含形成高变环的氨基酸残基。cdr还包含“特异性决定残基”，或“sdr”，其是接触抗原的残基。sdr包含在称作缩短的-cdr，或a-cdr的cdr区内。例示性的a-cdr(a-cdr-l1，a-cdr-l2，a-cdr-l3，a-cdr-h1，a-cdr-h2，和a-cdr-h3)存在于l1的氨基酸残基31-34，l2的50-55，l3的89-96，h1的31-35b，h2的50-58，和h3的95-102(见almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的hvr残基和其它残基(例如，fr残基)在本文中依照kabat等，见上文编号。“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，sds-page，等电聚焦(ief)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相hplc)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如flatman等,j.chromatogr.b848:79-87(2007)。“分离的”的核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。“编码特异性结合dr5和fap的双特异性抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组dna方法，噬菌体展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从n至c端，每条重链具有一个可变区(vh)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(ch1，ch2，和ch3)。类似地，从n至c端，每条轻链具有一个可变区(vl)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(cl)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。在一些实施方案中，阻断性抗体或拮抗性抗体实质性或完全抑制抗原的生物学活性。例如，本发明的抗pd-l1抗体阻断经由pd-1的信号传导，使得将t细胞的功能性应答(例如增殖，细胞因子生成，靶细胞杀伤)从功能障碍状态恢复至抗原刺激。“激动性”或活化性抗体是通过与其结合的抗原增强或启动信号传导的抗体。在一些实施方案中，激动性抗体在不存在天然配体的情况中引起或激活信号传导。术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。“没有实质性交叉反应性”意指分子(例如，抗体)不识别或特异性结合与该分子的实际靶抗原不同的抗原(例如与靶抗原密切相关的抗原)，特别地在与该靶抗原相比时。例如，抗体可以结合少于约10％至少于约5％的与实际靶抗原不同的抗原，或者可以以由少于约10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.2％，或0.1％组成的量结合所述与实际靶抗原不同的抗原，优选地少于约2％，1％，或0.5％，且最优选地少于约0.2％或0.1％与实际靶抗原不同的抗原。关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如blast，blast-2，align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序align-2产生的。align-2序列比较计算机程序由genentech,inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(uscopyrightoffice,washingtond.c.,20559)，在那里其以美国版权注册号txu510087注册。公众自genentech,inc.,southsanfrancisco,california可获得align-2程序，或者可以从源代码编译。align-2程序应当编译成在unix操作系统，包括数码unixv4.0d上使用。所有序列比较参数由align-2程序设定且不变。在采用align-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列a相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列b的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)如下计算：分数x/y乘100其中x是由序列比对程序align-2在该程序的a和b比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中y是b中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列a的长度与氨基酸序列b的长度不相等，则a相对于b的％氨基酸序列同一性将不等于b相对于a的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用align-2计算机程序获得的。术语“药物配制剂”指处于如下的制剂，其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分。“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。术语“pd-1轴结合拮抗剂”指一种抑制pd-1轴结合配偶与一种或多种其结合配偶的相互作用，使得消除源自pd-1信号传导轴上的信号传导的t细胞功能障碍(结果是恢复或增强t细胞功能(例如增殖，细胞因子生成，靶细胞杀伤))的分子。如本文中使用的，pd-1轴结合拮抗剂包括pd-1结合拮抗剂，pd-l1结合拮抗剂和pd-l2结合拮抗剂。术语“pd-1结合拮抗剂”指一种降低，阻断，抑制，消除或干扰源自pd-1与一种或多种其结合配偶，诸如pd-l1，pd-l2的相互作用的信号转导的分子。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是一种抑制pd-1与其结合配偶结合的分子。在一个具体的方面，pd-1结合拮抗剂抑制pd-1与pd-l1和/或pd-l2的结合。例如，pd-1结合拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自pd-1与pd-l1和/或pd-l2相互作用的信号转导的抗pd-1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，pd-1结合拮抗剂降低负共刺激信号，从而使功能障碍t细胞不太有功能障碍(例如增强对抗原识别的效应器应答)，所述负共刺激信号经由pd-1由或经由t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的信号传导介导。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抗pd-1抗体。在一个具体的方面，pd-1结合拮抗剂是本文中描述的mdx-1106。在另一个具体的方面，pd-1结合拮抗剂是本文中描述的merck3745。在另一个具体的方面，pd-1结合拮抗剂是本文中描述的ct-011。术语“pd-l1结合拮抗剂”指一种降低，阻断，抑制，消除或干扰源自pd-l1与一种或多种其结合配偶，诸如pd-1，b7-1的相互作用的信号转导的分子。在一些实施方案中，pd-l1结合拮抗剂是抑制pd-l1与其结合配偶结合的分子。在一个具体的方面，pd-l1结合拮抗剂抑制pd-l1与pd-1和/或b7-1的结合。在一些实施方案中，pd-l1结合拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自pd-l1与一种或多种其结合配偶，诸如pd-1，b7-1的相互作用的信号转导的抗pdl1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，pd-l1结合拮抗剂降低负共刺激信号，从而使功能障碍t细胞不太有功能障碍(例如增强对抗原识别的效应器应答)，所述负共刺激信号经由pd-l1由或经由t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的信号传导介导。在一些实施方案中，pd-l1结合拮抗剂是抗pd-l1抗体。在一个具体的方面，抗pd-l1抗体是本文中描述的yw243.55.s70。在另一个具体的方面，抗pd-l1抗体是本文中描述的mdx-1105。在仍有另一个具体的方面，抗pdl1抗体是本文中描述的mpdl3280a。如本文中使用的，术语“pd-l2结合拮抗剂”指一种降低，阻断，抑制，消除或干扰源自pd-l2与一种或多种其结合配偶，诸如pd-1的相互作用的信号转导的分子。在一些实施方案中，pd-l2结合拮抗剂是抑制pd-l2与其结合配偶结合的分子。在一个具体的方面，pd-l2结合拮抗剂抑制pd-l2与pd-1的结合。在一些实施方案中，pd-l2拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自pd-l2与一种或多种其结合配偶，诸如pd-1的相互作用的信号转导的抗pdl2抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，pd-l2结合拮抗剂降低负共刺激信号，从而使功能障碍t细胞不太有功能障碍(例如增强对抗原识别的效应器应答)，所述负共刺激信号经由pd-l2由或经由t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的信号传导介导。在一些实施方案中，pd-l2结合拮抗剂是免疫粘附素。“pd-1寡肽”，“pd-l1寡肽”，或“pd-l2寡肽”是分别结合(优选特异性结合)pd-1，pd-l1或pd-l2负共刺激多肽的寡肽，分别包括受体，配体或信号传导组分，如本文中描述的。此类寡肽可以使用已知的寡肽合成技术化学合成或者可以使用重组技术制备并纯化。此类寡肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100个氨基酸或更多。可以使用公知的技术鉴定此类寡肽。在这点上，注意到用于对寡肽文库筛选能够特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域中公知的(见例如美国专利no.5,556,762,5,750,373,4,708,871，4,833,092,5,223,409，5,403,484,5,571,689,5,663,143；pct公开文本no.wo84/03506和wo84/03564；geysen等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.，81:3998-4002(1984)；geysen等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,82:178-182(1985)；geysen等,于syntheticpeptidesasantigens,130-149(1986)；geysen等,j.immunol.meth.,102:259-274(1987)；schoofs等,j.immunol.,140:611-616(1988),cwirla,s.e.等,proc.natl.acad.sci.usa,87:6378(1990)；lowman,h.b.等,biochemistry,30:10832(1991)；clackson,t.等,nature,352:624(1991)；marks,j.d.等,j.mol.biol.,222:581(1991)；kang,a.s.等,proc.natl.acad.sci.usa,88:8363(1991),及smith,g.p.,currentopin.biotechnol.,2:668(1991)。术语“无反应性”指源自经由t细胞受体投递的不完全或不充分信号(例如在缺乏ras活化的情况中胞内ca+2增加)的对抗原刺激的无响应性状态。t细胞无反应性也可以在缺乏共刺激的情况中在用抗原刺激后发生，生成即使在共刺激的背景中对抗原的随后活化变得不感受的细胞。无响应性状态经常可以被白介素-2的存在超越。无反应性t细胞不经历克隆扩充和/或获得效应器功能。术语“耗竭”指作为源自在许多慢性感染和癌症期间发生的持续tcr信号传导的t细胞功能障碍状态的t细胞耗竭。它与无反应性的区别在于它不经由不完全或缺乏的信号传导，而是由于持续信号传导而发生。它以较差的效应器功能，持续的抑制性受体表达和与功能性效应或记忆t细胞的转录状态不同的转录状态限定。耗竭阻止感染和肿瘤的最佳控制。耗竭可以源自外在负调节途径(例如免疫调节细胞因子)及细胞内在负调节(共刺激)途径(pd-1，b7-h3，b7-h4，等)二者。“增强t细胞功能”意指诱导，引起或刺激t细胞具有持续或放大的生物学功能，或者恢复或再活化耗竭的或无活性的t细胞。增强t细胞功能的例子包括：相对于干预前的此类水平，升高的来自cd8+t细胞的γ-干扰素分泌，升高的增殖，升高的抗原响应性(例如病毒，病原体，或肿瘤清除)。在一个实施方案中，增强的水平是至少50％，或者60％，70％，80％，90％，100％，120％，150％，200％。测量此增强的方式是本领域普通技术人员已知的。“肿瘤免疫”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。“免疫原性”指特定物质引发免疫应答的能力。肿瘤是免疫原性的，并且增强肿瘤免疫原性有助于通过免疫应答清除肿瘤细胞。增强肿瘤免疫原性的例子包括用抗pdl抗体和me抑制剂处理。“持续应答”指在停止处理后对降低肿瘤生长的持续影响。例如，与施用阶段开始时的大小相比，肿瘤大小可以保持为相同或更小。在一些实施方案中，持续应答具有与处理持续时间至少相同的持续时间，处理持续时间的至少1.5倍，2.0倍，2.5倍，或3.0倍长度。如本文中使用的，术语“成纤维细胞活化蛋白(fap)”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然fap，除非另外指明。该术语涵盖“全长”，未加工的fap以及fap因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖fap的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。优选地，本发明的抗fap抗体结合fap的胞外域。例示性fap多肽序列的氨基酸序列，包括人fap的序列披露于wo2012/020006。在用于本文时，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。如本文中使用的，术语癌症指增殖性疾病，诸如癌症为结直肠癌，肉瘤，头和颈癌，鳞状细胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌症，非小细胞肺癌，小细胞肺癌和间皮瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。在一个实施方案中，癌症为结直肠癌症，而且，任选的是，化疗剂为伊立替康。在癌症为肉瘤的实施方案中，任选的是，肉瘤为软骨肉瘤，平滑肌肉瘤，胃肠基质肿瘤，纤维肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤或恶性纤维组织细胞瘤。术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为vh和vl)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(fr)和3个高变区(hvr)(见例如kindt等kubyimmunology,第6版,w.h.freemanandco.,第91页(2007))。单个vh或vl域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的vh或vl域筛选互补vl或vh域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，portolano等，j.immunol.150：880-887(1993)；clarkson等，nature352：624-628(1991)。如本文中使用的，术语“抗原结合分子”在其最广义上指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。术语“抗体的抗原结合位点”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基。“框架”或“fr”区是可变域中那些与本文中定义的高变区残基不同的区。因此，抗体的轻和重链可变域自n至c端包含域fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，和fr4。尤其地，重链的cdr3是对抗原结合贡献最大且限定抗体特性的区。cdr和fr区依照kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice，nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。依照本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体是对两种不同抗原特异性，即作为第一抗原的dr5和作为第二抗原的fap。如本文中使用的，术语“单特异性”抗体表示抗体具有一个或多个结合位点，每个结合相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含至少两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体指对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。本文中提供双特异性抗体，其具有针对fap和dr5的结合特异性。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合dr5的两种不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒剂定位于表达dr5的细胞。可以作为全长抗体或抗体片段制备双特异性抗体。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见milstein和cuello,nature305:537(1983))，wo93/08829，和traunecker等，emboj.10:3655(1991))，和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利no.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(wo2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利no.4,676,980,及brennan等，science，229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如kostelny等，j.immunol.，148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如hollinger等，proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993))；及使用单链fv(sfv)二聚体(见例如gruber等,j.immunol.,152:5368(1994))；及如例如tutt等j.immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如us2006/0025576a1)。本文中的抗体或片段还包括包含至少一个结合fap或dr5以及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用fab”或“daf”(参见例如us2008/0069820)。如本申请内使用的，术语“效价”或“价”表示抗体分子中存在指定数目的结合位点。如此，术语“二价”，“四价”，和“六价”分别表示抗体分子中存在两个结合位点，四个结合位点，和六个结合位点。依照本发明的双特异性抗体至少是“二价”的，而且可以是“三价”的或“多价”的(例如“四价”或“六价”)。本发明的抗体具有两个或更多个结合位点且是双特异性的。就是说，该抗体可以是双特异性的，即使在有超过两个结合位点的情况中(即该抗体是三价或多价的)。本发明的双特异性抗体包括例如多价单链抗体，双抗体和三抗体，以及如下的抗体，该抗体具有全长抗体的恒定域结构，对其经一个或多个肽接头连接别的抗原结合位点(例如单链fv，vh域和/或vl域，fab，或(fab)2)。所述抗体可以是来自单一物种的全长，或者是嵌合化的或人源化的。在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。如本本申请内使用的，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸组，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：a)，精氨酸(arg，r)，天冬酰胺(asn，n)，天冬氨酸(asp，d)，半胱氨酸(cys，c)，谷氨酰胺(gln，q)，谷氨酸(glu，e)，甘氨酸(gly，g)，组氨酸(his，h)，异亮氨酸(ile，i)，亮氨酸(leu，l)，赖氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，苯丙氨酸(phe，f)，脯氨酸(pro，p)，丝氨酸(ser，s)，苏氨酸(thr，t)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)，和缬氨酸(val，v)。如本文中所使用的，表述“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不管传代的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在dna内容上可能不是正好相同的。包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以用解离常数(kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。如本文中所使用的，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在表面等离振子共振测定法(spr,biacore,ge-healthcareuppsala,sweden)中抗体对抗原的表位的结合。结合亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)，kd(解离常数)，和kd(kd/ka)限定。结合或特异性结合意指10-8mol/l或更小，优选10-9m至10-13m的结合亲和力(kd)。抗体对死亡受体的结合可以通过biacore测定法(ge-healthcareuppsala,sweden)来调查。结合亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)，kd(解离常数)，和kd(kd/ka)限定。“降低的结合”，例如降低的对fc受体的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例如通过spr测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反，“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。如本文中使用的，“t细胞活化”指t淋巴细胞，特别是细胞毒性t淋巴细胞的一种或多种细胞应答，其选自：增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒性活性，和活化标志物的表达。本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子能够诱导t细胞活化。合适的测量t细胞活化的测定法是本文中所述
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中已知的。如本文中使用的，“靶细胞抗原”指靶细胞表面上呈现的抗原性决定簇，所述靶细胞例如肿瘤中的细胞诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞。特别地，“靶细胞抗原”指叶酸受体1。如本文中使用的，术语“第一”和“第二”就抗原结合模块等而言为了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述，这些术语的使用不意图赋予t细胞活化性双特异性抗原结合分子的特定次序或取向。术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面聚组，诸如氨基酸，糖侧链，磷酰基，或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是抗原中被抗体结合的区域。如本文中使用的，术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合，从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上，病毒感染的细胞的表面上，其它患病细胞的表面上，免疫细胞的表面上，游离在血液血清中和/或在胞外基质(ecm)中找到。除非另外指示，本文中称为抗原的蛋白质(例如folr1和cd3)可以是来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然形式蛋白质。在一个具体的实施方案中，抗原是人蛋白。在对本文中的特定蛋白质进行提述的情况下，该术语涵盖“全长”，未加工的蛋白质以及起因于细胞中加工的蛋白质的任何形式。该术语还涵盖蛋白质的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。可用作抗原的例示性人蛋白包括但不限于：folr1(叶酸受体α(fra)；叶酸结合蛋白(fbp)；人folr1uniprotno.：p15328；鼠folr1uniprotno.:p35846；食蟹猴folr1uniprotno.：g7pr14)，和cd3，特别是cd3的ε亚基(对于人序列，参见uniprotno.p07766(版本130)，ncbirefseqno.np_000724.1，seqidno：150；或对于食蟹猴[macacafascicularis]序列，参见uniprotno.q95li5(版本49)，ncbigenbankno.bab71849.1)。本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子结合在来自不同物种的cd3或靶抗原间保守的cd3或靶细胞抗原的表位。在某些实施方案中，本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子结合cd3和folr1，但是不结合folr2(叶酸受体β；frb；人folr2uniprotno.:p14207)或folr3(叶酸受体γ；人folr3uniprotno.:p41439)。如本文中所使用的，认为特别地具有前缀“糖”的术语“工程化”或“工程化改造”及术语“糖基化工程”包括对天然存在的或重组的多肽或其片段的糖基化样式的任何操作。糖基化工程包括细胞的糖基化机制的代谢工程，包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化工程是糖基转移酶活性的变化。在一个具体的实施方案中，工程化改造导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。ii.组合物和方法在一个方面，本发明基于t细胞活化性双特异性抗原结合分子(例如包含对叶酸受体1(folr1)特异性的第一抗原结合位点和对cd3特异性的第二抗原结合位点的t细胞活化性双特异性抗原结合分子)和pd-1轴结合拮抗剂的治疗剂组合的用途，例如用于治疗癌症。在一些实施方案中，该治疗剂组合进一步包括tim3拮抗剂。a.t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂的组合疗法宽泛而言，本发明涉及t细胞活化性双特异性抗原结合分子及其与pd-1轴结合拮抗剂组合的用途。该组合胜过单一疗法的优势在于本发明中使用的t细胞活化性双特异性抗原结合分子能够实现t细胞对靶定细胞的重新定向和活化，同时pd-1轴结合拮抗剂通过减轻t细胞耗竭增强t细胞功能。在一个方面，本文中提供的是一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如folr1-tcb，和pd-1轴结合拮抗剂。在一些实施方案中，该治疗在该治疗停止后在该个体中导致持久响应。本发明的方法可以在治疗期望增强的免疫原性(诸如提高肿瘤免疫原性以治疗癌症)的状况中得到应用。可以治疗多种癌症，或者可以延迟其进展，所述癌症包括但不限于可以含有brafv600e突变的癌症，可以含有braf野生型的癌症，可以含有kras野生型的癌症，或可以含有活化性kras突变的癌症。在一些实施方案中，该个体具有子宫内膜癌症。该子宫内膜癌症可以处于早期或晚期。在一些实施方案中，该个体具有黑素瘤。该黑素瘤可以处于早期或处于晚期。在一些实施方案中，该个体具有结直肠癌。该结直肠癌可以处于早期或处于晚期。在一些实施方案中，该个体具有肺癌，例如非小细胞肺癌。该非小细胞肺癌可以处于早期或处于晚期。在一些实施方案中，该个体具有胰腺癌。该胰腺癌可以处于早期或晚期。在一些实施方案中，该个体具有血液学恶性。该血液学恶性可以是早期或晚期的。在一些实施方案中，该个体具有卵巢癌。该卵巢癌可以处于早期或处于晚期。在一些实施方案中，该个体具有乳腺癌。该乳腺癌可以处于早期或处于晚期。在一些实施方案中，该个体具有肾细胞癌。该肾细胞癌可以处于早期或处于晚期。在一些实施方案中，该个体是哺乳动物，诸如驯养动物(例如牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如人和非人灵长类诸如猴)，兔，和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，治疗的个体是人。在另一个方面，本文中提供的是一种在具有癌症的个体中增强免疫功能的方法，其包括施用有效量的t细胞活化性双特异性抗原结合分子(特别是folr1-tcb)和pd-1轴结合拮抗剂。在一些实施方案中，相对于施用该t细胞活化性双特异性抗原结合分子和该pd-1途径拮抗剂之前，该个体中的t细胞具有增强的引发，活化，增殖和/或效应器功能。在一些实施方案中，该t细胞效应器功能为分泌il-2，ifn-γ和tnf-α中至少一项。在一个实施方案中，施用folr1-tcb和抗pdl-1抗体导致t细胞升高的il-2，ifn-γ和tnf-α分泌。在一些实施方案中，该t细胞为cd8+t细胞。在一些实施方案中，该t细胞引发以cd8t细胞中升高的cd44表达和/或增强的细胞裂解活性为特征。在一些实施方案中，该cd8t细胞活化以升高的γ-ift^tcd8t细胞频率为特征。在一些实施方案中，该cd8t细胞为抗原特异性t-细胞。在一些实施方案中，抑制通过经由pd-l1表面表达的信号传导实现的免疫逃避。在一些实施方案中，该癌症具有升高水平的t细胞浸润。在一些实施方案中，本发明的组合疗法包括施用folr1-tcb和pd-1轴结合拮抗剂。可以以本领域中已知的任何合适的方式施用该folr1-tcb和pd-1轴结合拮抗剂。例如，可以序贯(在不同时间)或并行(在相同时间)施用folr1-tcb和pd-1轴结合拮抗剂。在一些实施方案中，连续施用该folr1-tcb。在一些实施方案中，间歇施用该folr1-tcb。在一些实施方案中，在施用该pd-1轴结合拮抗剂之前施用该folr1-tcb。在一些实施方案中，与施用该pd-1轴结合拮抗剂同时施用该folr1-tcb。在一些实施方案中，在施用该pd-1轴结合拮抗剂之后施用该folr1-tcb。在一些实施方案中，提供的是一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的t细胞活化性双特异性抗原结合分子(例如folr1-tcb)和pd-1轴结合拮抗剂，进一步包括施用另外的疗法。具体涵盖的是如下的一个实施方案，其中该另外的疗法包含tim-3拮抗剂。因而，在一个方面，本文中提供的是一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的t细胞活化性双特异性抗原结合分子(特别是folr1-tcb)，pd-1轴结合拮抗剂，和tim-3拮抗剂。可以使用任何tim3拮抗剂，例如本文中描述的那些。该另外的疗法可以是放射疗法，手术(例如乳房肿瘤切除术和乳房切除术)，化学疗法，基因疗法，dna疗法，病毒疗法，rna疗法，免疫疗法，骨髓移植，纳米疗法(nanotherapy)，单克隆抗体疗法，或前述疗法的组合。该另外的疗法可以是辅助或新辅助疗法形式。在一些实施方案中，该另外的疗法是施用小分子酶促抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，该另外的疗法是施用副作用限制剂(例如意图减轻治疗副作用的发生和/或严重性的药剂，诸如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，该另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，该另外的疗法是手术。在一些实施方案中，该另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，该另外的疗法是γ照射。在一些实施方案中，该另外的疗法是靶向pi3k/akt/mtor途径的疗法，hsp90抑制剂，微管蛋白抑制剂，凋亡抑制剂，和/或化学预防剂。该另外的疗法可以是上文描述的化疗剂中一项或多项。可以通过相同施用路径或者通过不同施用路径施用t细胞活化性双特异性抗原结合分子(例如folr1-tcb)和pd-1轴结合拮抗剂。在一些实施方案中，静脉内，肌肉内，皮下，表面，口服，经皮，腹膜内，眶内，通过植入，通过吸入，鞘内，室内，或鼻内施用t细胞活化性双特异性抗原结合分子(例如folr1-tcb)。在一些实施方案中，静脉内，肌肉内，皮下，表面，口服，经皮，腹膜内，眶内，通过植入，通过吸入，鞘内，室内，或鼻内施用pd-1轴结合拮抗剂。可以施用有效量的该t细胞活化性双特异性抗原结合分子和该pd-1轴结合拮抗剂以预防或治疗疾病。该t细胞活化性双特异性抗原结合分子和/或该pd-1轴结合拮抗剂的适宜剂量可以基于要治疗的疾病的类型，t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂的类型，疾病的严重性和过程，个体的临床状况，个体的临床史和对治疗的响应，和主治内科医生的判断来确定。可以在方法中使用本领域中已知或下文描述的任何t细胞活化性双特异性抗原结合分子，pd-1轴结合拮抗剂和tim-3拮抗剂。在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文中描述的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，本文中描述的pd-1轴结合拮抗剂和药学可接受载剂。在一些实施方案中，该药物组合物进一步包含tim3拮抗剂。在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含对叶酸受体1(folr1)和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子及包装插页，该包装插页包含关于与pd-1轴结合拮抗剂一起使用该t细胞活化性双特异性抗原结合分子在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的用法说明书。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含关于与tim3拮抗剂一起使用该t细胞活化性双特异性抗原结合分子的用法说明书。在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含对叶酸受体1(folr1)和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂及包装插页，该包装插页包含关于使用该t细胞活化性双特异性抗原结合分子和该pd-1轴结合拮抗剂在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的用法说明书。在一个实施方案中，该试剂盒进一步包含tim3拮抗剂。在该实施方案之一中，该pd-1轴结合拮抗剂为抗pd-1抗体或抗pdl-1抗体。在一个实施方案中，该pd-1轴结合拮抗剂为抗pd-1免疫粘附素。在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：(i)第一容器，其中装有包含本文中描述的对叶酸受体1(folr1)和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的组合物；和(ii)第二容器，其中装有包含pd-1轴结合拮抗剂的组合物。在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：(i)第一容器，其装有包含本文中描述的对叶酸受体1(folr1)和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的组合物；(ii)第二容器，其装有包含pd-1轴结合拮抗剂的组合物；和(iii)第三容器，其装有包含tim3拮抗剂的组合物。b.供本发明中使用的例示性t细胞活化性双特异性抗原结合分子本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子是双特异性的，即它包含能够特异性结合两种不同抗原决定簇，即cd3和folr1的至少两种抗原结合模块。依照本发明，该抗原结合模块是fab分子(即由各自包含一个可变区和一个恒定区的一条重链和一条轻链构成的抗原结合域)。在一个实施方案中，所述fab分子是人的。在另一个实施方案中，所述fab分子是人源化的。在还有另一个实施方案中，所述fab分子包含人重和轻链恒定区。本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子能够同时结合该靶细胞抗原folr1和cd3。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子能够通过同时结合靶细胞抗原folr1和cd3而交联t细胞和folr1表达性靶细胞。在一个甚至更加特定的实施方案中，此类同时结合导致folr1表达性靶细胞，特别是folr1表达性肿瘤细胞裂解。在一个实施方案中，此类同时结合导致t细胞活化。在其它实施方案中，此类同时结合导致t淋巴细胞，特别是细胞毒性t淋巴细胞的选自下组的细胞应答：增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒性活性，和活化标志物表达。在一个实施方案中，在没有同时结合靶细胞抗原folr1的情况下该t细胞活化性双特异性抗原结合分子对cd3的结合不导致t细胞活化。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子能够将t细胞的细胞毒性活性重定向至folr1表达性靶细胞。在一个特定的实施方案中，所述重定向不依赖于靶细胞的mhc介导的肽抗原呈递和/或t细胞的特异性。特别是，依照本发明的一些实施方案的t细胞为细胞毒性t细胞。在一些实施方案中，该t细胞为cd4+或cd8+t细胞，特别是cd8+t细胞。本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个能够结合cd3的抗原结合模块(在本文中也称作“cd3抗原结合模块”或“第一抗原结合模块”)。在一个特定的实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过一个能够特异性结合cd3的抗原结合模块。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子提供对cd3的单价结合。在一个特定的实施方案中，cd3为人cd3或食蟹猴cd3，最特别为人cd3。在一个特定的实施方案中，该cd3抗原结合模块是对人和食蟹猴cd3交叉反应性的(即特异性结合)。在一些实施方案中，该第一抗原结合模块能够特异性结合cd3的ε亚基(参见uniprotno.p07766(版本130)，ncbirefseqno.np_000724.1，seqidno:150，人序列；uniprotno.q95li5(版本49)，ncbigenbankno.bab71849.1，食蟹猴[macacafascicularis]序列)。在一些实施方案中，该cd3抗原结合模块包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr。在一个实施方案中，该cd3抗原结合模块包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3。在一个实施方案中，该cd3抗原结合模块包含：包含seqidno:36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该cd3抗原结合模块包含与seqidno:36至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与seqidno:31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个能够结合靶细胞抗原folr1的抗原结合模块(在本文中也称作“folr1结合模块”或“第二”或“第三”抗原结合模块)。在一个实施方案中，该能够结合靶细胞抗原folr1的抗原结合模块不结合folr2或folr3。在一个特定的实施方案中，该folr1抗原结合模块是对人和食蟹猴folr1交叉反应性的(即特异性结合)。在某些实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含两个能够结合靶细胞抗原folr1的抗原结合模块。在一个特定的此类实施方案中，这些抗原结合模块中的每个特异结合相同抗原决定簇。在一个甚至更加特定的实施方案中，所有这些抗原结合模块是相同的。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过两个能够结合folr1的抗原结合模块。该folr1结合模块通常是特异结合folr1且能够将t细胞活化性双特异性抗原结合分子定向至它所连接的靶位点，例如表达folr1的特定类型的肿瘤细胞的fab分子。一方面，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr；和(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子。在一个实施方案中，该为能够特异性结合cd3的fab分子的第一抗原结合模块包含：包含seqidno:36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合folr1的fab分子。在一个此类实施方案中，该第二和第三能够特异性结合folr1的抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(cdr)和轻链cdr序列。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的t细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个实施方案中，该第一抗原结合模块和该第二抗原结合模块各自在fab重链的c端融合至该fc域的第一或第二亚基的n端。在一个实施方案中，该第三抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端，任选经由肽接头。在又一个特定的实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子中存在不超过一个能够特异性结合cd3的抗原结合模块(即该t细胞活化性双特异性抗原结合分子提供对cd3的单价结合)。具有共同轻链的t细胞活化性双特异性抗原结合分子本发明的发明人生成了一种双特异性抗体，其中结合模块共享共同轻链，其保留针对cd3的亲本单特异性抗体的特异性和功效且能使用相同轻链结合第二抗原(例如folr1)。保留亲本抗体的结合特性的具有共同轻链的双特异性分子的生成不是直截了当的，因为杂合轻链的共同cdr不得不实现针对两种靶的结合特异性。一方面，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第一和第二抗原结合模块，其中之一为能够特异性结合cd3的fab分子且其中另一为能够特异性结合folr1的fab分子，其中该第一和该第二fab分子具有相同vlcl轻链。在一个实施方案中，所述相同轻链(vlcl)包含seqidno:32，seqidno:33和seqidno:34的轻链cdr。在一个实施方案中，所述相同轻链(vlcl)包含seqidno:35。在一个实施方案中，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno:16，seqidno:17和seqidno:18组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr。在一个此类实施方案中，该cd3抗原结合模块包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3，且该folr1抗原结合模块包含seqidno:16的重链cdr1，seqidno:17的重链cdr2，seqidno:18的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3。在一个实施方案中，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的fab分子，包含：包含seqidno:36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno:15的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。在又一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含与seqidno:15至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与seqidno:31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与seqidno:36至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno:15至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，和与seqidno:31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含(iii)能够特异性结合folr1的第三抗原结合模块(其为fab分子)。在一个此类实施方案中，该能够特异性结合folr1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(cdr)和轻链cdr序列。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。因而，在一个实施方案中，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno:16，seqidno:17和seqidno:18组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr。(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno:16，seqidno:17和seqidno:18组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr。在一个此类实施方案中，该cd3抗原结合模块包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3，且该folr1抗原结合模块包含seqidno:16的重链cdr1，seqidno:17的重链cdr2，seqidno:18的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3。在一个实施方案中，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的fab分子，包含：包含seqidno:36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno:15的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno:15的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno:16，seqidno:402和seqidno:400组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr。在一个此类实施方案中，该cd3抗原结合模块包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3，且该folr1抗原结合模块包含seqidno:16的重链cdr1，seqidno:402的重链cdr2，seqidno：400的重链cdr3，seqidno：32的轻链cdr1，seqidno：33的轻链cdr2，和seqidno：34的轻链cdr3。在一个实施方案中，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的fab分子，包含：包含seqidno：36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno：31的氨基酸序列的可变轻链。(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno：401的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno：31的氨基酸序列的可变轻链。在又一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含与seqidno：401至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与seqidno：31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与seqidno：36至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：401至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，和与seqidno：31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含(iii)能够特异性结合folr1的第三抗原结合模块(其为fab分子)。在一个此类实施方案中，该能够特异性结合folr1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(cdr)和轻链cdr序列。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。因而，在一个实施方案中，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno：37，seqidno：38和seqidno：39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno：16，seqidno：402和seqidno：400组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno：32，seqidno：33，seqidno：34的组的轻链cdr。(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，且包含至少一个选自由seqidno:16，seqidno:402和seqidno:400组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr。在一个此类实施方案中，该cd3抗原结合模块包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno：39的重链cdr3，seqidno：32的轻链cdr1，seqidno：33的轻链cdr2，和seqidno：34的轻链cdr3，且该folr1抗原结合模块包含seqidno:16的重链cdr1，seqidno:402的重链cdr2，seqidno:400的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3。在一个实施方案中，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的fab分子，包含：包含seqidno:36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno:401的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno:401的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。如此，在一个实施方案中，本发明涉及双特异性分子，其中至少两个结合模块具有相同轻链和相应的分别赋予针对t细胞活化性抗原cd3和靶细胞抗原folr1的特异性结合的重建的重链。这种所谓的‘共同轻链’原理，即组合共享一种轻链但是仍然具有分开的特异性的两种结合物的使用阻止轻链错配。如此，生产期间的副产物更少，推动t细胞活化性双特异性抗原结合分子的同质制备。t细胞活化性双特异性抗原结合分子的各构件可以以多种构造彼此融合。例示性的构造描绘于图1a-i中且在下文中进一步描述。在一些实施方案中，所述t细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。下文描述包含fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的例示性实施方案。具有交换fab片段的t细胞活化性双特异性抗原结合分子本发明的发明人生成了第二种双特异性抗体型式，其中结合模块之一为交换fab片段。在本发明的一个方面中，提供单价双特异性抗体，其中igg分子的fab片段之一用交换fab片段替换。交换fab片段是如下的fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。包含交换fab片段的双特异性抗体型式已有记载，例如wo2009080252，wo2009080253，wo2009080251，wo2009080254，wo2010/136172，wo2010/145792和wo2013/026831。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块为交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一是交换的。此类修饰阻止来自不同fab分子的重和轻链的错配，由此改进重组生产中本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的产量和纯度。在一种特定的对本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子有用的交换fab分子中，fab轻链和fab重链的可变区是交换的。在另一种对本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子有用的交换fab分子中，fab轻链和fab重链的恒定区是交换的。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的交换fab分子，包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1(folr1)，包含至少一个选自由seqidno:8，seqidno:56和seqidno:57组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:59，seqidno:60，seqidno:65的组的轻链cdr。在一个此类实施方案中，该cd3抗原结合模块包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3，且该folr1抗原结合模块包含seqidno:8的重链cdr1，seqidno:56的重链cdr2，seqidno：57的重链cdr3，seqidno:59的轻链cdr1，seqidno：60的轻链cdr2，和seqidno：65的轻链cdr3。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为常规fab分子。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的交换fab分子，包含：包含seqidno:36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno:55的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:64的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为常规fab分子。在又一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含与seqidno:55至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与seqidno：64至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与seqidno：36至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno:55至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，和与seqidno:64至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含(iii)能够特异性结合folr1的第三抗原结合模块。在一个实施方案中，该第三抗原结合模块为常规fab分子。在一个实施方案中，该第三抗原结合模块为交换fab分子。在一个此类实施方案中，该能够特异性结合folr1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(cdr)和轻链cdr序列。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的交换fab分子，包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1(folr1)，包含至少一个选自由seqidno:8，seqidno:56和seqidno:57组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:59，seqidno:60，seqidno:65的组的轻链cdr。(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块够特异性结合叶酸受体1(folr1)，包含至少一个选自由seqidno:8，seqidno:56和seqidno:57组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:59，seqidno:60，seqidno:65的组的轻链cdr。在一个此类实施方案中，该cd3抗原结合模块包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3，且该folr1抗原结合模块包含seqidno:8的重链cdr1，seqidno:56的重链cdr2，seqidno:57的重链cdr3，seqidno:59的轻链cdr1，seqidno:60的轻链cdr2，和seqidno:65的轻链cdr3。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块和该第三抗原结合模块均为常规fab分子。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的交换fab分子，包含：包含seqidno:36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno:55的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:64的氨基酸序列的可变轻链。(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno:55的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:64的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块和该第三抗原结合模块均为常规fab分子。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的交换fab分子，包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1(folr1)，包含至少一个选自由seqidno:8，seqidno:9和seqidno:50组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:52，seqidno:53，seqidno:54的组的轻链cdr。在一个此类实施方案中，该cd3抗原结合模块包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3，且该folr1抗原结合模块包含seqidno:8的重链cdr1，seqidno:9的重链cdr2，seqidno:50的重链cdr3，seqidno:52的轻链cdr1，seqidno:53的轻链cdr2，和seqidno:54的轻链cdr3。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为常规fab分子。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为交换fab分子。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的交换fab分子，包含：包含seqidno：36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno：31的氨基酸序列的可变轻链。(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno：49的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno：51的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为常规fab分子。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为交换fab分子。在又一个实施方案中，对folr1特异性的抗原结合模块包含与seqidno：49至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与seqidno：51至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与seqidno：36至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno：31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与seqidno:49至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，和与seqidno:51至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含(iii)能够特异性结合folr1的第三抗原结合模块。在一个实施方案中，该第三抗原结合模块为常规fab分子。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为交换fab分子。在一个此类实施方案中，该能够特异性结合folr1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(cdr)和轻链cdr序列。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的交换fab分子，包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33，seqidno:34的组的轻链cdr；(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1(folr1)，包含至少一个选自由seqidno:8，seqidno:9和seqidno:49组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:52，seqidno:53，seqidno：54的组的轻链cdr。(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1(folr1)，包含至少一个选自由seqidno：8，seqidno：9和seqidno：50组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno：52，seqidno：53，seqidno：54的组的轻链cdr。在一个此类实施方案中，该cd3抗原结合模块包含seqidno：37的重链cdr1，seqidno：38的重链cdr2，seqidno：39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3，且该folr1抗原结合模块包含seqidno:8的重链cdr1，seqidno:9的重链cdr2，seqidno:50的重链cdr3，seqidno:52的轻链cdr1，seqidno:53的轻链cdr2，和seqidno:54的轻链cdr3。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块和该第三抗原结合模块均为常规fab分子。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合cd3的交换fab分子，包含：包含seqidno:36的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:31的氨基酸序列的可变轻链。(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno:49的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:51的氨基酸序列的可变轻链。(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的fab分子，包含：包含seqidno:49的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:51的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块和该第三抗原结合模块均为常规fab分子。如此，在一个实施方案中，本发明涉及双特异性分子，其中两个结合模块赋予针对folr1的特异性结合且一个结合模块赋予针对t细胞活化性抗原cd3的特异性。修饰重链之一以确保重和轻链的正确配对，如此消除对共同轻链办法的需要。两个folr1结合位点的存在使得能够实现适宜的靶抗原folr1接合和t细胞活化。t细胞活化性双特异性抗原结合分子的各构件可以以多种构造彼此融合。例示性的构造描绘于图1a-i中且在下文中进一步描述。在一些实施方案中，所述t细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。下文描述包含fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的例示性实施方案。t细胞活化性双特异性抗原结合分子型式如上文和图1a-i中描绘的，在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含具有相同轻链(vlcl)且具有赋予针对两种不同抗原的特异性的不同重链(vhcl)的至少两个fab片段，即一个fab片段能够特异性结合t细胞活化性抗原cd3且另一个fab片段能够特异性结合该靶细胞抗原folr1。在另一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少两个抗原结合模块(fab分子)，其中之一为交换fab分子且其中另一为常规fab分子。在一个此类实施方案中，该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块为交换fab分子且该能够特异性结合folr的第二抗原结合模块为常规fab分子。t细胞活化性双特异性抗原结合分子的这些构件可以以多种构造彼此融合。例示性的构造描绘于图1a-i中。在一些实施方案中，该第一和第二抗原结合模块各自在fab重链的c端融合至该fc域的第一或第二亚基的n端。在一个具体的此类实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该第一和第二抗原结合模块各自在fab重链的c端融合至该fc域的第一或第二亚基的n端。在一个此类实施方案中，该第一和第二抗原结合模块均为fab片段且具有相同轻链(vlcl)。在另一个此类实施方案中，该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块为交换fab分子且该能够特异性结合folr的第二抗原结合模块为常规fab分子。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至该fc域的第一或第二亚基的n端且该第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第二抗原结合模块的fab重链的n端。在一个具体的此类实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基的构成的fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第二抗原结合模块的fab重链的n端，且该第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至该fc域的第一或第二亚基的n端。在一个此类实施方案中，该第一和第二抗原结合模块均为fab片段且具有相同轻链(vlcl)。在另一个此类实施方案中，该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块为交换fab分子和该能够特异性结合folr的第二抗原结合模块为常规fab分子。任选地，该第一抗原结合模块的fab轻链和该第二抗原结合模块的fab轻链可以另外彼此融合。在其它实施方案中，该第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至该fc域的第一或第二亚基的n端。在一个特定的此类实施方案中，该第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端。在一个具体的此类实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该第二抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端，且该第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至该fc域的第一或第二亚基的n端。在一个此类实施方案中，该第一和第二抗原结合模块均为fab片段且具有相同轻链(vlcl)。在另一个此类实施方案中，该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块为交换fab分子且该能够特异性结合folr的第二抗原结合模块为常规fab分子。任选地，该第一抗原结合模块的fab轻链和该第二抗原结合模块的fab轻链可以另外彼此融合。抗原结合模块可以直接地或经由肽接头融合至fc域或彼此融合，所述肽接头包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知且本文中记载的。合适的，非免疫原性的肽接头包括例如(g4s)n(seqidno:387)，(sg4)n(seqidno:388)，(g4s)n(seqidno:387)或g4(sg4)n(seqidno:389)肽接头。“n”一般是介于1和10之间，通常介于2和4之间的数目。一种特别适合于将第一和第二抗原结合模块的fab轻链彼此融合的肽接头是(g4s)2(seqidno:386)。一种适合于连接第一和第二抗原结合模块的fab重链的例示性肽接头是epksc(d)-(g4s)2(seqidno390和391)。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，当抗原结合模块融合至fc域亚基的n端时，其可以在有或无另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合。本发明的发明人已经发现，包含两个对靶细胞抗原folr特异性的结合模块的t细胞活化性双特异性抗原结合分子具有与只包含一个对靶细胞抗原folr特异性的结合模块的t细胞活化性双特异性抗原结合分子相比卓越的特征。因而，在某些实施方案中，本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合folr的fab分子。在一个此类实施方案中，该能够特异性结合folr1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(cdr)和轻链cdr序列，即该第二抗原结合模块的重链cdr序列与该第三抗原结合模块的重链cdr序列相同，且该第二抗原结合模块的轻链cdr序列与该第三抗原结合模块的轻链cdr序列相同。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同(即它们包含相同的氨基酸序列)。在一个实施方案中，该第一和第二抗原结合模块各自在fab重链的c端融合至该fc域的第一或第二亚基的n端且该第三抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端。在一个具体的此类实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一，第二和第三抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该第一和第二抗原结合模块各自在fab重链的c端融合至该fc域的第一亚基的n端且该第三抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端。在一个此类实施方案中，该第一，第二和第三抗原结合模块为常规fab片段且具有相同轻链(vlcl)。在另一个此类实施方案中，该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块为交换fab分子且该能够特异性结合folr的第二和第三抗原结合模块为常规fab分子。任选地，该第一抗原结合模块的fab轻链和该第三抗原结合模块的fab轻链可以另外彼此融合。另一方面，本发明提供一种双特异性抗体，其包含a)与包含seqidno:49的可变重链域(vh)和seqidno:51的可变轻链域的参照抗体竞争结合人folr1的第一抗原结合位点；和b)与包含seqidno:36的可变重链域(vh)和seqidno:31的可变轻链域的参照抗体竞争结合人cd3的第二抗原结合位点，其中结合竞争是使用表面等离振子共振测定法测量的。另一方面，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块和能够特异性结合叶酸受体1(folr1)的第二抗原结合模块，其中该t细胞活化性双特异性抗原结合分子与包含seqidno:49的可变重链域(vh)和seqidno:51的可变轻链域的第一参照抗体结合人folr1上的相同表位；且其中该t细胞活化性双特异性抗原结合分子与包含seqidno:36的可变重链域(vh)和seqidno:31的可变轻链域的第二参照抗体结合人cd3上的相同表位。另一方面，本发明提供一种t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含形成第一，第二和第三抗原结合模块的第一，第二，第三，第四和第五多肽链，其中该第一抗原结合模块能够结合cd3且该第二和第三抗原结合模块各自能够结合叶酸受体1(folr1)。该第一和第二多肽链以氨基(n)端至羧基(c)端方向包含第一轻链可变域(vld1)和第一轻链恒定域(cld1)。该第三多肽链以n端至c端方向包含第二轻链可变域(vld2)和第二重链恒定域1(ch1d2)。该第四多肽链以n端至c端方向包含第一重链可变域(vhd1)，第一重链恒定域1(ch1d1)，第一重链恒定域2(ch2d1)和第一重链恒定域3(ch3d1)。该第五多肽链包含vhd1，ch1d1，第二重链可变域(vhd2)，第二轻链恒定域(cld2)，第二重链恒定域2(ch2d2)和第二重链恒定域3(ch3d2)。该第三多肽链和该第五多肽链的vhd2和cld2形成该能够结合cd3的第一抗原结合模块。该第二多肽链和该第五多肽链的vhd1和ch1d1形成该能够结合folr1的第三结合模块。该第一多肽链和该第四多肽链的vhd1和ch1d1形成该能够结合folr1的第二结合模块。在另一个实施方案中，该第二和第三抗原结合模块各自在fab重链的c端融合至该fc域的第一或第二亚基的n端，且该第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第二抗原结合模块的fab重链的n端。在一个具体的此类实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一，第二和第三抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该第二和第三抗原结合模块各自在fab重链的c端融合至该fc域的第一亚基的n端且该第一抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第三抗原结合模块的fab重链的n端。在一个此类实施方案中，该第一，第二和第三抗原结合模块为常规fab片段且具有相同轻链(vlcl)。在另一个此类实施方案中，该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块为交换fab分子且该能够特异性结合folr的第二和第三抗原结合模块为常规fab分子。任选地，该第一抗原结合模块的fab轻链和该第二抗原结合模块的fab轻链可以另外彼此融合。抗原结合模块可以直接地或经由肽接头融合至fc域。在一个特定的实施方案中，抗原结合模块各自经由免疫球蛋白铰链区融合至fc域。在一个具体的实施方案中，该免疫球蛋白铰链区为人igg1铰链区。在一个实施方案中，该第一和第二抗原结合模块和该fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定的实施方案中，该免疫球蛋白分子为igg类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，该免疫球蛋白为igg1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，该免疫球蛋白为igg4亚类免疫球蛋白。在又一个特定的实施方案中，该免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，该免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个特定的实施方案中，所述t细胞活化性双特异性抗原结合分子，该第一和第二抗原结合模块和该fc域是免疫球蛋白分子的部分，且该第三抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端，其中该第一，第二和第三抗原结合模块为常规fab片段且具有相同轻链(vlcl)，其中该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33和seqidno:34的组的轻链cdr；且该能够特异性结合folr1的第二和第三抗原结合模块包含至少一个选自由seqidno:16，seqidno:17和seqidno:18组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33和seqidno:34的组的轻链cdr。在一个特定的实施方案中，所述t细胞活化性双特异性抗原结合分子，该第一和第二抗原结合模块和该fc域是免疫球蛋白分子的部分，且该第三抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端，其中该第一，第二和第三抗原结合模块为常规fab片段且具有相同轻链(vlcl)，其中该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块包含：包含seqidno:36的序列的可变重链，包含seqidno:31的序列的可变轻链；且该能够特异性结合folr1的第二和第三抗原结合模块包含：包含seqidno:15的序列的可变重链，包含seqidno:31的序列的可变轻链。在一个特定的实施方案中，所述t细胞活化性双特异性抗原结合分子，该第一和第二抗原结合模块和该fc域是免疫球蛋白分子的部分，且该第三抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端且该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块为交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一是交换的，包含至少一个选自由seqidno:37，seqidno:38和seqidno:39组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:32，seqidno:33和seqidno:34的组的轻链cdr；且该能够特异性结合folr1的第二和第三抗原结合模块包含至少一个选自由seqidno:8，seqidno:56和seqidno:57组成的组的重链互补决定区(cdr)和至少一个选自seqidno:59，seqidno:60和seqidno:65的组的轻链cdr。在一个特定的实施方案中，所述t细胞活化性双特异性抗原结合分子，该第一和该第二抗原结合模块和该fc域是免疫球蛋白分子的部分，且该第三抗原结合模块在fab重链的c端融合至该第一抗原结合模块的fab重链的n端且该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块为交换fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变或恒定区任一是交换的，其中该能够特异性结合cd3的第一抗原结合模块包含：包含seqidno:36的序列的可变重链，包含seqidno:31的序列的可变轻链；且该能够特异性结合folr1的第二和第三抗原结合模块包含：包含seqidno:55的序列的可变重链，包含seqidno:65的序列的可变轻链。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子对于每种抗原是单价的。在一个特定的实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子能结合人cd3和人叶酸受体α(folr1)且是在没有采用异二聚化办法，诸如例如节入穴技术的情况下生成的。例如，该分子可以通过采用共同轻链文库和crossmab技术来生成。在一个特定的实施方案中，cd3结合物的可变区融合至标准人igg1抗体的ch1域以形成vlvh交叉分子(融合至fc)，这对于两种特异性是共同的。为了生成交叉的对应物(vhcl)，cd3特异性可变重链域融合至恒定人λ轻链，而人folr1特异性可变重链域(例如自共同轻链文库分离的)融合至恒定人κ轻链。所得具有正确配对链的期望分子包含κ和λ轻链或其片段二者。因此，这种期望的双特异性分子种类能凭借以任一顺序选择κ和λ轻链的顺序纯化步骤自错配或同二聚体种类纯化。在一个特定的实施方案中，期望的双特异性抗体的纯化采用后续的纯化步骤，凭借kappaselect和lambdafabselect柱(gehealthcare)，去除不期望的同二聚体抗体。fc域t细胞活化性双特异性抗原结合分子的fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白g(igg)分子的fc域是二聚体，其每个亚基包含ch2和ch3igg重链恒定域。fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。在一个实施方案中，本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过一个fc域。在依照本发明的一个实施方案中，t细胞活化性双特异性抗原结合分子的fc域是iggfc域。在一个具体的实施方案中，fc域是igg1fc域。在另一个实施方案中，fc域是igg4fc域。在一个更加具体的实施方案中，fc域是包含位置s228(kabat编号方式)处的氨基酸替代，特别是氨基酸替代s228p的igg4fc域。此氨基酸替代降低igg4抗体的体内fab臂交换(参见stubenrauch等,drugmetabolismanddisposition38,84-91(2010))。在又一个具体的实施方案中，fc域是人的。促进异二聚化的fc域修饰依照本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不同的抗原结合模块，其融合至fc域的两个亚基之一个或另一个，如此fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中t细胞活化性双特异性抗原结合分子的产率和纯度，如此在t细胞活化性双特异性抗原结合分子的fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。因而，在具体的实施方案中，依照本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人iggfc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在fc域的ch3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在fc域的ch3域中。在一个特定的实施方案中，所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰，其包含在fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。节-入-穴技术记载于例如us5,731,168；us7,695,936；ridgway等,proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)。一般地，该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。因而，在一个具体的实施方案中，在t细胞活化性双特异性抗原结合分子的fc域的第一亚基的ch3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的ch3域内生成隆起，其可安置于第二亚基的ch3域内的空腔中，而且在fc域的第二亚基的ch3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的ch3域内生成空腔，其中可安置第一亚基的ch3域内的隆起。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个特定的实施方案中，在fc域第一亚基的ch3域中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(t366w)，而在fc域第二亚基的ch3域中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(y407v)。在一个实施方案中，在fc域第二亚基中，另外，第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(t366s)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(l368a)。在还有又一个实施方案中，在fc域的第一亚基中，另外，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(s354c)，而在fc域的第二亚基中，另外，第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(y349c)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在fc域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定了二聚体(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。在一个具体的实施方案中，将能够结合cd3的抗原结合模块融合(任选地经由能够结合靶细胞抗原的抗原结合模块)至fc域的第一亚基(其包含“节”修饰)。不希望受理论束缚，能够结合cd3的抗原结合模块与fc域的含节的亚基的融合会(进一步)使包含两个能够结合cd3的抗原结合模块的抗原结合分子的生成最小化(两条含节的多肽的空间碰撞)。在一个备选的实施方案中，促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostaticsteeringeffect)的修饰，例如如记载于pct公开文本wo2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两个fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。消除fc受体结合和/或效应器功能的fc域修饰fc域赋予t细胞活化性双特异性抗原结合分子以有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而，同时它可能导致不想要的t细胞活化性双特异性抗原结合分子对表达fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外，fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放，其与抗原结合分子的t细胞活化特性和长半衰期组合，在系统性施用后引起细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。(携带fc受体的)免疫细胞而非t细胞的活化甚至可能降低t细胞活化性双特异性抗原结合分子的功效，原因是例如通过nk细胞对t细胞的潜在破坏。因而，在具体的实施方案中，依照本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的fc域展现出与天然igg1fc域相比降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中，fc域(或包含所述fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出与天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比少于50％，优选少于20％，更优选少于10％且最优选少于5％的对fc受体的结合亲和力，和/或与天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比少于50％，优选少于20％，更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中，fc域(或包含所述fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子)没有实质性结合fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中，所述fc受体是fcγ受体。在一个实施方案中，所述fc受体是人fc受体。在一个实施方案中，所述fc受体是活化性fc受体。在一个特定的实施方案中，所述fc受体是活化性人fcγ受体，更具体地是人fcγriiia，fcγri或fcγriia，最具体地是人fcγriiia。在一个实施方案中，效应器功能是选自下组的一项或多项：cdc，adcc，adcp，和细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述效应器功能是adcc。在一个实施方案中，所述fc域展现出与天然igg1fc域相比基本相似的对新生儿fc受体(fcrn)的结合亲和力。当fc域(或包含所述fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出超过约70％，特别是超过约80％，更特别是超过约90％的天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子)对fcrn的结合亲和力时，实现基本相似的对fcrn的结合。在某些实施方案中，fc域工程化改造为具有与非工程化fc域相比降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中，t细胞活化性双特异性抗原结合分子的fc域包含一处或多处降低fc域对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变降低fc域对fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将fc域对fc受体的结合亲和力降低至少2倍，至少5倍，或至少10倍。在有超过一处降低fc域对fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以将fc域对fc受体的结合亲和力降低至少10倍，至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子展现出与包含非工程化fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子相比少于20％，特别是少于10％，更特别是少于5％的对fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，fc受体是fcγ受体。在一些实施方案中，所述fc受体是人fc受体。在一些实施方案中，fc受体是活化性fc受体。在一个特定的实施方案中，fc受体是活化性人fcγ受体，更特别是人fcγriiia，fcγri或fcγriia，最特别是人fcγriiia。优选地，对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中，对补体成分的结合亲和力，特别是对c1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿fc受体(fcrn)的结合亲和力没有降低。当fc域(或包含所述fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出非工程化形式的fc域(或包含所述非工程化形式的fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子)对fcrn的结合亲和力的超过约70％时，实现基本相似的对fcrn的结合，即保留该fc域对所述受体的结合亲和力。fc域或包含所述fc域的本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中，t细胞活化性双特异性抗原结合分子的fc域工程化改造为具有与非工程化fc域相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项：降低的补体依赖性细胞毒性(cdc)，降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)，降低的细胞因子分泌，降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，降低的对nk细胞的结合，降低的对巨噬细胞的结合，降低的对单核细胞的结合，降低的对多形核细胞的结合，降低的诱导凋亡的直接信号传导，降低的靶物结合的抗体的交联，降低的树突细胞成熟，或降低的t细胞引发。在一个实施方案中，所述降低的效应器功能是选自下组的一项或多项：降低的cdc，降低的adcc，降低的adcp，和降低的细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的adcc。在一个实施方案中，所述降低的adcc小于20％的由非工程化fc域(或包含非工程化fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子)诱导的adcc。在一个实施方案中，所述降低fc域对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中，fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代：e233，l234，l235，n297，p331和p329。在一个更特定的实施方案中，fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代：l234，l235和p329。在一些实施方案中，fc域包含氨基酸替代l234a和l235a。在一个此类实施方案中，fc域是igg1fc域，特别是人igg1fc域。在一个实施方案中，fc域包含在位置p329处的氨基酸替代。在一个更加特定的实施方案中，氨基酸替代是p329a或p329g，特别是p329g。在一个实施方案中，fc域包含在位置p329处的氨基酸替代和又一处在选自以下位置处的氨基酸替代：e233，l234，l235，n297和p331。在一个更加特定的实施方案中，所述又一处氨基酸替代是e233p，l234a，l235a，l235e，n297a，n297d或p331s。在具体的实施方案中，所述fc域包含在位置p329，l234和l235处的氨基酸替代。在更具体的实施方案中，所述fc域包含氨基酸突变l234a，l235a和p329g(“p329glala”)。在一个此类实施方案中，fc域是igg1fc域，特别是人igg1fc域。氨基酸替代组合“p329glala”几乎完全消除了人igg1fc域的fcγ受体结合，如记载于pct公开文本no.wo2012/130831，其通过提述完整并入本文。wo2012/130831还描述了制备此类突变体fc域的方法和用于测定其特性(诸如fc受体结合或效应器功能)的方法。igg4抗体展现出与igg1抗体相比降低的对fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此，在一些实施方案中，本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的fc域是igg4fc域，特别是人igg4fc域。在一个实施方案中，所述igg4fc域包含在位置s228处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代s228p。为了进一步降低其对fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能，在一个实施方案中，所述igg4fc域包含在位置l235处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代l235e。在另一个实施方案中，所述igg4fc域包含在位置p329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代p329g。在一个具体的实施方案中，所述igg4fc域包含在位置s228，l235和p329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代s228p，l235e和p329g。此类igg4fc域突变体及其fcγ受体结合特性记载于pct公开文本no.wo2012/130831，其通过提述完整并入本文。在一个具体的实施方案中，展现出与天然igg1fc域相比降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的fc域是包含氨基酸替代l234a，l235a和任选地p329g的人igg1fc域，或包含氨基酸替代s228p，l235e和任选地p329g的人igg4fc域。在某些实施方案中，已消除fc域的n-糖基化。在一个此类实施方案中，所述fc域包含在位置n297处的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(n297a)或天冬氨酸(n297d)替换天冬酰胺的氨基酸替代。在上文和pct公开文本no.wo2012/130831中描述的fc域以外，具有降低的fc受体结合和/或效应器功能的fc域还包括那些具有fc域残基238，265，269，270，297，327和329中一个或多个的替代的(美国专利no.6,737,056)。此类fc突变体包括具有在氨基酸位置265，269，270，297和327的两个或更多个处的替代的fc突变体，包括所谓的“dana”fc突变体，其具有残基265和297到丙氨酸的替代(美国专利no.7,332,581)。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除，替代，插入或修饰来制备突变体fc域。遗传方法可以包括编码dna序列的位点特异性诱变，pcr，基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。可以容易地测定对fc受体的结合，例如通过elisa或通过使用标准仪器诸如biacore仪(gehealthcare)的表面等离振子共振(spr)进行，并且fc受体诸如可通过重组表达获得。本文中描述了一种合适的此类结合测定法。或者，可使用已知表达特定fc受体的细胞系，如表达fcγiiia受体的人nk细胞来估测fc域或包含fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子对fc受体的结合亲和力。可通过本领域中已知的方法来测量fc域或包含fc域的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的效应器功能。本文中描述了用于测量adcc的一种合适的测定法。评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定法的其它例子记载于美国专利no.5,500,362；hellstrom等，procnatlacadsciusa83,7059-7063(1986)和hellstrom等,procnatlacadsciusa82,1499-1502(1985)；美国专利no.5,821,337；bruggemann等,jexpmed166，1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的actitm非放射性细胞毒性测定法(celltechnology,inc.mountainview,ca)；和cytotox非放射性细胞毒性测定法(promega,madison,wi))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(pbmc)和天然杀伤(nk)细胞。或者/另外，可体内评估感兴趣分子的adcc活性，例如在动物模型中，诸如披露于clynes等,procnatlacadsciusa95,652-656(1998)的。在一些实施方案中，fc域对补体成分(特别是对c1q)的结合是降低的。因而，在其中fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的cdc。可实施c1q结合测定法来测定t细胞活化性双特异性抗原结合分子是否能够结合c1q并因此具有cdc活性。参见例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体激活，可实施cdc测定法(参见例如gazzano-santoro等,jimmunolmethods202,163(1996)；cragg等,blood101,1045-1052(2003)；以及cragg和glennie,blood103,2738-2743(2004))。促进异二聚化的fc域修饰本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不同的抗原结合模块，其中一些融合至fc域的两个亚基之一个或另一个，如此fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中本发明的双特异性抗体的产率和纯度，如此在本发明的双特异性抗体的fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。因而，在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人iggfc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在fc域的ch3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在fc域的ch3域中。在一个特定的实施方案中，所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰，其包含在fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。节-入-穴技术记载于例如us5,731,168；us7,695,936；ridgway等,proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)。一般地，该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。因而，在一个具体的实施方案中，在本发明的双特异性抗体的fc域的第一亚基的ch3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的ch3域内生成隆起，其可安置于第二亚基的ch3域内的空腔中，而且在fc域的第二亚基的ch3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的ch3域内生成空腔，其中可安置第一亚基的ch3域内的隆起。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个特定的实施方案中，在fc域第一亚基的ch3域中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(t366w)，而在fc域第二亚基的ch3域中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(y407v)。在一个实施方案中，在fc域第二亚基中，另外，第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(t366s)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(l368a)。在还有又一个实施方案中，在fc域的第一亚基中，另外，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(s354c)，而在fc域的第二亚基中，另外，第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(y349c)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在fc域的两个亚基之间形成二硫桥，进一步稳定了二聚体(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。在一个备选的实施方案中，促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostaticsteeringeffect)的修饰，例如如记载于wo2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两个fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含一个免疫球蛋白g(igg)分子，其具有两个对folr1特异性的结合位点，其中第一重链的fc部分包含第一二聚化模块且第二重链的fc部分包含第二二聚化模块，容许igg分子的两条重链异二聚化。在又一个优选的实施方案中，依照节入穴策略(参见carterp.；ridgwayj.b.b.；prestal.g.:immunotechnology,volume2,number1,february1996,pp.73-73(1))，第一二聚化模块包含节且第二二聚化模块包含穴。t细胞活化性双特异性抗原结合分子的生物学特性和功能特征本领域技术人员会领会在癌性和非癌性健康细胞之间选择性区分的分子的有利效率。实现这一目标的一种方式是通过适宜靶物选择。可以采用在肿瘤细胞上排他表达的标志物将效应分子或细胞选择性靶向肿瘤细胞，同时不伤害不表达此类标志物的正常细胞。然而，在一些情况中，所谓的肿瘤细胞标志物也在正常组织中表达，虽然处于较低的水平。正常组织中的这种表达唤起毒性的可能性。如此，本领域需要能更加选择性地靶向肿瘤细胞的分子。本文中描述的发明提供选择性靶向folr1阳性肿瘤细胞且不靶向以低水平表达或根本不表达folr1的正常非癌性细胞的t细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少两个，优选两个具有相对低亲和力的folr1结合模块，这赋予容许在高和低folr1表达性细胞之间区分的亲合效应。因为肿瘤细胞以高或中等水平表达folr1，所以这个本发明的实施方案选择性结合肿瘤细胞和/或诱导对肿瘤细胞的杀伤，且对以低水平表达或根本不表达folr1的正常非癌性细胞不然。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子处于2+1倒转的型式。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子诱导t细胞介导的对folr1阳性肿瘤细胞不对非肿瘤细胞的杀伤且包含：包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3的cd3抗原结合模块和各自包含seqidno:8的重链cdr1，seqidno:9的重链cdr2，seqidno:50的重链cdr3，seqidno:52的轻链cdr1，seqidno:53的轻链cdr2，和seqidno:54的轻链cdr3的两个folr1抗原结合模块。在一个具体的实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子不诱导对在它的表面上具有少于约1000个拷贝的folr1的正常细胞的杀伤。在上述有利特征以外，本发明的一个实施方案不要求化学交联或杂合办法来生成。因而，在一个实施方案中，本发明提供能够在cho细胞中生成的t细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含人源化和人多肽。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子不引起fcgr交联。在一个此类实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子能够在cho细胞中生成且包含：包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3的cd3抗原结合模块和各自包含seqidno:8的重链cdr1，seqidno:9的重链cdr2，seqidno:50的重链cdr3，seqidno:52的轻链cdr1，seqidno:53的轻链cdr2，和seqidno:54的轻链cdr3的两个folr1抗原结合模块。如上文记录的，本文中涵盖的一些实施方案包括具有两个赋予针对folr1的特异性结合的结合模块和一个赋予针对t细胞活化性抗原cd3的特异性的结合模块的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中每个个体folr1结合模块以低亲和力接合抗原。因为该分子包含两个赋予针对folr1的结合的抗原结合模块，所以该分子的总体亲合力仍然提供有效的对folr1表达性靶细胞的结合和t细胞的活化以诱导t细胞效应器功能。考虑到虽然folr1在肿瘤细胞上以各种水平表达，但是它在某些正常细胞中也以很低水平(例如细胞表面上少于约1000个拷贝)表达，本领域技术人员会容易地认识到此类分子用作治疗剂的有利效率。此类分子选择性靶向肿瘤细胞，胜过正常细胞。如此，与以高亲和力结合folr1以诱导效应器功能的分子相比，此类分子可以以显著更少的关于源自folr1阳性正常细胞的毒性的担忧施用于有所需要的个体。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子以约5.36pm至约4nm的表观kd结合人folr1。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子以约4nm的表观kd结合人和食蟹猴folr1。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子以约1.5nm的表观kd结合鼠folr1。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子以至少约1000nm的单价结合kd结合人folr1。在一个具体的实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子以约4nm的表观kd结合人和食蟹猴folr1，以约1.5nm的表观kd结合鼠folr1，且包含：包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3的cd3抗原结合模块和各自包含seqidno:8的重链cdr1，seqidno:9的重链cdr2，seqidno:50的重链cdr3，seqidno:52的轻链cdr1，seqidno:53的轻链cdr2，和seqidno:54的轻链cdr3的两个folr1抗原结合模块。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子以至少约1000nm的单价结合kd结合人folr1且包含：包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3的cd3抗原结合模块和各自包含seqidno:8的重链cdr1，seqidno:9的重链cdr2，seqidno:50的重链cdr3，seqidno:52的轻链cdr1，seqidno:53的轻链cdr2，和seqidno:54的轻链cdr3的两个folr1抗原结合模块。如上文描述的，本文中涵盖的t细胞活化性双特异性抗原结合分子能诱导t细胞效应器功能，例如细胞表面标志物表达，细胞因子生成，t细胞介导的杀伤。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导t细胞介导的对folr1表达性靶细胞，诸如人肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该t细胞为cd8阳性t细胞。folr1表达性人肿瘤细胞的例子包括但不限于hela，skov-3，ht-29，和hrcepic细胞。可用于体外测试的其它folr1阳性人癌细胞是熟练技术人员容易获得的。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以介于约36pm和约39573pm之间的ec50诱导t细胞介导的对folr1表达性人肿瘤细胞的杀伤。具体涵盖t细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以约36pm的ec50诱导t细胞介导的对folr1表达性肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以约178.4pm的ec50诱导t细胞介导的对folr1表达性肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在48小时之后以约134.5pm或更大的ec50诱导t细胞介导的对folr1表达性肿瘤细胞的杀伤。可以通过本领域知道的方法，例如通过本文中通过实施例公开的方法来测量ec50。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的t细胞活化性双特异性抗原结合分子诱导t细胞上cd25和cd69中至少一项的细胞表面表达的上调，如通过流式细胞术测量的。在一个实施方案中，该t细胞为cd4阳性t细胞或cd8阳性t细胞。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的t细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人肿瘤细胞上表达的folr1。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的t细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人folr1上的构象表位。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的t细胞活化性双特异性抗原结合分子不结合人叶酸受体2(folr2)或人叶酸受体3(folr3)。在上述实施方案中任一项的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该抗原结合模块结合包含人folr1(seqidno:227)的氨基酸25至234的folr1多肽。在上述实施方案中任一项的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该folr1抗原结合模块结合包含seqidno:227，230和231的氨基酸序列的folr1多肽，且其中该folr1抗原结合模块不结合包含seqidno:228和229的氨基酸序列的folr多肽。在一个具体的实施方案中，该t细胞活化性双特异性抗原结合分子包含如下的folr1抗原结合模块，该folr1抗原结合模块结合包含seqidno:227，230和231的氨基酸序列的folr1多肽，且不结合包含seqidno:228和229的氨基酸序列的folr多肽，且包含如下的cd3抗原结合模块，该cd3抗原结合模块包含seqidno:37的重链cdr1，seqidno:38的重链cdr2，seqidno:39的重链cdr3，seqidno:32的轻链cdr1，seqidno:33的轻链cdr2，和seqidno:34的轻链cdr3和两个如下的folr1抗原结合模块，该folr1抗原结合模块各自包含seqidno:8的重链cdr1，seqidno:9的重链cdr2，seqidno:50的重链cdr3，seqidno:52的轻链cdr1，seqidno:53的轻链cdr2，和seqidno:54的轻链cdr3。就folr1而言，本文中涵盖的t细胞活化性双特异性抗原结合分子可具有激动，拮抗或中性效果。激动效果的例子包括在通过folr1结合模块与靶细胞上的folr1受体接合后诱导或增强经由folr1的信号传导。拮抗活性的例子包括在通过folr1结合模块与靶细胞上的folr1受体接合后消除或降低经由folr1的信号传导。这可以例如通过阻断或降低叶酸与folr1之间的相互作用而发生。供本发明中使用的例示性pd-1轴结合拮抗剂本文中提供的是用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和pd-1轴结合拮抗剂。例如，pd-1轴结合拮抗剂包括pd-1结合拮抗剂，pdl1结合拮抗剂和pdl2结合拮抗剂。“pd-1”的备选名称包括cd279和sleb2。“pdl1”的备选名称包括b7-h1，b7-4，cd274，和b7-h。“pdl2”的备选名称包括b7-dc，btdc，和cd273。在一些实施方案中，pd-1，pdl1，和pdl2是人pd-1，pdl1和pdl2。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抑制pd-1与其配体结合配偶结合的分子。在一个具体的方面，pd-1配体结合配偶是pdl1和/或pdl2。在另一个实施方案中，pdl1结合拮抗剂是抑制pdl1与其结合配偶结合的分子。在一个具体的方面，pdl1结合配偶是pd-1和/或b7-1。在另一个实施方案中，pdl2结合拮抗剂是抑制pdl2与其结合配偶结合的分子。在一个具体的方面，pdl2结合配偶是pd-1。拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，或寡肽。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抗pd-1抗体(例如人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗pd-1抗体选自下组：nivolumab，pembrolizumab，和ct-011。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如包含与恒定区(例如免疫球蛋白序列的fc区)融合的pdl1或pdl2的胞外或pd-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是amp-224。nivolumab，又称为mdx-1106-04，mdx-1106，ono-4538，bms-936558，和，是一种在wo2006/121168中描述的抗pd-1抗体。pembrolizumab，又称为mk-3475，merck3745，lambrolizumab，，和sch-900475，是一种在wo2009/114335中描述的抗pd-1抗体。ct-011，又称为hbat或hbat-1，是一种在wo2009/101611中描述的抗pd-1抗体。amp-224，又称为b7-dcig，是一种在wo2010/027827和wo2011/066342中描述的pdl2-fc融合可溶性受体。在一些实施方案中，抗pd-1抗体是nivolumab(cas登录号：946414-94-4)。在又一个实施方案中，提供了分离的抗pd-1抗体，其包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含来自seqidno:274的重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区包含来自seqidno:275的轻链可变区氨基酸序列。在又一个实施方案中，提供了分离的抗pd-1抗体，其包含重链和/或轻链序列，其中：(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：qvqlvesgggvvqpgrslrldckasgitfsnsgmhwvrqapgkglewvaviwydgskryyadsvkgrftisrdnskntlflqmnslraedtavyycatnddywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:274)，或(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:275)。在一些实施方案中，抗pd-1抗体是pembrolizumab(cas登录号：1374853-91-4)。在仍有又一个实施方案中，提供了分离的抗pd-1抗体，其包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含来自seqidno:276的重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区包含来自seqidno:277的轻链可变区氨基酸序列。在仍有又一个实施方案中，提供了分离的抗pd-1抗体，其包含重链和/或轻链序列，其中：(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:277)。在一些实施方案中，pdl1结合拮抗剂是抗pdl1抗体。在一些实施方案中，抗pdl1结合拮抗剂选自下组：yw243.55.s70，mpdl3280a，mdx-1105，和medi4736。mdx-1105，又称为bms-936559，是一种在wo2007/005874中描述的抗pdl1抗体。抗体yw243.55.s70(seqidno20和21中分别显示的重和轻链可变区序列)是一种在wo2010/077634a1中描述的抗pdl1。medi4736是一种在wo2011/066389和us2013/034559中描述的抗pdl1抗体，通过援引将每一篇收入本文，就像完整列出一样。可用于本发明方法的抗pdl1抗体及其生成方法的例子记载于pct专利申请wo2010/077634a1和美国专利no.8,217,149，通过援引将每一篇收入本文，就像完整列出一样。在一些实施方案中，pd-1轴结合拮抗剂是抗pdl1抗体。在一些实施方案中，抗pdl1抗体能够抑制pdl1和pd-1之间和/或pdl1和b7-1之间的结合。在一些实施方案中，抗pdl1抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗pdl1抗体是选自下组的抗体片段：fab，fab’-sh，fv，scfv，和(fab’)2片段。在一些实施方案中，抗pdl1抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗pdl1抗体是人抗体。可用于本发明的抗pdl1抗体(包括含有此类抗体的组合物)，诸如那些记载于wo2010/077634a1的抗pd-l1抗体可以与t细胞活化性抗原结合分子和任选的抗tim3拮抗剂抗体组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中，抗pdl1抗体含有包含氨基酸序列seqidno:382的重链可变区和包含氨基酸序列seqidno:383的轻链可变区。在一个实施方案中，抗pdl1抗体含有重链可变区多肽，其包含hvr-h1，hvr-h2和hvr-h3序列，其中：(a)hvr-h1序列是gftfsx1swih(seqidno:283)；(b)hvr-h2序列是awix2pyggsx3yyadsvkg(seqidno:284)；(c)hvr-h3序列是rhwpggfdy(seqidno:285)；进一步其中：x1是d或g；x2是s或l；x3是t或s。在一个具体的方面，x1是d；x2是s且x3是t。在另一个方面，多肽进一步包含依照下式的hvr间并置的可变区重链框架序列：(hc-fr1)-(hvr-h1)-(hc-fr2)-(hvr-h2)-(hc-fr3)-(hvr-h3)-(hc-fr4)。在又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在别的方面，框架序列是vh亚组iii共有框架。在又一个方面，至少一个框架序列如下：hc-fr1是evqlvesggglvqpggslrlscaas(seqidno:295)hc-fr2是wvrqapgkglewv(seqidno:296)hc-fr3是rftisadtskntaylqmnslraedtavyycar(seqidno:297)hc-fr4是wgqgtlvtvsa(seqidno:298)。在又一个方面，重链多肽与可变区轻链进一步组合，所述可变区轻链包含hvr-l1，hvr-l2和hvr-l3，其中：(a)hvr-l1序列是rasqx4x5x6tx7x8a(seqidno:286)；(b)hvr-l2序列是sasx9lx10s(seqidno:287)；(c)hvr-l3序列是qqx11x12x13x14px15t(seqidno:288)；进一步其中：x4是d或v；x5是v或i；x6是s或n；x7是a或f；x8是v或l；x9是f或t；x10是y或a；x11是y，g，f，或s；x12是l，y，f或w；x13是y，n，a，t，g，f或i；x14是h，v，p，t或i；x15是a，w，r，p或t。在又一个方面，x4是d；x5是v；x6是s；x7是a；x8是v；x9是f；x10是y；x11是y；x12是l；x13是y；x14是h；x15是a。在又一个方面，轻链进一步包含依照下式的hvr间并置的可变区轻链框架序列：(lc-fr1)-(hvr-l1)-(lc-fr2)-(hvr-l2)-(lc-fr3)-(hvr-l3)-(lc-fr4)。在又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在又一个方面，框架序列是vlκi共有框架。在又一个方面，至少一个框架序列如下：lc-fr1是diqmtqspsslsasvgdrvtitc(seqidno:300)lc-fr2是wyqqkpgkapklliy(seqidno:301)lc-fr3是gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyc(seqidno:302)lc-fr4是fgqgtkveikr(seqidno:303)。在另一个实施方案中，提供了分离的抗pdl1抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链可变区序列，其中：(a)重链包含hvr-h1，hvr-h2和hvr-h3，其中进一步：(i)hvr-h1序列是gftfsx1swih(seqidno:283)，(ii)hvr-h2序列是awix2pyggsx3yyadsvkg(seqidno:284)(iii)hvr-h3序列是rhwpggfdy(seqidno:285)，且(b)轻链包含hvr-l1，hvr-l2和hvr-l3，其中进一步：(i)hvr-l1序列是rasqx4x5x6tx7x8a(seqidno:286)，(ii)hvr-l2序列是sasx9lx10s(seqidno:287)，和(iii)hvr-l3序列是qqx11x12x13x14px15t(seqidno:288)。进一步其中：x1是d或g；x2是s或l；x3是t或s；x4是d或v；x5是v或i；x6是s或n；x7是a或f；x8是v或l；x9是f或t；x10是y或a；x11是y，g，f，或s；x12是l，y，f或w；x13是y，n，a，t，g，f或i；x14是h，v，p，t或i；x15是a，w，r，p或t。在一个具体的方面，x1是d；x2是s且x3是t。在另一个方面，x4是d；x5是v；x6是s；x7是a；x8是v；x9是f；x10是y；x11是y；x12是l；x13是y；x14是h；x15是a。在又一个方面，x1是d；x2是s且x3是t，x4是d；x5是v；x6是s；x7是a；x8是v；x9是f；x10是y；x11是y；x12是l；x13是y；x14是h且x15是a。在别的方面，重链可变区包含如下的hvr间并置的一个或多个框架序列：(hc-fr1)-(hvr-h1)-(hc-fr2)-(hvr-h2)-(hc-fr3)-(hvr-h3)-(hc-fr4)，并且轻链可变区包含如下的hvr间并置的一个或多个框架序列：(lc-fr1)-(hvr-l1)-(lc-fr2)-(hvr-l2)-(lc-fr3)-(hvr-l3)-(lc-fr4)。在又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在又一个方面，重链框架序列自kabat亚组i，ii，或iii序列衍生。在又一个方面，重链框架序列是vh亚组iii共有框架。在又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：hc-fr1evqlvesggglvqpggslrlscaas(seqidno:295)hc-fr2wvrqapgkglewv(seqidno:296)hc-fr3rftisadtskntaylqmnslraedtavyycar(seqidno:297)hc-fr4wgqgtlvtvsa(seqidno:298)。在又一个方面，轻链框架序列自kabatκi，ii，ii或iv亚组序列衍生。在又一个方面，轻链框架序列是vlκi共有框架。在又一个方面，一个或多个轻链框架序列如下：lc-fr1diqmtqspsslsasvgdrvtitc(seqidno:300)lc-fr2wyqqkpgkapklliy(seqidno:301)lc-fr3gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyc(seqidno:302)lc-fr4fgqgtkveikr(seqidno:303)。在又一个具体的方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在又一个方面，人恒定区选自下组：igg1，igg2，igg2，igg3，和igg4。在又一个具体的方面，人恒定区是igg1。在又一个方面，鼠恒定区选自下组：igg1，igg2a，igg2b，和igg3。在又一个方面，鼠恒定区是igg2a。在又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在又一个具体的方面，最小效应器功能源自“效应器较小(effector-less)的fc突变”或无糖基化(aglycosylation)。在又一个实施方案中，效应器较小的fc突变是恒定区中的n297a或d265a/n297a替代。在又一个实施方案中，提供了抗pdl1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：(a)重链进一步包含与gftfsdswih(seqidno:289)，awispyggstyyadsvkg(seqidno:290)和rhwpggfdy(seqidno:291)分别具有至少85％序列同一性的hvr-h1，hvr-h2和hvr-h3序列，或(b)轻链进一步包含与rasqdvstava(seqidno:292)，sasflys(seqidno:293)和qqylyhpat(seqidno:294)分别具有至少85％序列同一性的hvr-l1，hvr-l2和hvr-l3序列。在一个具体的方面，序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在另一个方面，重链可变区包含如下的hvr间并置的一个或多个框架序列：(hc-fr1)-(hvr-h1)-(hc-fr2)-(hvr-h2)-(hc-fr3)-(hvr-h3)-(hc-fr4)，且轻链可变区包含如下的hvr间并置的一个或多个框架序列：(lc-fr1)-(hvr-l1)-(lc-fr2)-(hvr-l2)-(lc-fr3)-(hvr-l3)-(lc-fr4)。在又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在又一个方面，重链框架序列自kabat亚组i，ii，或iii序列衍生。在又一个方面，重链框架序列是vh亚组iii共有框架。在又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：hc-fr1evqlvesggglvqpggslrlscaas(seqidno:295)hc-fr2wvrqapgkglewv(seqidno:296)hc-fr3rftisadtskntaylqmnslraedtavyycar(seqidno:297)hc-fr4wgqgtlvtvsa(seqidno:298)。在又一个方面，轻链框架序列自kabatκi，ii，ii或iv亚组序列衍生。在又一个方面，轻链框架序列是vlκi共有框架。在又一个方面，一个或多个轻链框架序列如下：lc-fr1diqmtqspsslsasvgdrvtitc(seqidno:300)lc-fr2wyqqkpgkapklliy(seqidno:301)lc-fr3gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyc(seqidno:302)lc-fr4fgqgtkveikr(seqidno:303)。在又一个具体的方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在又一个方面，人恒定区选自下组：igg1，igg2，igg2，igg3，和igg4。在又一个具体的方面，人恒定区是igg1。在又一个方面，鼠恒定区选自下组：igg1，igg2a，igg2b，和igg3。在又一个方面，鼠恒定区是igg2a。在又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在又一个具体的方面，最小效应器功能源自“效应器较小的fc突变”或无糖基化。在又一个实施方案中，效应器较小的fc突变是恒定区中的n297a或d265a/n297a替代。在又一个实施方案中，提供了分离的抗pdl1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvsa(seqidno:382)，或(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikr(seqidno:383)。在一个具体的方面，序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在另一个方面，重链可变区包含如下的hvr间并置的一个或多个框架序列：(hc-fr1)-(hvr-h1)-(hc-fr2)-(hvr-h2)-(hc-fr3)-(hvr-h3)-(hc-fr4)，且轻链可变区包含如下的hvr间并置的一个或多个框架序列：(lc-fr1)-(hvr-l1)-(lc-fr2)-(hvr-l2)-(lc-fr3)-(hvr-l3)-(lc-fr4)。在又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在又一个方面，重链框架序列自kabat亚组i，ii，或iii序列衍生。在又一个方面，重链框架序列是vh亚组iii共有框架。在又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：hc-fr1evqlvesggglvqpggslrlscaas(seqidno:295)hc-fr2wvrqapgkglewv(seqidno:296)hc-fr3rftisadtskntaylqmnslraedtavyycar(seqidno:297)hc-fr4wgqgtlvtvsa(seqidno:298)。在又一个方面，轻链框架序列自kabatκi，ii，ii或iv亚组序列衍生。在又一个方面，轻链框架序列是vlκi共有框架。在又一个方面，一个或多个轻链框架序列如下：lc-fr1diqmtqspsslsasvgdrvtitc(seqidno:300)lc-fr2wyqqkpgkapklliy(seqidno:301)lc-fr3gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyc(seqidno:302)lc-fr4fgqgtkveikr(seqidno:303)。在又一个具体的方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在又一个方面，人恒定区选自下组：igg1，igg2，igg2，igg3，和igg4。在又一个具体的方面，人恒定区是igg1。在又一个方面，鼠恒定区选自下组：igg1，igg2a，igg2b，和igg3。在又一个方面，鼠恒定区是igg2a。在又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在又一个具体的方面，最小的效应器功能源自原核细胞中的生成。在又一个具体的方面，最小的效应器功能源自“效应器较小的fc突变”或无糖基化。在又一个实施方案中，效应器较小的fc突变是恒定区中的n297a或d265a/n297a替代。在又一个实施方案中，提供了分离的抗pdl1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvss(seqidno:280)，或(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikr(seqidno:383)。在又一个实施方案中，提供了分离的抗pd-l1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvssastk(seqidno:281)，或(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikr(seqidno:282)。在一个具体的方面，序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在另一个方面，重链可变区包含如下的hvr间并置的一个或多个框架序列：(hc-fr1)-(hvr-h1)-(hc-fr2)-(hvr-h2)-(hc-fr3)-(hvr-h3)-(hc-fr4)，且轻链可变区包含如下的hvr间并置的一个或多个框架序列：(lc-fr1)-(hvr-l1)-(lc-fr2)-(hvr-l2)-(lc-fr3)-(hvr-l3)-(lc-fr4)。在又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在又一个方面，重链框架序列自kabat亚组i，ii，或iii序列衍生。在又一个方面，重链框架序列是vh亚组iii共有框架。在又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：hc-fr1evqlvesggglvqpggslrlscaas(seqidno:295)hc-fr2wvrqapgkglewv(seqidno:296)hc-fr3rftisadtskntaylqmnslraedtavyycar(seqidno:297)hc-fr4wgqgtlvtvss(seqidno:299)。在又一个方面，轻链框架序列自kabatκi，ii，ii或iv亚组序列衍生。在又一个方面，轻链框架序列是vlκi共有框架。在又一个方面，一个或多个轻链框架序列如下：lc-fr1diqmtqspsslsasvgdrvtitc(seqidno:300)lc-fr2wyqqkpgkapklliy(seqidno:301)lc-fr3gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyc(seqidno:302)lc-fr4fgqgtkveikr(seqidno:303)。在又一个具体的方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在又一个方面，人恒定区选自下组：igg1，igg2，igg2，igg3，和igg4。在又一个具体的方面，人恒定区是igg1。在又一个方面，鼠恒定区选自下组：igg1，igg2a，igg2b，和igg3。在又一个方面，鼠恒定区是igg2a。在又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在又一个具体的方面，最小的效应器功能源自原核细胞中的生成。在又一个具体的方面最小的效应器功能源自“效应器较小的fc突变”或无糖基化。在又一个实施方案中，效应器较小的fc突变是恒定区中的n297a或d265a/n297a替代。在又一个实施方案中，抗pdl1抗体是mpdl3280a(cas登录号：1422185-06-5)。在又一个实施方案中，提供了分离的抗pdl1抗体，其包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含来自seqidno:24或seqidno:28的重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区包含来自seqidno:21的轻链可变区氨基酸序列。在又一个实施方案中，提供了分离的抗pdl1抗体，其包含重链和/或轻链序列，其中：(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seqidno:278)，或(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:279)。在又一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含与至少一种药学可接受载体组合的任一种上文描述的抗pdl1抗体。在又一个实施方案中，提供了分离的核酸，其编码抗pdl1抗体的轻链或重链可变区序列，其中：(a)重链进一步包含与gftfsdswih(seqidno:289)，awispyggstyyadsvkg(seqidno:290)和rhwpggfdy(seqidno:291)分别具有至少85％序列同一性的hvr-h1，hvr-h2和hvr-h3序列，和(b)轻链进一步包含与rasqdvstava(seqidno:292)，sasflys(seqidno:293)和qqylyhpat(seqidno:294)分别具有至少85％序列同一性的hvr-l1，hvr-l2和hvr-l3序列。在一个具体的方面，序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在各方面，重链可变区包含如下的hvr间并置的一个或多个框架序列：(hc-fr1)-(hvr-h1)-(hc-fr2)-(hvr-h2)-(hc-fr3)-(hvr-h3)-(hc-fr4)，且轻链可变区包含如下的hvr间并置的一个或多个框架序列：(lc-fr1)-(hvr-l1)-(lc-fr2)-(hvr-l2)-(lc-fr3)-(hvr-l3)-(lc-fr4)。在又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在别的方面，重链框架序列自kabat亚组i，ii，或iii序列衍生。在又一个方面，重链框架序列是vh亚组iii共有框架。在又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：hc-fr1evqlvesggglvqpggslrlscaas(seqidno：295)hc-fr2wvrqapgkglewv(seqidno：296)hc-fr3rftisadtskntaylqmnslraedtavyycar(seqidno：297)hc-fr4wgqgtlvtvsa(seqidno：298)。在又一个方面，轻链框架序列自kabatκi，ii，ii或iv亚组序列衍生。在又一个方面，轻链框架序列是vlκi共有框架。在又一个方面，一个或多个轻链框架序列如下：lc-fr1diqmtqspsslsasvgdrvtitc(seqidno：300)lc-fr2wyqqkpgkapklliy(seqidno：301)lc-fr3gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyc(seqidno：302)lc-fr4fgqgtkveikr(seqidno：303)。在又一个具体的方面，本文中描述的抗体(诸如抗pd-1抗体，抗pdl1抗体，或抗pdl2抗体)进一步包含人或鼠恒定区。在又一个方面，人恒定区选自下组：igg1，igg2，igg2，igg3，和igg4。在又一个具体的方面，人恒定区是igg1。在又一个方面，鼠恒定区选自下组：igg1，igg2a，igg2b，和igg3。在又一个方面，鼠恒定区是igg2a。在又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在又一个具体的方面，最小的效应器功能源自原核细胞中的生成。在又一个具体的方面最小的效应器功能源自“效应器较小的fc突变”或无糖基化。在又一个方面，效应器较小的fc突变是恒定区中的n297a或d265a/n297a替代。在又一个方面，本文中提供了编码本文中描述的任何抗体的核酸。在一些实施方案中，核酸进一步包含适合于表达核酸的载体，所述核酸编码先前描述的抗pdl1，抗pd-1，或抗pdl2抗体之任一种。在又一个具体的方面，载体进一步包含适合于表达核酸的宿主细胞。在又一个具体的方面，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在又一个具体的方面，真核细胞是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(cho)。可以使用本领域中已知的方法，例如通过如下的方法生成抗体或其抗原结合片段，所述方法包括在适合于生成此类抗体或片段的条件下培养含有核酸的宿主细胞，并回收抗体或片段，所述核酸编码适合于表达的形式的先前描述的抗pdl1，抗pd-1，或抗pdl2抗体或抗原结合片段之任一种。在一些实施方案中，分离的抗pdl1抗体是无糖基化的。抗体的糖基化通常是n连接的或o连接的。n连接指碳水化合物模块附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是碳水化合物模块酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。如此，这些三肽序列任一在多肽中的存在创建潜在的糖基化位点。o连接的糖基化指糖n-乙酰基半乳糖胺，半乳糖，或木糖之一附着至羟基氨基酸，最常见丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列，使得去除上文所述三肽序列(用于n连接的糖基化位点)之一，方便地实现自抗体去除糖基化位点。可以通过将糖基化位点内的天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸残基用另一种氨基酸残基(例如甘氨酸，丙氨酸或保守氨基酸替代)替代来进行改变。在本文中的任何实施方案中，分离的抗pdl1抗体能结合人pdl1(例如uniprotkb/swiss-prot登录号q9nzq7.1中所示人pdl1)或其变体。在又一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含如本文中提供的抗pdl1，抗pd-1，或抗pdl2抗体或其抗原结合片段和至少一种药学可接受载体。在一些实施方案中，对个体施用的抗pdl1，抗pd-1，或抗pdl2抗体或其抗原结合片段是包含一种或多种药学可接受载体的组合物。可以使用本文中描述的或本领域中已知的任何药学可接受载体。在一些实施方案中，本文所述抗pdl1抗体在配制剂中，该配制剂包含量为约60mg/ml的抗体，浓度为约20mm的组氨酸乙酸酯，浓度为约120mm的蔗糖，和浓度为0.04％(w/v)的聚山梨酯(例如聚山梨酯20)，而且该配制剂具有约5.8的ph。在一些实施方案中，本文所述抗pdl1抗体在配制剂中，该配制剂包含量为约125mg/ml的抗体，浓度为约20mm的组氨酸乙酸酯，浓度为约240mm的蔗糖，和浓度为0.02％(w/v)的聚山梨酯(例如聚山梨酯20)，而且该配制剂具有约5.5的ph。供本发明中使用的例示性tim3拮抗剂本文中提供的是用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，pd-1轴结合拮抗剂，和tim-3拮抗剂。在一个实施方案中，该tim-3拮抗剂为抗tim-3抗体。在一些实施方案中，该抗tim3于37℃120分钟后诱导至少45％的细胞上表达的tim3内在化，如通过facs分析测定的。该细胞为例如rpmi8226细胞(ccl-155tm)。在一个实施方案中，该抗体于37℃120分钟后诱导至少55％的tim3表达性rpmi8226细胞(ccl-155tm)上的tim3内在化，如通过facs分析测定的。在一个实施方案中，该抗体于37℃240分钟后诱导至少60％的tim3表达性rpmi8226细胞(ccl-155tm)上的tim3内在化，如通过facs分析测定的。在一个实施方案中，该抗体于37℃240分钟后诱导至少65％的tim3表达性rpmi8226细胞(ccl-155tm)上的tim3内在化，如通过facs分析测定的。在一些实施方案中，该抗tim3抗体与包含tim3_0016的vh和vl的抗tim3抗体竞争结合tim3。在一些实施方案中，该抗tim3抗体结合人和食蟹猴tim3。在一些实施方案中，该抗tim3抗体作为免疫缀合物对tim3表达性细胞显示细胞毒性活性。在一个此类实施方案中，该免疫缀合物作为假单胞菌外毒素a缀合物对rpmi-8226细胞具有0.1或更低的细胞毒性活性的相对ic50值。在一个实施方案中，该抗tim3抗体诱导干扰素-γ释放，如通过mlr测定法测定的。在某些实施方案中，该抗tim3抗体结合人和食蟹猴tim3且诱导干扰素-γ释放，如通过mlr测定法测定的。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的hvr：(a)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:307的氨基酸序列的hvr-l1；或包含seqidno:314的氨基酸序列的hvr-l1；或包含seqidno:315的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:307的氨基酸序列的hvr-l1；或包含seqidno:314的氨基酸序列的hvr-l1；或包含seqidno:315的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:307的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:314的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:315的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vhhvr序列：(i)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vlhvr序列：(i)包含seqidno:307的氨基酸序列的hvr-l1；或包含seqidno:314的氨基酸序列的hvr-l1；或包含seqidno:315的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2，和(c)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:307的氨基酸序列的hvr-l1；或包含seqidno:314的氨基酸序列的hvr-l1；或包含seqidno:315的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno：309的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno：304的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno：305的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno：306的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:307的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:304的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:305的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:306的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:314的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:308的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno：309的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno：304的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno：305的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno：306的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno：315的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno：308的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:309的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，此类抗tim3抗体包含i)seqidno:310的vh序列和seqidno:311的vl序列；ii)seqidno：312的vh序列和seqidno：313的vl序列；或iii)i)或ii)下的抗体的vh和vl的人源化变体。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的hvr：(a)包含seqidno：316的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：317的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：318的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno：319的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno：320的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno：321的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)包含seqidno：316的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：317的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：318的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:319的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:320的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:321的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vhhvr序列：(i)包含seqidno:316的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:317的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:318的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vlhvr序列：(i)包含seqidno:319的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:320的氨基酸序列的hvr-l2，和(c)包含seqidno:321的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:316的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:317的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:318的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:319的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:320的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:321的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，此类抗tim3抗体包含i)seqidno:322的vh序列和seqidno:323的vl序列；或ii)i)下的抗体的vh和vl的人源化变体。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的hvr：(a)包含seqidno:324的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:325的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:326的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:327的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:328的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:329的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)包含seqidno:324的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:325的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:326的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:327的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:328的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:329的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vhhvr序列：(i)包含seqidno:324的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:325的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:326的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vlhvr序列：(i)包含seqidno:327的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:328的氨基酸序列的hvr-l2，和(c)包含seqidno:329的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:324的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:325的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:326的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:327的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:328的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:329的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，此类抗tim3抗体包含i)seqidno:330的vh序列和seqidno:331的vl序列；ii)i)下的抗体的vh和vl的人源化变体。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的hvr：(a)包含seqidno:332的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:333的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:334的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:335的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:336的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:337的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)包含seqidno:332的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:333的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:334的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:335的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:336的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:337的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vhhvr序列：(i)包含seqidno:332的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:333的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:334的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vlhvr序列：(i)包含seqidno:335的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:336的氨基酸序列的hvr-l2，和(c)包含seqidno:337的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:332的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:333的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:334的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:335的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:336的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:337的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，此类抗tim3抗体包含i)seqidno:338的vh序列和seqidno:339的vl序列；ii)i)下的抗体的vh和vl的人源化变体。在一个方面，本发明提供一种抗tim3抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的hvr：(a)包含seqidno:340的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:341的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:342的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:343的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:344的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:345的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)包含seqidno:340的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:341的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:342的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:343的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:344的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:345的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vhhvr序列：(i)包含seqidno:340的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:341的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:342的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vlhvr序列：(i)包含seqidno:343的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:344的氨基酸序列的hvr-l2，和(c)包含seqidno:345的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:340的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:341的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:342的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:343的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:344的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:345的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，此类抗tim3抗体包含i)seqidno:346的vh序列和seqidno:347的vl序列；ii)i)下的抗体的vh和vl的人源化变体。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的hvr：(a)包含seqidno:348的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:349的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:350的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:351的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:352的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:353的氨基酸序列的hvr-l3。在一个方面，本发明提供一种抗tim3抗体，其包含(a)包含seqidno:348的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:349的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:350的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:351的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:352的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:353的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vhhvr序列：(i)包含seqidno:348的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:349的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:350的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vlhvr序列：(i)包含seqidno:351的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:352的氨基酸序列的hvr-l2，和(c)包含seqidno:353的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:348的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:349的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:350的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:351的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:352的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:353的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，此类抗tim3抗体包含i)seqidno:354的vh序列和seqidno:355的vl序列；ii)i)下的抗体的vh和vl的人源化变体。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的hvr：(a)包含seqidno:356的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:357的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:358的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:359的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:360的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:361的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)包含seqidno:356的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:357的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:358的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:359的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:360的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:361的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vhhvr序列：(i)包含seqidno:356的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:357的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:358的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vlhvr序列：(i)包含seqidno:359的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:360的氨基酸序列的hvr-l2，和(c)包含seqidno:361的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:356的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:357的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:358的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:359的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:360的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:361的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，此类抗tim3抗体包含i)seqidno:362的vh序列和seqidno:363的vl序列；ii)i)下的抗体的vh和vl的人源化变体。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的hvr：(a)包含seqidno:364的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:365的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:366的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:367的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:368的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:369的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)包含seqidno:364的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno:365的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno:366的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno:367的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno:368的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno:369的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vhhvr序列：(i)包含seqidno:364的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:365的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:366的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的vlhvr序列：(i)包含seqidno:367的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:368的氨基酸序列的hvr-l2，和(c)包含seqidno:369的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，该抗tim3抗体包含(a)如下的vh域，该vh域包含(i)包含seqidno:364的氨基酸序列的hvr-h1，(ii)包含seqidno:365的氨基酸序列的hvr-h2，和(iii)包含选自seqidno:366的氨基酸序列的hvr-h3；和(b)如下的vl域，该vl域包含(i)包含seqidno:367的氨基酸序列的hvr-l1，(ii)包含seqidno:368的氨基酸序列的hvr-l2，和(iii)包含seqidno:369的氨基酸序列的hvr-l3。在一个实施方案中，此类抗tim3抗体包含i)seqidno:370的vh序列和seqidno:371的vl序列；ii)i)下的抗体的vh和vl的人源化变体。在上述实施方案任一中，抗tim3抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗tim3抗体包含上述实施方案任一中的hvr，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一个实施方案中，抗tim3抗体包含上述实施方案任一中的hvr，且进一步包含包含此类hvr的vh和vl。在又一个方面，该抗tim3抗体与本文中提供的抗tim3抗体结合相同表位。例如，在某些实施方案中，提供了与包含seqidno:310的vh序列和seqidno:311的vl序列的抗tim3抗体结合相同表位的抗tim3抗体，或与包含seqidno:312的vh序列和seqidno:313的vl序列的抗tim3抗体结合相同表位的抗tim3抗体，或与包含seqidno:322的vh序列和seqidno:323的vl序列的抗tim3抗体结合相同表位的抗体，或提供了与包含seqidno:330的vh序列和seqidno:331的vl序列的抗tim3抗体结合相同表位的抗体，或提供了与包含seqidno:338的vh序列和seqidno:339的vl序列的抗tim3抗体结合相同表位的抗体，或提供了与包含seqidno:346的vh序列和seqidno:347的vl序列的抗tim3抗体结合相同表位的抗体，或提供了与包含seqidno:354的vh序列和seqidno:355的vl序列的抗tim3抗体结合相同表位的抗体，或提供了与包含seqidno:362的vh序列和seqidno:363的vl序列的抗tim3抗体结合相同表位的抗体，或提供了与包含seqidno:370的vh序列和seqidno:371的vl序列的抗tim3抗体结合相同表位的抗体。在一个优选的实施方案中，提供了与包含seqidno:310的vh序列和seqidno:311的vl序列的抗tim3抗体结合相同表位的抗体。在一个实施方案中，该抗tim3与包含seqidno:310的vh序列和seqidno:311的vl序列的抗tim3抗体竞争对人tim3的结合，如在使用tim3表达性rpmi-8226细胞(ccl-155tm)的竞争测定法中测定的。在一个实施方案中，依照上述实施方案任一的抗tim3抗体是单克隆抗体，包括嵌合，人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗tim3抗体是抗体片段，例如fv，fab，fab’，scfv，双抗体，或f(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体是全长抗体，例如完整igg1或igg4抗体或本文中定义的其它抗体类或同种型。在又一个方面，依照上述实施方案任一的抗tim3抗体可以单一地或组合地并入本文中描述的任何特征。在一个实施方案中，该抗tim3抗体为wo2011/155607，wo2013/006490，wo03/063792，wo2009/097394，或wo2011/159877中描述的抗体任一。在一个实施方案中，该抗tim3抗体为f38-2e2。在一些实施方案中，该抗tim-3抗体为来自杂交瘤8b.2c12和25f.1d6及如美国专利申请no.2004/0005322和2005/0191721，sabatos,c.a.etal.,natureimmunol.4:1102-1110,2003，及sanchez-fueyo,a.etal.,natureimmunol.4:1093-1012003中公开的那样制备的抗体，据此通过援引收录它们所有，就像完整列出一样。特别涵盖针对tim-3的其它抗体，而且可以例如用本文中公开的方法来制备。tim3人序列的核苷酸和蛋白质序列可见于genbank登录号af251707.1和uniprot登录号q8tdq0。一种例示性人tim3氨基酸序列列于seqidno:380；一种例示性人tim3胞外域氨基酸序列列于seqidno:381。抗体制备如上文描述的，在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抗体(例如抗pd-1抗体，抗pdl1抗体，或抗pdl2抗体)。在一些实施方案中，tim3拮抗剂是抗体(例如抗tim3拮抗性抗体)。可以使用本领域用来生成抗体的可用技术来制备本文中描述的抗体，下面各节中更为详细地描述了其例示性方法。抗体针对感兴趣抗原。例如抗体可以针对pd-1(诸如人pd-1)，pdl1(诸如人pdl1)，pdl2(诸如人pdl2)，tim3(诸如人tim3)。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，而且对罹患病症的哺乳动物施用抗体能在该哺乳动物中导致治疗好处。在某些实施方案中，本文中描述的抗体具有1μm，150nm，100nm，50nm，10nm，1nm，0.1nm，0.01nm，或0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m至10-13m，例如10-9m至10-13m)的解离常数(kd)。在一个实施方案中，kd是通过如下述测定法所述用fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(ria)测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125i)标记抗原平衡fab，然后用抗fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如chenetal.，j.mol.biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(thermoscientific)用50mm碳酸钠(ph9.6)中的5μg/ml捕捉用抗fab抗体(cappellabs)包被过夜，随后用pbs中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(大约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(nunc#269620)中，将100pm或26pm[125i]-抗原与连续稀释的感兴趣fab混合。然后将感兴趣fab温育过夜；然而，温育可持续更长时段(例如约65个小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用pbs中的0.1％聚山梨酯20(tween-)洗板8次。板干燥后，添加150μl/孔闪烁液(microscint-20tm；packard)，然后在topcounttm伽马计数仪(packard)上对板计数10分钟。选择各fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一个实施方案，kd是使用表面等离振子共振测定法使用-2000或-3000(biacore,inc.，piscataway，nj)于25℃使用固定化抗原cm5芯片在约10个响应单位(ru)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(cm5,biacore,inc.)。将抗原用10mm乙酸钠ph4.8稀释至5μg/ml(约0.2μm)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得大约10个响应单位(ru)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1m乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量，于25℃以大约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(tween-20tm)表面活性剂的pbs(pbst)中两倍连续稀释的fab(0.78nm至500nm)。使用简单一对一朗格缪尔(langmuir)结合模型(evaluation软件版本3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(kd)以比率koff/kon计算。参见例如chenetal.,j.mol.biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106m-1s-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(avivinstruments)或8000系列slm-amincotm分光光度计(thermospectronic)中用搅拌比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量pbsph7.2中20nm抗抗原抗体(fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。在一些实施方案中，本文所述抗tim3抗体展现至少100pm或更少的针对人tim3的结合亲和力，至少300pm或更少的针对人tim3的结合亲和力，至少400pm或更少的针对人tim3的结合亲和力，至少40nm或更少的针对人tim3的中和能力，至少120nm或更少的针对人tim3的中和能力，和至少31nm或更少的针对人tim3的中和能力。在这些实施方案中，可以如美国专利no.8,771,697中所述通过表面等离振子共振测量结合亲和力。抗体片段在某些实施方案中，本文中描述的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于fab，fab’，fab’-sh，f(ab’)2，fv，和scfv片段，及下文所描述的其它片段。对于某些抗体片段的综述，参见hudson等,nat.med.9:129-134(2003)。对于scfv片段的综述，参见例如pluckthün,于thepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburg和moore编,(springer-verlag，newyork)，pp.269-315(1994)；亦参见wo93/16185；和美国专利no.5,571,894和5,587,458。对包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的fab和f(ab’)2片段的论述，参见美国专利no.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等,nat.med.9:129-134(2003)；和hollinger等，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于hudson等,nat.med.9:129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域，或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(domantis，inc.，waltham，ma；参见例如美国专利no.6,248,516b1)。可以通过各种技术来制备抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中描述的。嵌合抗体和人源化抗体在某些实施方案中，本文中描述的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利no.4,816,567；及morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984)。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中hvr，例如cdr(或其部分)自非人抗体衍生，而fr(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些fr残基用来自非人抗体(例如衍生hvr残基的抗体)的相应残基替代，例如为了恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体及其生成方法综述于例如almagroandfransson,front.biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如riechmannetal.,nature332:323-329(1988)；queenetal.,proc.nat’lacad.sci.usa86:10029-10033(1989)；美国专利no.5,821,337，no.7,527,791，no.6,982,321，和no.7,087,409；kashmirietal.,methods36:25-34(2005)(记载sdr(a-cdr)嫁接)；padlan,mol.immunol.28:489-498(1991)(记载“重修表面”)；dall’acquaetal.,methods36:43-60(2005)(记载“fr改组”)；及osbournetal.,methods36:61-68(2005)及klimkaetal.,br.j.cancer83:252-260(2000)(记载fr改组的“引导选择”办法)。可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(参见例如simsetal.,j.immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(参见例如carteretal.,proc.natl.acad.sci.usa89:4285(1992)；及prestaetal.,j.immunol.151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如almagroandfransson,front.biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选fr文库衍生的框架区(参见例如bacaetal.,j.biol.chem.272:10678-10684(1997)及rosoketal.,j.biol.chem.271:22611-22618(1996))。人抗体在某些实施方案中，本文中描述的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于vandijkandvandewinkel,curr.opin.pharmacol.5:368-74(2001)及lonberg,curr.opin.immunol.20:450-459(2008)。可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有整个或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述参见lonberg,nat.biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利no.6,075,181和no.6,150,584，其描述了xenomousetm技术；美国专利no.5,770,429，其描述了技术；美国专利no.7,041,870，其描述了k-m技术，和美国专利申请公开文本no.us2007/0061900，其描述了技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如kozbor,j.immunol.133:3001(1984)；brodeuretal.,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987)；及boerneretal.,j.immunol.147:86(1991))。经由人b细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于lietal.,proc.natl.acad.sci.usa103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些记载于例如美国专利no.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人igm抗体)及ni，xiandaimianyixue26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(trioma技术)也记载于vollmersandbrandlein，histologyandhistopathology20(3):927-937(2005)及vollmersandbrandlein，methodsandfindingsinexperimentalandclinicalpharmacology27(3):185-91(2005)。也可以如下生成人抗体，即分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的fv克隆可变域序列。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。文库衍生的抗体可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如hoogenboometal.，inmethodsinmolecularbiology178:1-37(o’brienetal.,ed.,humanpress,totowa,nj,2001)，并且进一步记载于例如mccaffertyetal.，nature348:552-554；clacksonetal.，nature352:624-628(1991)；marksetal.，j.mol.biol.222:581-597(1992)；marksandbradbury，inmethodsinmolecularbiology248:161-175(lo,ed.,humanpress,totowa,nj,2003)；sidhuetal.,j.mol.biol.338(2):299-310(2004)；leeetal.,j.mol.biol.340(5):1073-1093(2004)；fellouse,proc.natl.acad.sci.usa101(34):12467-12472(2004)；及leeetal.,j.immunol.methods284(1-2):119-132(2004)。在某些噬菌体展示方法中，将vh和vl基因的全集分别通过聚合酶链式反应(pcr)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于winteretal.,ann.rev.immunol.12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链fv(scfv)片段或以fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由griffithsetal.,emboj,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的v基因区段，并使用含有随机序列的pcr引物编码高度可变的cdr3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由hoogenboomandwinter,j.mol.biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利no.5,750,373及美国专利公开文本no.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。多特异性抗体在某些实施方案中，本文中描述的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。本文中描述了对folr1和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的例子。在一些实施方案中，该pd1轴成分拮抗剂是多特异性的。结合特异性之一针对pd-1轴成分(例如pd-1，pdl1，或pdl2)，而另一种针对任何其它抗原。在一些实施方案中，结合特异性之一针对il-17或il-17r，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合pd-1轴成分(例如pd-1，pdl1，或pdl2)，il-17，或il-17r的两个不同表位。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。在一些实施方案中，结合特异性之一针对pd-1轴成分(例如pd-1，pdl1，或pdl2)，而另一种针对il-17或il-17r。本文中提供的是用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的多特异性抗体，其中该多特异性抗体包含针对pd-1轴成分(例如pd-1，pdl1，或pdl2)的第一结合特异性和针对il-17或il-17r的第二结合特异性。在一些实施方案中，可以通过本文和下文描述的任何技术来生成多特异性抗体。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见milstein和cuello,nature305:537(1983))，wo93/08829，和traunecker等,emboj.10:3655(1991))，和“突起-入-空穴”工程化(参见例如美国专利no.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(wo2009/089004a1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利no.4,676,980,及brennan等,science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如kostelny等,j.immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如hollinger等,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993))；及使用单链fv(sfv)二聚体(参见例如gruber等,j.immunol.,152:5368(1994))；及如例如tutt等,j.immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如us2006/0025576a1)。本文中的抗体或片段还包括包含结合pd-1轴成分(例如pd-1，pdl1，或pdl2)，il-17，或il-17r及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用fab”或“daf”(参见例如us2008/0069820)。c.核酸序列，载体和生产方法编码t细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如t细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如包含对叶酸受体1(folr1)特异性的第一抗原结合位点和对cd3特异性的第二抗原结合位点的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，和抗体的多核苷酸可用于生成本文中描述的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体。本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体可以作为编码完整双特异性抗原结合分子的单条多核苷酸或作为多条(例如两条或更多条)共表达的多核苷酸来表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体。例如，fab片段的轻链部分可以与双特异性抗体或结合folr1的抗体中包含fab片段的重链部分，fc域亚基和任选(部分)另一个fab片段的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽会与轻链多肽联合以形成fab片段。又例如，本文中提供的t细胞活化性双特异性抗原结合分子中或folr1抗原结合部分中包含两个fc域亚基中的一个和任选(部分)一个或多个fab片段的部分可以与本文中提供的双特异性抗体或结合folr1的抗体中包含两个fc域亚基中的另一个和任选(部分)fab片段的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，fc域亚基会联合以形成fc域。在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸为dna。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸为rna，例如信使rna(mrna)的形式。本发明的rna可以是单链的或双链的。c.抗体变体在某些实施方案中，在上文描述的那些以外，还涵盖本文中提供的对folr1和cd3特异性的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善t细胞活化性双特异性抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码t细胞活化性双特异性抗原结合分子或抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。1.替代，插入，和删除变体在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的变体。替代诱变感兴趣的位点包括hvr和fr。保守替代在表b中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表b中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改进的adcc或cdc。表b依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：(1)疏水性的：正亮氨酸,met,ala,val,leu,ile；(2)中性，亲水性的：cys,ser,thr,asn,gln；(3)酸性的：asp,glu；(4)碱性的：his,lys,arg；(5)影响链取向的残基：gly,pro；(6)芳香族的：trp,tyr,phe。非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个hvr残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。可以对hvr做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对hvr“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如chowdhury,methodsmol.biol.207:179-196(2008))，和/或sdr(a-cdr)做出此类变化，其中对所得的变体vh或vl测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如hoogenboom等于methodsinmolecularbiology178:1-37(o’brien等编,humanpress,totowa,nj,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错pcr，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉hvr指导的方法，其中将几个hvr残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的hvr残基。特别地，经常靶向cdr-h3和cdr-l3。在某些实施方案中，可以在一个或多个hvr内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对hvr做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在hvr“热点”或sdr外部。在上文提供的变体vh和vl序列的某些实施方案中，每个hvr是未改变的，或者含有不超过1，2或3处氨基酸替代。一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将一个残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基诸如arg，asp，his，lys，和glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有n端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的n或c端与酶(例如对于adept)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。2.糖基化变体在某些实施方案中，改变本文中提供的t细胞活化性双特异性抗原结合分子或抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。在与本发明一起使用的t细胞活化性双特异性抗原结合分子或抗体包含fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过n连接附着于fc区的ch2域的asn297。见例如wright等tibtech15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，n-乙酰葡糖胺(glcnac)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的glcnac的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的双特异性抗体或结合dr5的抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。在一个实施方案中，提供了双特异性抗体变体或抗体的变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于asn297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过maldi-tof质谱术测量的，例如如记载于wo2008/077546的。asn297指位于fc区中的约第297位(fc区残基的eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的adcc功能。见例如美国专利公开文本no.us2003/0157108(presta,l.)；us2004/0093621(kyowahakkokogyoco.,ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；wo2002/031140；okazaki等j.mol.biol.336:1239-1249(2004)；yamane-ohnuki等biotech.bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的lec13cho细胞(ripka等arch.biochem.biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请nous2003/0157108a1,presta,l；及wo2004/056312a1,adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因fut8敲除cho细胞(见例如yamane-ohnuki等biotech.bioeng.87:614(2004)；kanda,y.等,biotechnol.bioeng.,94(4):680-688(2006)；及wo2003/085107)。进一步提供了具有两分型寡糖的t细胞活化性双特异性抗原结合分子变体或抗体变体，例如其中附着于结合folr1的t细胞活化性双特异性抗原结合分子的fc区的双触角寡糖是通过glcnac两分的。此类t细胞活化性双特异性抗原结合分子变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能。此类抗体变体的例子记载于例如wo2003/011878(jean-mairet等)；美国专利no.6,602,684(umana等)；及us2005/0123546(umana等)。还提供了在附着于fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的cdc功能。此类抗体变体记载于例如wo1997/30087(patel等)；wo1998/58964(raju,s.)；及wo1999/22764(raju,s.)。3.经半胱氨酸工程化改造的抗体变体在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体，例如，“thiomab”，其中t细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于t细胞活化性双特异性抗原结合分子的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的v205(kabat编号方式)；重链的a118(eu编号方式)；和重链fc区的s400(eu编号方式)。可以如例如美国专利no.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。e.重组方法和组合物可以例如通过固相肽合成(例如merrifield固相肽合成)或重组生成来获得本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体。对于重组生成，分离一种或多种编码所述t细胞活化性双特异性抗原结合分子或抗体(或片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序此类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有t细胞活化性双特异性抗原结合分子或抗体的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于maniatis等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,n.y.(1989)；和ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandwileyinterscience,n.y(1989)的技术。表达载体可以是质粒，病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中(在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中)克隆编码t细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)或抗体(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(tag，tga或taa)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子，核糖体结合位点，转录终止子，内含子，5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如在单一载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体，多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码t细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)或抗体或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mrna的转录并且若两个dna片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰dna模板被转录的能力，则两个dna片段(诸如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导dna的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子，操纵基因，阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，连同内含子-a)，猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳斯(rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因诸如肌动蛋白，热休克蛋白，牛生长激素和家兔a-球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点，翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或ires，亦称为cite序列)。表达盒还可以包含其它特征，诸如复制起点和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复(ltr)或腺伴随病毒(aav)反向末端重复(itr)。本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌t细胞活化性双特异性抗原结合分子或抗体，那么可以将编码信号序列的dna置于编码本发明双特异性抗体或本发明结合dr5的抗体或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长中的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽n端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织纤溶酶原激活剂(tpa)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记t细胞活化性双特异性抗原结合分子的短蛋白质序列的dna纳入t细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)或抗体(片段)编码多核苷酸内或其末端。在又一个实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明t细胞活化性双特异性抗原结合分子或抗体或其部分的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何种类能工程化改造以生成本文中公开的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如folr1t细胞活化性双特异性抗原结合分子，或本发明的抗体，例如抗pd-1抗体，抗pd-l1抗体，和抗tim3抗体或其片段的细胞系统。适用于复制本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体及支持其表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导此类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(cho)，昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，特别是在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中与细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合多肽编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见gerngross,natbiotech22,1409-1414(2004)，和li等,natbiotech24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利no.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的plantibodiestm技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚肾系(293或293t细胞，如例如记载于graham等，jgenvirol36，59(1977))，幼仓鼠肾细胞(bhk)，小鼠塞托利(sertoli)细胞(tm4细胞，如例如记载于mather,biolreprod23,243-251(1980)的)，猴肾细胞(cv1)，非洲绿猴肾细胞(vero-76)，人宫颈癌细胞(hela)，犬肾细胞(mdck)，牛鼠(buffalorat)肝细胞(brl3a)，人肺细胞(w138)，人肝细胞(hepg2)，小鼠乳房肿瘤细胞(mmt060562)，tri细胞(如例如记载于mather等,annalsn.y.acadsci383,44-68(1982)的)，mrc5细胞和fs4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub等,procnatlacadsciusa77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如yo，ns0，p3x63和sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如yazaki和wu，methodsinmolecularbiology，第248卷(b.k.c.lo编，humanapress,totowa,nj),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞，酵母细胞，昆虫细胞，细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(cho)细胞，人胚肾(hek)细胞或淋巴样细胞(例如y0，ns0，sp20细胞)。本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域诸如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。可以将任何动物种类的抗体，抗体片段，抗原结合域或可变区用于本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子。可用于本发明的非限制性抗体，抗体片段，抗原结合域或可变区可以是鼠，灵长类或人起源的。如果t细胞活化性双特异性抗原结合分子意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如winter的美国专利no.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)cdr嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(sdr或a-cdr；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如almagro和fransson,frontbiosci13，1619-1633(2008)，并且还记载于例如riechmann等,nature332,323-329(1988)；queen等,procnatlacadsciusa86,10029-10033(1989)；美国专利no.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；jones等,nature321,522-525(1986)；morrison等,procnatlacadsci81,6851-6855(1984)；morrison和oi,advimmunol44,65-92(1988)；verhoeyen等,science239,1534-1536(1988)；padlan,molecimmun31(3),169-217(1994)；kashmiri等,methods36,25-34(2005)(描述sdr(a-cdr)嫁接)；padlan,molimmunol28,489-498(1991)(描述“表面重建”)；dall’acqua等,methods36,43-60(2005)(描述“fr改组”)；和osbourn等,methods36，61-68(2005)以及klimka等，brjcancer83，252-260(2000)(描述了fr改组的“引导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于vandijk和vandewinkel,curropinpharmacol5,368-74(2001)以及lonberg，curropinimmunol20，450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分及自其衍生(参见例如monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications，pp.51-63(marceldekker，inc.，newyork，1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原刺激而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如lonberg，natbiotech23，1117-1125(2005))。还可以通过分离自人衍生的噬菌体展示库选择的fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如hoogenboom等，于methodsinmolecularbiology178,1-37(o’brien等编,humanpress,totowa,nj,2001)；和mccafferty等,nature348,552-554；clackson等,nature352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链fv(scfv)片段或作为fab片段。在某些实施方案中，将可用于本发明的抗原结合模块工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于美国专利申请公开文本no.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(elisa)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在biacoret100系统上分析)(liljeblad等,glycoj17,323-329(2000))和传统的结合测定法(heeley，endocrres28，217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体，抗体片段，抗原结合域或可变域(例如与v9抗体竞争对cd3的结合的抗体)。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在morris(1996)“epitopemappingprotocols,”于methodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原(例如cd3)在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一经标记抗体(例如us6,054,297中描述的v9抗体)和测试其与第一抗体竞争对抗原的结合的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对抗原的结合。参见harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanualch.14(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny)。在某些实施方案中，将可用于本发明的抗原结合模块工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于美国专利申请公开文本no.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(elisa)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子或抗体结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在biacoret100系统上分析)(liljeblad等,glycoj17,323-329(2000))和传统的结合测定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体，抗体片段，抗原结合域或可变域。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在morris(1996)“epitopemappingprotocols,”于methodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一经标记抗体和测试其与第一抗体竞争对抗原的结合的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对抗原的结合。参见harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanualch.14(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny)。可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体，所述技术诸如高效液相层析，离子交换层析，凝胶电泳，亲和层析，大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷，疏水性，亲水性等因素，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，可以使用双特异性抗体或结合dr5的抗体结合的抗体，配体，受体或抗原。例如，对于本发明的双特异性抗体的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白a或蛋白g的基质。可以连续使用蛋白a或g亲和层析和大小排阻层析来分离双特异性抗体，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定双特异性抗体或结合dr5的抗体的纯度，包括凝胶电泳，高压液相层析等。c.测定法可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如包含对叶酸受体1(folr1)特异性的第一抗原结合位点和对cd3特异性的第二抗原结合位点的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体，例如抗pd-1轴结合拮抗性抗体和抗tim3拮抗性抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。1.亲和力测定法可以依照实施例中提出的方法使用标准的仪器如biacore仪(gehealthcare)通过表面等离振子共振(spr)测定本文中提供的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如包含对叶酸受体1(folr1)特异性的第一抗原结合位点和对cd3特异性的第二抗原结合位点的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体，例如抗pd-1轴结合拮抗性抗体和抗tim3拮抗性抗体对它们相应抗原，例如folr1，pd-1，pd-l1，tim3的亲和力，而且诸如可以通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者，可以例如通过流式细胞术(facs)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估本文中提供的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体对它们相应抗原的结合。可以通过表面等离振子共振使用t100仪(gehealthcare)于25℃测量kd。为了分析fc部分与fc受体之间的相互作用，通过固定化于cm5芯片上的抗5xhis抗体(qiagen)(“5xhis”作为seqidno:392公开)来捕捉带his标签的重组fc受体并将双特异性构建体用作分析物。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(cm5,gehealthcare)依照供应商说明书用n-乙基-n’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺氢氯化物(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化。将抗5xhis抗体(“5xhis”作为seqidno:392公开)用10mm醋酸钠ph5.0稀释至40μg/ml，接着以5μl/分钟的流速注射以实现约6500响应单位(ru)的偶联蛋白质。在注射配体后，注射1m乙醇胺以封闭未反应的基团。然后，在4或10nm捕捉fc受体60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体的4倍连续稀释液(范围为约500nm至4000nm)在hbs-ep(gehealthcare,10mmhepes,150mmnacl,3mmedta,0.05％表面活性剂p20,ph7.4)中于25℃以30μl/min的流速注射120秒。为了测定对靶抗原的亲和力，通过固定化于活化cm5传感器芯片表面上的抗人fab特异性抗体(gehealthcare)来捕捉双特异性构建体，如对于抗5xhis抗体(“5xhis”作为seqidno:392公开)所描述的。偶联蛋白质的最终量为约12000ru。双特异性构建体在300nm捕捉90秒。使靶抗原在从250至1000nm的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池达180秒。监测解离达180秒。通过扣除在参照流动池上获得的响应来校正批量折射率(bulkrefractiveindex)差异。使用稳定态响应通过langmuir结合等温线的非线性曲线拟合来导出解离常数kd。使用简单的1对1langmuir结合模型(biacoret100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k结合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(kd)计算为比率k解离/k结合。参见例如chen等,jmolbiol293,865-881(1999)。2.结合测定法和其它测定法在一个方面，对本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如包含对叶酸受体1(folr1)特异性的第一抗原结合位点和对cd3特异性的第二抗原结合位点的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体，例如抗pd-1轴结合拮抗性抗体和抗tim3拮抗性抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如elisa，western印迹，等来进行。在另一个方面，可使用竞争测定法来鉴定与特定参照抗体竞争对相应抗原的结合的抗体或片段。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与特定参照抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见morris(1996)“epitopemappingprotocols”,methodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)。实施例部分描述了别的方法。3.活性测定法在一个方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的本文中提供的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如包含对叶酸受体1(folr1)特异性的第一抗原结合位点和对cd3特异性的第二抗原结合位点的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体，例如抗pd-1轴结合拮抗性抗体和抗tim3拮抗性抗体的测定法。生物学活性可包括例如诱导dna片段化，诱导凋亡和靶细胞裂解。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。在某些实施方案中，对本发明的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体测试此类生物学活性。用于检测细胞裂解(例如通过测量ldh释放)或凋亡(例如使用tunel测定法)的测定法是本领域公知的。用于测量adcc或cdc的测定法还记载于wo2004/065540(参见其中的实施例1)，通过述及将其完整内容收入本文。d.药物配制剂通过混合具有期望纯度的此类t细胞活化性双特异性抗原结合分子或抗体与一种或多种任选的药学可接受载剂(remington’spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.编(1980))以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如包含对叶酸受体1(folr1)特异性的第一抗原结合位点和对cd3特异性的第二抗原结合位点的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗体，例如抗pd-1轴结合拮抗性抗体和抗tim3拮抗性抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苄索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)。本文中的例示性的药学可接受载剂进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuph20(baxterinternational,inc.)。某些例示性的shasegp和使用方法，包括rhuph20记载于美国专利公开文本no.2005/0260186和2006/0104968。在一个方面，将shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利no.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利no.6,171,586和wo2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如remington′spharmaceuticalsciences,第16版,osol,a.编(1980)。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形物品形式，例如膜，或微胶囊。要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。e.治疗性方法和组合物可以在治疗性方法中使用本文中提供的包含一种或多种t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗pd-1轴结合拮抗性抗体和任选的tim3拮抗剂的治疗剂组合。在一个方面，提供了作为药物使用的结合叶酸受体1(folr1)和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于与抗pd-1轴结合拮抗性抗体组合使用。在某些实施方案中，提供了用于与抗pd-1轴结合拮抗性抗体组合使用的结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于在治疗方法中使用。在某些实施方案中，该组合进一步包含tim3拮抗剂，例如抗tim3拮抗性抗体。在某些实施方案中，本发明提供了用于在治疗具有癌症的个体的方法中使用的结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗pd-1轴结合拮抗性抗体，该治疗包括对个体施用有效量的结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗pd-1轴结合拮抗性抗体。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种tim3拮抗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。在一个优选实施方案中，所述癌症是胰腺癌，肉瘤或结直肠癌。在其它实施方案中，该癌症为结直肠癌，肉瘤，头和颈癌，鳞状细胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌或间皮瘤。在该癌症为乳腺癌的实施方案中，该乳腺癌可以是三重阴性乳腺癌。在又一个方面，本发明提供了包含结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗pd-1轴结合拮抗性抗体的治疗剂组合在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该组合进一步包含tim3拮抗剂。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，该药物用于治疗癌症的方法，其包括对具有癌症的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。在又一个方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对具有癌症的个体施用有效量的包含结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗pd-1轴结合拮抗性抗体的治疗剂组合。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下文所描述的。在一个此类实施方案中，该至少一种另外的治疗剂是抗tim3拮抗性抗体。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。在一个优选实施方案中，所述癌症是胰腺癌，肉瘤或结直肠癌。在其它实施方案中，该癌症为结直肠癌，肉瘤，头和颈癌，鳞状细胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌或间皮瘤。在又一个方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如在任何上述治疗性方法中使用，和抗pd-1轴结合拮抗性抗体。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合folr1的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和药学可接受载剂。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗pd-1轴结合拮抗性抗体和至少一种另外的治疗剂，例如如下文所描述的。可以通过任何合适的手段，包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用双特异性抗体。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用，推注施用，和脉冲输注。双特异性抗体可以以一种符合良好的医学实践的方式配制，确定剂量及施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症，所治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状况，病症的起因，药剂投递的部位，施用的方法，施用进度，以及医学从业人员知道的其它因素。双特异性抗体无需但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量，病症或治疗的类型，及上文讨论的其它因素。这些药剂通常以本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以约1-99％的本文所述剂量使用，或以凭经验/临床确定为合适的任何剂量并通过任何途径使用。为了预防或治疗疾病，双特异性抗体的合适剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体的种类，疾病的严重性和病程，所给予双特异性抗体的预防或治疗目的，之前的疗法，患者的临床史和对双特异性抗体的应答及主治医师的斟酌决定。双特异性抗体适合于在一次或一系列的治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的双特异性抗体或结合dr5的新颖抗体可作为首次候选剂量给予患者，无论是例如通过一次或多次分开的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一种典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗通常会持续直至出现疾病症状得到期望的抑制为止。双特异性抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg的一剂或多剂。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周(例如使得患者得到约2-约20剂，或例如约6剂双特异性抗体)。可给予初始较高的加载剂量，接着给予较低的一或多剂。然而，可使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法易于监测该疗法的进展。应当理解，可以替换结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗pd-1轴结合拮抗性抗体和任选的抗tim3拮抗性抗体或在结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗pd-1轴结合拮抗性抗体和任选的抗tim3拮抗性抗体外使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。l.制品在本发明的另一个方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗，预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，iv溶液袋，等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是双特异性抗体且另外的活性剂是本文所述别的化疗剂。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)其中装有组合物的第一容器，其中组合物包含双特异性抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(bwfi)，磷酸盐缓冲盐水，ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充结合folr1和cd3的t细胞活化性双特异性抗原结合分子和抗pd-1轴结合拮抗性抗体和任选的抗tim3拮抗性抗体。iii.实施例以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。下面是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。通用方法重组dna技术使用标准方法操作dna，如sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息参见：kabat,e.a.etal.,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,nihpublicationno91-3242。dna测序通过双链测序来测定dna序列。基因合成在需要的情况下，期望的基因区段使用适宜的模板通过pcr来生成或由geneartag(regensburg,germany)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸和pcr产物合成。在确切基因序列不可得的情况下，基于来自最近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并通过rt-pcr从源自适宜组织的rna分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入标准的克隆/测序载体。从经转化的细菌纯化质粒dna，并通过uv分光术测定浓度。通过dna测序确认亚克隆的基因片段的dna序列。基因区段设计为具有合适的限制性位点以允许亚克隆入相应的表达载体。所有构建体均设计为具有编码前导肽的5’端dna序列，该前导肽在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。从pbmc分离原代人泛t细胞通过histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)制备外周血单个核细胞(pbmc)，所述制备物自当地血库或来自健康人供体的新鲜血液获得。简言之，将血液用无菌pbs稀释并小心在histopaque梯度(sigma,h8889)上铺层。于室温以450xg离心30分钟后(关闭制动器)，丢弃含pbmc界面上方的血浆部分。将pbmc转移至新的50mlfalcon管并将管用pbs补充至总体积50ml。将混合物于室温以400xg离心10分钟(开启制动器)。丢弃上清液并将pbmc团粒用无菌pbs清洗两次(离心步骤为4℃，350xg，10分钟)。将所得pbmc群自动计数(vicell)并在温箱中在37℃，5％co2在含有10％fcs和1％l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(biochrom,k0302)的rpmi1640培养基中贮存直至测定开始。使用泛t细胞分离试剂盒ii(miltenyibiotec#130-091-156)依照制造商的说明书实施从pbmc富集t细胞。简言之，将细胞团粒以每1千万个细胞40μl冷缓冲液(含0.5％bsa，2mmedta的pbs，无菌过滤)稀释并与每1千万个细胞10μl生物素-抗体混合物一起于4℃温育10分钟。每1千万个细胞添加30μl冷缓冲液和20μl抗生物素磁珠，并将混合物于4℃再温育15分钟。通过添加10-20倍当前体积的缓冲液和300xg，10分钟的随后离心步骤来清洗细胞。将高达1亿个细胞重悬浮于500μl缓冲液。使用ls柱(miltenyibiotec#130-042-401)依照制造商的说明书实施未标记人泛t细胞的磁性分离。将所得t细胞群自动计数(vicell)并在温箱中在37℃，5％co2在aim-v培养基中贮存直至测定开始(不超过24小时)。从pbmc分离原代人幼稚t细胞通过histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)制备外周血单个核细胞(pbmc)，所述制备物(血沉棕黄层)自当地血库或来自健康人供体的新鲜血液获得。使用幼稚cd8+t细胞分离试剂盒(miltenyibiotec#130-093-244)依照制造商的说明书实施从pbmc富集t细胞，但是跳过最后一个cd8+t细胞分离步骤(亦见关于分离原代人泛t细胞的描述)。从脾细胞分离鼠泛t细胞从c57bl/6小鼠分离脾，转移到装有macs缓冲液(pbs+0.5％bsa+2mmedta)的gentlemacsc管(miltenyibiotech#130-093-237)中，并依照制造商的说明书用gentlemacs解离器解离以获得单细胞悬浮液。使细胞悬浮液通过预分离滤器以除去剩余的未解离组织颗粒。于4℃以400xg离心4分钟后，添加ack裂解缓冲液以裂解红血球(于室温温育5分钟)。将剩余细胞用macs缓冲液清洗两次，计数并用于分离鼠泛t细胞。使用泛t细胞分离试剂盒(miltenyibiotec#130-090-861)依照制造商的说明书实施负(磁性)选择。将所得t细胞群自动计数(vicell)并立即用于进一步测定。从肝素化血液分离原代食蟹猴pbmc如下通过密度离心从来自健康食蟹猴供体的新鲜血液制备外周血单个核细胞(pbmc)：将肝素化血液用无菌pbs以1:3稀释，并将lymphoprep介质(axonlab#1114545)用无菌pbs稀释至90％。将2份体积的稀释血液在1份体积的稀释密度梯度上铺层，并通过于室温以520xg离心30分钟(无制动)来分离pbmc级分。将pbmc带转移入新的50mlfalcon管并通过于4℃以400xg离心10分钟用无菌pbs清洗。实施一次低速离心以除去血小板(150xg，15分钟，4℃)，将所得pbmc群自动计数(vicell)并立即用于进一步测定。实施例1生物素化叶酸受体-fc融合物的纯化为了生成针对人folr1的新抗体，作为单价fc融合蛋白(抗原的胞外域连接至fc-节的铰链区，它与与fc-穴分子共表达)生成下述抗原和筛选工具。基于自genbank或swissprot获得的序列合成(geneart，regensburg，germany)抗原基因，并插入表达载体以生成具有fc-节(其具有c端avi标签，供体内或体外生物素化用)的融合蛋白。通过生成期间编码细菌生物素连接酶的细菌bira基因的共表达来实现体内生物素化。所有基因的表达在含有orip元件(其用于质粒在含有ebna的细胞系中的稳定维持)的质粒上的嵌合mpsv启动子控制下。为了制备生物素化单体抗原/fc融合分子，用编码融合蛋白的两种成分(节和穴链)以及bira(生物素化反应必需的一种酶)的三种载体共转染指数式生长中的悬浮hek293ebna细胞。以9.5:9.5:1比率(“抗原ecd-fc节-avi标签”:“fc穴”:“bira”)使用相应的载体。对于500ml摇瓶中的蛋白质生成，在转染之前24小时接种400x106个hek293ebna细胞。对于转染，将细胞以210g离心5分钟，并用预温热的cdcho培养基替换上清液。在20ml含有200μg载体dna的cdcho培养基中重悬浮表达载体。在添加540μl聚乙烯亚胺(pei)之后，将溶液混合15秒并于室温温育10分钟。之后，将细胞与dna/pei溶液混合，转移至500ml摇瓶并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加160mlf17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天，对培养物添加1mm丙戊酸和7％补料1(lonza)。还对生产培养基补充100μm生物素。培养7天后，通过将细胞以210g旋转沉降15分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v)，并保存于4℃。通过使用蛋白a的亲和层析，接着是大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化所分泌的蛋白质。对于亲和层析，将上清液加载到用40ml20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠，ph7.5平衡的hitrap蛋白ahp柱(cv＝5ml，gehealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠，ph7.5清洗来去除未结合的蛋白质。使用在20个柱体积的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0上创建的线性ph梯度洗脱结合的蛋白质。然后用10个柱体积的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0清洗柱。通过添加1/10(v/v)的0.5m磷酸钠，ph8.0来调节收集的级分的ph。将蛋白质浓缩并过滤，之后加载到用20mm组氨酸，140mm氯化钠，ph6.0平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。通过测量280nm处的光密度(od)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的sds毛细管电泳遵循制造商的说明书(instrumentcaliperlabchipgx，perkinelmer)分析folr1-fc融合物的纯度和分子量。于25℃使用在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mml-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中平衡的tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析样品的聚集体含量。通过表面等离振子共振测定法分析经过纯化的抗原-fc融合蛋白，使用商品化抗体来确认抗原的正确和天然构象(数据未显示)。表1：为分离，选择和反选择人folr1抗体生成的抗原表2：folr-fc融合物的产率和最终单体含量的汇总。抗原单体[％](sec)产率hufolr110030mg/lcyfolr110032mg/lmufolr110031mg/lhufolr210016mg/lhufolr39538mg/l实施例2具有cd3ε特异性的共同轻链的生成本文中描述的t细胞活化性双特异性分子包含至少一个cd3结合模块。这个模块可以通过免疫接种实验室动物，筛选噬菌体文库或使用已知的抗cd3抗体来生成。具有cd3ε特异性的共同轻链是通过人源化鼠亲本抗cd3ε抗体(ch2527)的轻链而生成的。为了人源化非人起源的抗体，不得不将来自非人抗体(供体)的cdr残基移植到人(受体)抗体的框架上。一般而言，通过将供体序列与潜在受体序列集合比对并选择与供体具有任何合理同源性或在对于结构和活性至关重要的一些位置显示相似氨基酸的来选择受体框架序列。在本案中，抗体受体框架搜索是通过将亲本抗体的小鼠vl域序列与人种系序列集合比对并选择显示高序列同一性的人序列来实施的。令人惊讶的是，在相当不频繁的属于λ型的v域家族7，更加准确的说，hvl_7_46(imgt命名法，genbank登录号z73674)的人轻链中找到了就框架序列同源性而言较好的匹配。随后选择这种不频繁的人轻链作为受体框架，用于人源化ch2527的轻链。将小鼠轻链可变域的三个互补决定区(cdr)嫁接到这种受体框架上。既然框架4区不是种系v基因的可变区的一部分，那么个别进行这个区(j元件)的比对。因而，选择iglj3-02序列用于人源化这种轻链。生成了13种人源化变体(ch2527-vl7_46-1至vl7_46-10，vl7_46-12至vl7_46-14)。它们的差异在于回复突变成鼠v域序列的框架残基(及其组合)或能保持与人种系序列相同的cdr残基(kabat定义)。cdr以外的下述框架残基在最终的人源化vl域变体vl7_46-13中分别回复突变成鼠残基(列出了鼠残基)：v36，e38，f44，g46，g49，和g57。人j元件iglj3-02与鼠亲本抗体的j元件100％相同。实施例3具有cd3ε特异性的人源化变体的spr评估作为2+1tcb型式的嵌合物评估人源化vl变体，即人源化轻链v域与鼠重链v域配对。在proteonxpr36仪器(bio-rad)上进行spr评估。更加准确的说，以垂直取向在抗fab衍生物glm传感器芯片(山羊抗人igg，f(ab’)2片段特异性，jacksonimmunoresearch)上直接自培养物上清液捕捉变体。随后作为单一浓度水平注射下述分析物以分别评估对人和食蟹猴cd3ε的结合：3μmhucd3ε(-1-26)-fc(节)-avi(id807)和2.5μmcycd3ε-(-1-26)-fc(节)-avi-fc(穴)(id873)。将结合响应与鼠对照构建体的结合定性比较，并评级为+(观察到相当的结合)，+/-(观察到降低的结合)和–(没有观察到结合)。在配体捕捉和分析物结合的每个循环之后再生捕捉抗体，并在研究结束时再注射鼠构建体以确认捕捉表面的活性。结果汇总于表3。表3：与ch2527的鼠重链组合的人源化轻链变体的基于spr的定性结合评估。只有最终选择的人源化轻链变体ch2527-vl7_46-13(以粗体字母突显)展现相当的对人和食蟹猴cd3ε的结合。实施例4具有cd3ε特异性的人源化共同轻链的特性为人源化先导分子选择的轻链v域变体为vl7_46-13。测定人性的程度，即人源化v域与人种系v域序列的序列同源性。对于vl7_46-13，与最接近的人种系同系物的总体序列同一性在人源化之前为65％且在人源化之后为80％。忽略cdr区，与最接近的人种系同系物的序列同一性为92％。自表3可知，vl7_46-13是一组13种变体中唯一显示与亲本鼠抗体相当的结合且还保留它的对食蟹猴cd3ε的交叉反应性的人源化vl变体。这一结果指示人源化鼠vl域而不丧失对cd3ε的结合亲和力并非微不足道，这要求几处回复突变成鼠框架残基(特别是g46)同时保留cdr1中的g24。另外，这一结果显示vl域发挥在靶物识别中关键作用。重要的是，基于属于λ型的v域家族7的一种不频繁的人种系且保留对cd3ε的亲和力和特异性的人源化vl域vl7_46-13也适合在fab型式的噬菌体展示抗体文库中用作共同轻链且使得能够成功选择新颖特异性，大大推动结合cd3ε和例如肿瘤靶物且共享相同‘共同’轻链的双特异性分子的生成和生产。实施例5使用自hvk1-39衍生的人种系共同轻链的噬菌体展示抗体文库的生成生成类似全长人igg的双特异性抗体的数种办法利用fc区中诱导两条不同重链异二聚化的修饰。此类例子包括节-入-穴(merchantetal.,natbiotechnol.1998jul；16(7):677-81)，seed(davisetal.,proteinengdessel.2010apr；23(4):195-202)和静电操纵技术(gunasekaranetal.，jbiolchem.2010jun18；285(25):19637-46)。虽然这些办法能够实现两条不同重链的有效异二聚化，但是关联轻和重链的恰当配对仍然是个问题。使用共同轻链(lc)能解决这个问题(merchant，etal.natbiotech16，677-681(1998))。在此，我们描述用于在m13噬菌体上展示的抗体文库的生成。本质上，我们设计了重链与一种恒定(或“共同”)轻链的一种多框架文库。此文库设计用于生成多特异性抗体而不需要使用复杂的技术来避免轻链错配。通过使用共同轻链能方便这些分子的生成，因为不再发生错配，而且方便高度纯的双特异性抗体的分离。与其它型式相比，使用fab片段作为构建块与例如使用scfv片段相比导致更高的热稳定性且没有scfv聚集和分子间scfv形成。文库生成下面描述用于在m13噬菌体上展示的一种抗体文库的生成。本质上，我们设计了重链与一种恒定(或“共同”)轻链的一种多框架文库。我们在文库中使用这些重链(括号中为genbank登录号)：ighv1-46*01(x92343)(seqidno:104)，ighv1-69*06(l22583)(seqidno:105)，ighv3-15*01(x92216)(seqidno:106)，ighv3-23*01(m99660)(seqidno:107)，ighv4-59*01(ab019438)(seqidno:108)ighv5-51*01(m99686)(seqidno:109)。所有重链使用ighj2作为j元件，ighv1-69*06除外，它使用ighj6序列。随机化的设计包括cdr-h1，cdr-h2，和cdr-h3。对于cdr-h1和cdr-h2，选择“软”随机化策略，而且随机化寡核苷酸使得种系序列的氨基酸的密码子以50％存在。除半胱氨酸以外的所有其它氨基酸合起来成为剩余50％。在cdr-h3中，其中因遗传d元件的存在而不存在种系氨基酸，寡核苷酸设计成容许在v元件和j元件之间使用长度为4至9个氨基酸的随机化插入物。那些寡核苷酸在它们的随机化部分中含有例如各自以15％存在的三种氨基酸g/y/s，各自以4.6％存在的氨基酸a/d/t/r/p/l/v/n/w/f/i/e。用于生成抗体文库的例示性方法描述于hoogenboometal.,nucleicacidsres.1991,19,4133-413；leeetal.,j.mol.biol.(2004)340,1073-1093。轻链是自人序列hvk1-39衍生的，而且以未修饰且未随机化的样式使用。这会确保相同的轻链能在没有另外的修饰的情况下用于其它计划。例示性文库选择：依照下述规程在溶液中使用靶抗原x的单体和生物素化胞外域进行对所有亲和力成熟文库的选择。1.在1ml的总体积中将每种文库的1012个噬菌粒颗粒结合至100nm生物素化可溶性抗原达0.5小时。2.捕捉生物素化抗原，并通过添加约5x107个链霉亲合素包被的磁珠达10分钟来分离特异性结合的噬菌体颗粒。3.使用5-10x1mlpbs/tween20和5-10x1mlpbs清洗珠。4.通过添加1ml100mmtea(三乙胺)达10分钟来进行噬菌体颗粒的洗脱，并通过添加500μl1mtris/hclph7.4来中和。5.再感染指数式生长中的大肠杆菌tg1细菌，用辅助噬菌体vcsm13感染，随后peg/nacl沉淀噬菌粒颗粒，在后续轮选择中应用。3-5轮使用恒定的或递减的(自10-7m至2x10-9m)抗原浓度任一进行选择。在第2轮中，使用中性亲合素板代替链霉亲合素珠来实施抗原/噬菌体复合物的捕捉。对所有结合反应补充100nm牛血清清蛋白或脱脂奶粉任一以竞争仅仅因抗体对塑料支持物的粘性结合而产生的不想要的克隆。3或4轮使用递减的抗原浓度进行选择，抗原始于100nm并在最后一轮选择中降至5nm。特异性结合物定义为信号比背景高约5倍，而且通过elisa来鉴定。如下通过elisa鉴定特异性结合物：在中性亲合素板上包被每孔100μl10nm生物素化抗原。添加含有fab的细菌上清液，并使用抗flag/hrp二抗经由它们的flag标签检测结合性fab。以96孔型式作为可溶性fab片段在细菌中表达elisa阳性克隆，并使用proteonxpr36(biorad)通过spr分析对上清液进行动力学筛选实验。鉴定表达具有最高亲和常数的fab的克隆，并对相应的噬菌粒测序。为了进一步表征，经由pcr自噬菌粒扩增fab序列，并经由适宜的限制性位点克隆入人igg1表达载体，用于哺乳动物生成。使用人源化cd3ε特异性共同轻链的噬菌体展示抗体文库的生成在此，我们描述用于在m13噬菌体上展示的抗体文库的生成。本质上，我们设计了重链与一种恒定(或“共同”)轻链的一种多框架文库。此文库设计用于生成igg1p329glala或igg4splepg同种型的含有fc但fcgr结合无活性的t细胞双特异性抗体，其中一个或两个fab识别肿瘤细胞上表达的肿瘤表面抗原，而抗体的剩余fab臂识别t细胞上的cd3e。文库生成下面描述用于在m13噬菌体上展示的一种抗体文库的生成。本质上，我们设计了重链与一种恒定(或“共同”)轻链的一种多框架文库。这个文库设计用于唯独生成igg1p329glala或igg4splepg同种型的含有fc但fcgr结合无活性的t细胞双特异性抗体。经由随机化寡核苷酸仅仅在不同重链的cdr3中引入多样性。用于生成抗体文库的方法是本领域公知的，而且描述于hoogenboometal.,nucleicacidsres.1991,19,4133-413；或leeetal.,j.mol.biol.(2004)340,1073-1093。我们在文库中使用这些重链：ighv1-46*01(x92343)(seqidno:104)，ighv1-69*06(l22583)(seqidno:105)，ighv3-15*01(x92216)(seqidno:106)，ighv3-23*01(m99660)(seqidno:107)，ighv4-59*01(ab019438)(seqidno:108)，ighv5-51*01(m99686)(seqidno:109)。我们在文库中使用自人源化人和食蟹猴cd3ε特异性抗体ch2527衍生的轻链：(vl7_46-13；seqidno:112)。这种轻链没有随机化，在没有任何进一步修饰的情况下使用，以确保与不同双特异性结合物的相容性。所有重链使用ighj2作为j元件，ighv1-69*06除外，它使用ighj6序列。随机化的设计仅聚焦于cdr-h3，而且pcr寡核苷酸设计成容许介于v元件和j元件之间使用长度为4至9个氨基酸的随机化插入物。实施例6自针对folr1的共同轻链文库(包含具有cd3ε特异性的轻链)选择抗体片段通过针对不同物种(人，食蟹猴和鼠)的folr1的噬菌体展示选择获得了抗体16a3，15a1，18d3，19e5，19a4，15h7，15b6，16d5，15e12，21d1，16f12，21a5，21g8，19h3，20g6，和20h7，它们包含具有cd3ε特异性的共同轻链vl7_46-13。克隆16a3，15a1，18d3，19e5，19a4，15h7，15b6，21d1，16f12，19h3，20g6，和20h7选自共同轻链与基于人种系vh1_46的重链全集配对的子文库。在这个子文库中，vh1_46的cdr已经基于6种不同cdr3长度而随机化。克隆16d5，15e12，21a5，和21g8选自共同轻链与基于人种系vh3_15的重链全集配对的子文库。在这个子文库中，vh3_15的cdr3已经基于6种不同cdr3长度而随机化。为了获得物种交叉反应性(或鼠folr1反应性)抗体，在3轮生物淘选中以不同方式变更(或保持恒定)不同物种的folr1：16a3和15a1(人-食蟹猴-人folr1)；18d3(食蟹猴-人-鼠folr1)；19e5和19a4(3轮针对鼠folr1)；15h7，15b6，16d5，15e12，21d1，16f12，21a5，21g8(人-食蟹猴-人folr1)；19h3，20g6，和20h7(3轮针对鼠folr1)。作为n端单体fc融合物在hekebna细胞中瞬时表达作为抗原用于噬菌体展示选择以及基于elisa和spr的筛选的人，鼠和食蟹猴folr1，并经由共表达bira生物素连接酶在位于携带受体链的fc部分(fc节链)c端的avi标签识别序列处进行体内位点特异性生物素化。为了评估针对folr1的特异性，以相同方式生成了两种相关受体，即人folr2和folr3。依照下述样式在溶液中实施多轮选择(生物淘选)：1.在用10μg/ml无关人igg包被的maxisorp板上预清洁约1012个噬菌粒颗粒以消减文库中识别抗原的fc部分的抗体。2.在1ml总体积中在100nm无关非生物素化fc节入穴构建体存在下将非fc结合性噬菌粒颗粒与100nm生物素化人，食蟹猴，或鼠folr1一起温育0.5小时以进一步消减fc结合物。3.通过转移至中性亲合素预包被的微量滴定板的4个孔达10分钟来捕捉生物素化folr1和附着的特异结合噬菌体(在第1和3轮中)。4.使用5xpbs/tween20和5xpbs清洗相应的孔。5.通过对每个孔添加250μl100mmtea(三乙胺)达10分钟来洗脱噬菌体颗粒，并通过将500μl1mtris/hclph7.4添加至来自4个孔的合并洗出液来中和。6.通过在中性亲合素预包被的微量滴定板上与100nm生物素捕捉的folr2或folr3一起温育来后清洁经过中和的洗出液以最终去除fc结合物和非特异性结合物。7.用洗脱的噬菌体颗粒的上清液再感染对数期大肠杆菌tg1细胞，用辅助噬菌体vcsm13感染，在摇床上于30℃温育过夜，随后peg/nacl沉淀噬菌粒颗粒，要用于下一轮选择。3轮使用恒定抗原浓度100nm进行选择。在第2轮，为了避免富集针对中性亲合素的结合物，通过添加5.4x107个链霉亲合素包被的磁珠来实施抗原:噬菌体复合物的捕捉。如下通过elisa鉴定特异性结合物：分别在中性亲合素板和maxisorp板上包被100μl25nm生物素化人，食蟹猴，或鼠folr1和10μg/ml人igg。添加含有fab的细菌上清液，并使用抗flag/hrp二抗经由它们的flag标签检查结合性fab。在人folr1上展现信号且在人igg上呈阴性的克隆通过初选用于进一步分析，并且还以相似方式针对其余两个物种的folr1进行测试。它们以0.5升培养体积在细菌中表达，亲和纯化，并使用biorad的proteonxpr36生物传感器通过spr分析进一步表征。于25℃使用proteonxpr36仪器(biorad)通过表面等离振子共振(spr)测量选定克隆的亲和力(kd)，通过中性亲合素捕捉在nlc芯片上固定化的生物素化人，食蟹猴，和鼠folr1以及人folr2和folr3(阴性对照)。抗原(配体)的固定化：将重组抗原用pbst(10mm磷酸盐，150mm氯化钠ph7.4，0.005％tween20)稀释至10μg/ml，然后以垂直取向以30μl/min注射。分析物的注射：对于‘一击动力学’测量，将注射方向变成水平取向，沿着分开的通道1-5同时注射经过纯化的fab(不同浓度范围)的两倍稀释系列，结合时间200秒，解离时间600秒。沿着第六通道注射缓冲液(pbst)以提供“在线”空白作为参照。使用proteonmanagerv3.1软件中的简单一对一langmuir结合模型通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。作为比koff/kon计算平衡解离常数(kd)。表4列出了对folr1特异性的选定克隆的平衡解离常数(kd)。表4：通过噬菌体展示自包含vl7_46-13(一种对cd3ε特异性的人源化轻链)的共同轻链子文库选择的抗folr1抗体(fab型式)的平衡解离常数(kd)。kd以nm计。实施例7自通用多框架文库选择针对folr1的抗体片段基于通用多框架子文库通过针对不同物种(人，食蟹猴和鼠)的folr1的噬菌体展示选择获得了抗体11f8，36f2，9d11，5d9，6b6，和14e4。在这些多框架子文库中，具有随机化cdr3(3种不同长度)的不同vl域与具有随机化cdr3(6种不同长度)的不同vh域配对。选定克隆是如下vl/vh配对：11f8(vk_1_5/vh_1_69)，36f2(vk_3_20/vh_1_46)，9d11(vk2d_28/vh1_46)，5d9(vk3_20/vh1_46)，6b6(vk3_20/vh1_46)，和14e4(vk3_20/vh3_23)。为了获得物种交叉反应性(或鼠folr1反应性)抗体，在3或4轮生物淘选中以不同方式变更(或保持恒定)不同物种的folr1：11f8(食蟹猴-鼠-人folr1)；36f2(人-鼠-食蟹猴-鼠folr1)；9d11(食蟹猴-人-食蟹猴folr1)；5d9(人-食蟹猴-人folr1)；6b6(人-食蟹猴-人folr1)和14e4(3轮针对鼠folr1)。作为n端单体fc融合物在hekebna细胞中瞬时表达作为抗原用于噬菌体展示选择以及基于elisa和spr的筛选的人，鼠和食蟹猴folr1，并经由共表达bira生物素连接酶在位于携带受体链的fc部分(fc节链)c端的avi标签识别序列处进行体内位点特异性生物素化。为了评估针对folr1的特异性，以相同方式生成了两种相关受体，即人folr2和folr3。依照下述样式在溶液中实施多轮选择(生物淘选)：1.在用10μg/ml无关人igg包被的maxisorp板上预清洁约1012个噬菌粒颗粒以消减文库中识别抗原的fc部分的抗体。2.在1ml总体积中在100nm无关非生物素化fc节入穴构建体存在下将非fc结合性噬菌粒颗粒与100nm生物素化人，食蟹猴，或鼠folr1一起温育0.5小时以进一步消减fc结合物。3.通过转移至中性亲合素预包被的微量滴定板的4个孔达10分钟来捕捉生物素化folr1和附着的特异结合噬菌体(在第1和3轮中)。4.使用5xpbs/tween20和5xpbs清洗相应的孔。5.通过对每个孔添加250μl100mmtea(三乙胺)达10分钟来洗脱噬菌体颗粒，并通过将500μl1mtris/hclph7.4添加至来自4个孔的合并洗出液来中和。6.通过在中性亲合素预包被的微量滴定板上与100nm生物素捕捉的folr2或folr3一起温育来后清洁经过中和的洗出液以最终去除fc结合物和非特异性结合物。7.用洗脱的噬菌体颗粒的上清液再感染对数期大肠杆菌tg1细胞，用辅助噬菌体vcsm13感染，在摇床上于30℃温育过夜，随后peg/nacl沉淀噬菌粒颗粒，要用于下一轮选择。3轮使用恒定抗原浓度100nm进行选择。在第2和4轮，为了避免富集针对中性亲合素的结合物，通过添加5.4x107个链霉亲合素包被的磁珠来实施抗原:噬菌体复合物的捕捉。如下通过elisa鉴定特异性结合物：分别在中性亲合素板和maxisorp板上包被100μl25nm生物素化人，食蟹猴，或鼠folr1和10μg/ml人igg。添加含有fab的细菌上清液，并使用抗flag/hrp二抗经由它们的flag标签检查结合性fab。在人folr1上展现信号且在人igg上呈阴性的克隆通过初选用于进一步分析，并且还以相似方式针对其余两个物种的folr1进行测试。它们以0.5升培养体积在细菌中表达，亲和纯化，并使用biorad的proteonxpr36生物传感器通过spr分析进一步表征。于25℃使用proteonxpr36仪器(biorad)通过表面等离振子共振(spr)测量选定克隆的亲和力(kd)，通过中性亲合素捕捉在nlc芯片上固定化的生物素化人，食蟹猴，和鼠folr1以及人folr2和folr3(阴性对照)。抗原(配体)的固定化：将重组抗原用pbst(10mm磷酸盐，150mm氯化钠ph7.4，0.005％tween20)稀释至10μg/ml，然后以垂直取向以30μl/min注射。分析物的注射：对于‘一击动力学’测量，将注射方向变成水平取向，沿着分开的通道1-5同时注射经过纯化的fab(不同浓度范围)的两倍稀释系列，结合时间分别为150或200秒，解离时间分别为200或600秒。沿着第六通道注射缓冲液(pbst)以提供“在线”空白作为参照。使用proteonmanagerv3.1软件中的简单一对一langmuir结合模型通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。作为比koff/kon计算平衡解离常数(kd)。表5列出了对folr1特异性的选定克隆的平衡解离常数(kd)。表5：通过噬菌体展示自通用多框架子文库选择的抗folr1抗体(fab型式)的平衡解离常数(kd)。kd以nm计。实施例8igg和t细胞双特异性型式的新颖folr1结合物的生成和纯化为了鉴定能够对选定靶细胞的诱导t细胞依赖性杀伤的folr1结合物，将自共同轻链文库或fab文库分离的抗体转变成相应的人igg1型式。简言之，使用fab克隆作为模板，通过标准pcr反应扩增来自噬菌体展示的独特folr1结合物的可变重和可变轻链。纯化pcr产物，并插入(或是通过基于限制性内切核酸酶和连接酶的克隆，或是通过使用来自invitrogen的infusion试剂盒进行的‘重组工程’)合适的表达载体，其中它们融合至适宜的人恒定重或人恒定轻链。这些载体中的表达盒由嵌合mpsv启动子和合成多腺苷酸化位点组成。另外，质粒含有来自eb病毒的orip区，用于在包含ebv核抗原(ebna)的hek293细胞中稳定维持质粒。在pei介导的转染之后，抗体在hek293ebna细胞中瞬时生成，并如描述的那样通过标准蛋白a亲和层析，接着是大小排阻层析来纯化：瞬时转染和生成如下文所述对于所需载体使用pei介导的转染规程在hek293ebna细胞中瞬时生成本文中使用的所有(双特异性)抗体(如果不是自商业来源获得的话)。在cdcho培养基中悬浮无血清培养hek293ebna细胞。对于500ml摇瓶中的生成，在转染之前24小时接种400x106个hek293ebna细胞(对于备选规模，相应调节所有量)。为了转染，将细胞以210xg离心5分钟，用预温热的20mlcdcho培养基替换上清液。在20mlcdcho培养基中混合表达载体至最终量200μgdna。在添加540μlpei溶液之后，漩涡震荡15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与dna/pei溶液混合，转移至500ml烧瓶，并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。在温育时间之后，添加160mlf17培养基，并将细胞培养24小时。转染后1天，添加1mm丙戊酸并添加7％补料1。7天后，收集培养上清液，用于通过以210xg离心15分钟来纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，以终浓度0.01％w/v添加叠氮化钠，并保存于4℃。在生成之后，收获上清液，将含有抗体的上清液过滤通过0.22μm无菌滤器，并保存于4℃直至纯化。抗体纯化使用标准规程以两个步骤纯化所有分子，诸如蛋白a亲和纯化(explorer)和大小排阻层析。将自瞬时生成获得的上清液调节至ph8.0(使用2mtrisph8.0)，并应用于用8个柱体积(cv)的缓冲液a(20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠，ph7.5)平衡的hitrappaff(gehealthcare，柱体积(cv)＝5ml)。在用10cv的缓冲液a清洗之后，使用12cv上变成缓冲液b(20mm柠檬酸钠ph3，100mmnacl，100mm甘氨酸)的ph梯度洗脱蛋白质。合并含有感兴趣蛋白质的级分，并温和地将溶液的ph调节至ph6.0(使用0.5mna2hpo4ph8.0)。使用超浓缩器(vivaspin15r30.000mwcohy，sartorius)将样品浓缩至2ml，随后应用于用20mm组氨酸，ph6.0，140mmnacl，0.01％tween-20平衡的hiloadtm16/60superdextm200制备级(gehealthcare)。通过分析性大小排阻层析分析洗脱级分的聚集体含量。因此，于25℃将30μl每份级分应用于在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mml-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中平衡的tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)。合并含有少于2％寡聚物的级分，并使用超浓缩器(vivaspin15r30.000mwcohy，sartorius)浓缩至1-1.5mg/ml的终浓度。通过测量280nm处的光密度(od)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的sds毛细管电泳遵循制造商的说明书(instrumentcaliperlabchipgx，perkinelmer)分析构建体的纯度和分子量。在液氮中冷冻经过纯化的蛋白质，并保存于-80℃。基于体外表征结果，将选定的结合物转变成t细胞双特异性型式。在这些分子中，以2:1次序排列folr1:cd3结合模块，其中folr1fab位于n端。对于自标准fab文库分离的克隆，作为crossfab生成cd3结合部分(ch1cκ交叉)，而对于来自共同轻链文库的克隆，交叉不是必需的。与igg类似地生成和纯化这些双特异性分子。表6：分别为igg和tcb型式的新颖folr1结合物的产量和单体含量。clc：共同轻链实施例92+1和1+1t细胞双特异性型式对一种共同轻链结合物(16d5)制备了四种不同t细胞双特异性型式并对一种来自fab文库的结合物(9d11)生成了三种型式以比较它们的体外杀伤特性。标准型式为早已描述的2+1倒转型式(以2:1次序排列folr1:cd3结合模块，其中folr1fab位于n端)。在2+1经典型式中，以2:1次序排列folr1:cd3结合模块，其中cd3fab位于n端。还制备了两种单价型式。1+1头至尾具有分子的同一臂上以1:1次序排列的folr1:cd3结合模块，其中folr1fab位于n端。在1+1经典型式中，folr1:cd3结合模块出现一次，每种在分子的一个臂上。对于自标准fab文库分离的9d11克隆，作为crossfab(ch1cκ交叉)生成cd3结合部分，而对于来自共同轻链文库的16d5，交叉不是必需的。与标准的倒转的t细胞双特异性型式类似地生成并纯化这些双特异性分子。表7：不同t细胞双特异性型式的产量和最终单体含量的汇总。构建体单体[％](sec)产量16d5folr1tcb2+1(倒转的)96％5.4mg/l16d5folr1tcb2+1(经典的)90％4.6mg/l16d5folr1tcb1+1(头至尾)100％5.4mg/l16d5folr1tcb1+1(经典的)100％0.7mg/l9d11folr1tcb2+1(倒转的)100％2.6mg/l9d11folr1tcb1+1(头至尾)100％6.1mg/l9d11folr1tcb1+1(经典的)96％1.3mg/lmov19folr1tcb2+1(倒转的)98％3mg/lmov19folr1tcb1+1(头至尾)100％5.2mg/l实施例10通过表面等离振子共振对folr1结合物的生化表征通过表面等离振子共振(spr)评估作为igg或t细胞双特异性型式的folr1结合物对不同重组叶酸受体(人folr1，2和3，鼠folr1和食蟹猴folr1；均作为fc融合物)的结合。于25℃在biacoret200上实施所有spr实验，以hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4，0.15mnacl，3mmedta，0.005％表面活性剂p20，biacore，freiburg/germany)。单次注射首先通过单次注射分析抗folr1igg(表1)以表征它们的交叉反应性(对人，鼠和食蟹猴folr1)和特异性(对人folr1，人folr2，人folr3)。使用标准偶联指令(biacore，freiburg/germany)直接在sa芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1(folr1-fc)或人叶酸受体2和3(folr2-fc，folr3-fc)的重组生物素化单体fc融合物。固定化水平为约300-400ru。以500nm的浓度注射igg达60秒。因缺乏特异性而排除结合hufolr2和hufolr3的igg。大多数结合物只在人和食蟹猴folr1之间是交叉反应性的，另外的对鼠folr1的交叉反应性大多数时间伴有特异性丧失。表8：25种新的叶酸受体1结合物(作为igg)以及两种对照igg(mov19和farletuzumab)的交叉反应性和特异性。+表示结合，-表示无结合，+/-表示弱结合。对叶酸受体1的亲合力如下文所述测定抗folr1igg或t细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲合力(表9)。使用标准偶联指令(biacore，gehealthcare)直接在sa芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1的重组生物素化单体fc融合物(folr1-fc)。固定化水平为约300-400ru。抗folr1igg或t细胞双特异性以2.1至500nm的浓度范围以30μl/min的流速通过流动室达180秒。监测解离达600秒。通过扣除在用重组生物素化il2受体fc融合物固定化的参照流动室上获得的响应来校正批量折射率(bulkrefractiveindex)差异。为了分析19h3igg和鼠叶酸受体1的相互作用，在hbs-ep运行缓冲液中以2.3μm的浓度添加叶酸(sigmaf7876)。自igg或t细胞双特异性的二价结合产生的结合曲线近似1:1langmuir结合，并用该模型拟合(这是不正确的，但是给出亲合力的概念)。使用bia评估软件(gehealthcare)自拟合的速率常数推导相互作用的表观亲合常数。表9：选定folr1结合物作为igg或作为t细胞双特异性(tcb)对人和食蟹猴folr1的二价结合(亲合力及表观kd)。1.对叶酸受体1的亲和力如下文所述测定抗folr1igg或t细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲和力(表10)。为了亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(gehealthcare)于ph5.0在cm5芯片上实施6000-7000个共振单位(ru)左右的抗人fab特异性抗体(fab捕捉试剂盒，gehealthcare)的直接偶联。以20nm及流速10μl/min捕捉抗folr1igg或t细胞双特异性达20或40秒，留下参照流动室没有捕捉。使人或食蟹猴叶酸受体1fc融合物的稀释系列(6.17至500nm或12.35至3000nm)以30μl/min通过所有流动室达120或240秒以记录结合期。解离期监测240秒并通过自样品溶液转换至hbs-ep来触发。在每一个循环之后使用两次注射60秒10mm甘氨酸-hclph2.1或ph1.5来再生芯片表面。通过扣除在参照流动室1上获得的响应来校正批量折射率(bulkrefractiveindex)差异。通过使用bia评估软件(gehealthcare)拟合至1:1langmuir结合自速率常数推导相互作用的亲和力常数。表10：选定folr1结合物作为igg或作为t细胞双特异性(tcb)对人和食蟹猴folr1的单价结合(亲和力)。2.对cd3的亲和力如下文所述测定抗folr1t细胞双特异性和重组人cd3εδ-fc之间的相互作用的亲和力(表11)。为了亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(gehealthcare)于ph5.0在cm5芯片上实施9000个共振单位(ru)左右的抗人fab特异性抗体(fab捕捉试剂盒，gehealthcare)的直接偶联。以20nm及流速10μl/min捕捉抗folr1t细胞双特异性达40秒，留下参照流动室没有捕捉。使人cd3εδ-fc融合物的稀释系列(6.17至500nm)以30μl/min通过所有流动室达240秒以记录结合期。解离期监测240秒并通过自样品溶液转换至hbs-ep来触发。在每一个循环之后使用两次注射60秒10mm甘氨酸-hclph2.1来再生芯片表面。通过扣除在参照流动室1上获得的响应来校正批量折射率(bulkrefractiveindex)差异。通过使用bia评估软件(gehealthcare)拟合至1:1langmuir结合自速率常数推导相互作用的亲和常数。表11：选定folr1t细胞双特异性(tcb)对人cd3-fc的单价结合(亲和力)。配体分析物ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)16d5tcbhucd34.25e+043.46e-038.14e-0821a5tcbhucd33.72e+043.29e-038.8e-08cd3结合部分对于所有构建体是相同的，而且亲和力对于所测量的t细胞双特异性是相似的(kd范围在60和90nm之间)。实施例11t细胞双特异性对叶酸受体1和cd3的同时结合如下文所述测定抗folr1t细胞双特异性对重组叶酸受体1和重组人cd3εδ-fc的同时结合。使用标准偶联指令(biacore，freiburg/germany)直接在sa芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1的重组生物素化单体fc融合物(folr1-fc)。固定化水平为约300-400ru。穿过流动室以流速30μl/min注射500nm抗folr1t细胞双特异性达60秒，接着注射500nmhucd3εδ-fc达60秒。通过扣除在用重组生物素化il2受体fc融合物固定化的参照流动室上获得的响应来校正批量折射率(bulkrefractiveindex)差异。所测试的四种t细胞双特异性(16d5tcb，21a5tcb，51c7tcb和45d2tcb)能够同时结合叶酸受体1和人cd3，正如预期的。实施例12表位分仓(binning)为了表位分仓，使用标准胺偶联试剂盒(gehealthcare)于ph5.0在cm5芯片上直接固定化抗folr1igg或t细胞双特异性，最终响应为700ru左右。然后对500nmhufolr1-fc捕捉60秒，接着对500nm不同结合物捕捉30秒。用两次注射10mm甘氨酸ph2各30秒来再生表面。评估不同结合物是否能结合固定化结合物上捕捉的hufolr1(表12)。表12：选定folr1结合物作为igg或作为t细胞双特异性(tcb)在人folr1上的表位表征。+表示结合，-表示无结合，+/-表示弱结合基于这些结果和另外的固定化hufolr1上同时结合的数据，将结合物分成三个组。不清楚9d11是否具有不同的表位，因为它置换所有其它结合物。16d5和21a5看来在同一组中，而mov19，farletuzumab(coneyetal.,cancerres.1991nov15；51(22):6125-32；kallietal.,curropininvestigdrugs.2007dec；8(12):1067-73)和36f2在另一组中(表13)。然而，36f2结合与mov19和farletuzumab不同的表位，因为它结合人，食蟹猴和鼠folr1。表13：选定folr1结合物作为igg或作为t细胞双特异性(tcb)在人folr1上的表位分组实施例13结合物的选择通过表面等离振子共振(spr)和通过在细胞上进行的体外测定法筛选igg型式的folr1结合物以选择最佳候选者。通过spr分析抗folr1igg以表征它们的交叉反应性(对人，鼠和食蟹猴folr1)和特异性(对人folr1，人folr2，人folr3)。对人folr2和3的非特异性结合视为排除因素。在细胞上确认对人folr1的结合和特异性。一些结合物没有在表达folr1的细胞上结合，尽管它们在spr中识别重组人folr1。测定聚集温度，但是不是排除因素，因为选定结合物都是稳定的。在一项多重反应性elisa中测试选定结合物以检查非特异性结合，这导致排除四种结合物。这一过程导致最初选择三种结合物：36f2(fab文库)，9d11(fab文库)和16d5(共同轻链)。36f2自hufolr1迅速解离，因此最初不是偏爱的。实施例14新生成的folr1结合物对人folr1阳性肿瘤细胞的特异性结合使用fab文库或共同轻链文库(其使用cd3轻链)任一经由噬菌体展示生成了新的folr1结合物。将所鉴定的结合物转变成人igg1型式，并分析对folr1高表达性hela细胞的结合。作为参照分子，包括人folr1结合物mov19。在这项测定法中测试的大多数结合物显示中等至较好的对folr1的结合，其中一些克隆与mov19同等好地结合(见图2)。排除克隆16a3，18d3，15h7，15b6，21d1，14e4和16f12，因为不能通过流式细胞术确认对细胞上的folr1的结合。在下一个步骤中，通过排除对密切相关人folr2的结合来对选定克隆测试对人folr1的特异性。用人folr1或人folr2任一瞬时转染hek细胞以分析特异性。自fab文库衍生的克隆36f2和9d11和自clc文库衍生的克隆16d5和21a5特异性结合人folr1且不结合人folr2(见图3a-b)。所有其它测试的克隆显示至少一些对人folr2的结合(见图3a-b)。因此，自进一步表征排除这些克隆。平行地，通过实施用食蟹猴folr1瞬时转染的hek细胞结合研究来分析folr1克隆对食蟹猴folr1的交叉反应性。所有测试的克隆均能够结合食蟹猴folr1，而且四种选定人folr1特异性克隆36f2，9d11，16d5和21a5同等好地结合人和食蟹猴folr1(图4)。随后，将三种人folr1特异性食蟹猴交叉反应性结合物转变成tcb型式并测试对t细胞杀伤和t细胞活化的诱导。这些克隆是来自fab文库的9d11和来自clc文库的16d5和21a5。作为参照分子，在所有研究中包括mov19folr1tcb。然后使用这些folr1tcb来比较结合hela细胞上的folr1后对内在化的诱导。所有三种测试的克隆均在结合folr1后内在化，与mov19folr1tcb在结合后的内在化相当(图5)。21a5folr1tcb因多重反应性的迹象而中止。实施例15由folr1tcb抗体诱导的对folr1表达性肿瘤靶细胞的t细胞介导的杀伤使用folr1tcb来测定t细胞介导的对表达folr1的肿瘤细胞的杀伤。通过qifikit分析使用一组潜在靶细胞系来测定folr1结合位点。所使用的该组肿瘤细胞含有folr1高，中等和低表达性肿瘤细胞和一组folr1阴性细胞系。表14：肿瘤细胞上的folr1结合位点细胞系起源folr1结合位点hela宫颈腺癌2’240’716skov3卵巢腺癌91’510ovcar5卵巢腺癌22’077ht29结直肠腺癌10’135mkn45胃腺癌54测定了三种不同folr1tcb(含有9d11，16d5和mov19结合物)对这组肿瘤细胞系的结合，显示folr1tcb特异性结合folr1表达性肿瘤细胞且不结合folr1阴性肿瘤细胞系。结合的构建体的量与folr1表达水平成比例，而且构建体对可检测的folr1低细胞系ht-29仍然有较好的结合。另外，阴性对照dp47tcb对任何使用的细胞系没有结合(图6a-e)。dp47tcb是非靶向性tcb且如wo2014/131712中所述制备。进一步使用中等表达细胞系skov3和低表达细胞系ht-29来测试t细胞介导的杀伤和t细胞活化，其中使用16d5tcb和9d11tcb；包括dp47tcb作为阴性对照。两种细胞系均在早就很低水平的16d5tcb和9d11tcb存在下被杀死，而且两种tcb之间活性没有差异，尽管9d11tcb比16d5tcb更强地结合folr1。skov3细胞的总体杀伤与ht-29相比要高，ht-29反映比skov3细胞上更高表达水平的folr1(图7a-d)。与此一致，检测到cd4+t细胞和cd8+t细胞上活化标志物cd25和cd69的强上调。t细胞的活化在skov3细胞和ht-29细胞存在下非常相似。阴性对照dp47tcb在所使用浓度没有诱导任何杀伤，而且t细胞上的cd25和cd69没有显著上调。表15：skov3细胞的肿瘤细胞杀伤和t细胞活化的ec50值表16：ht-29细胞的肿瘤细胞杀伤和t细胞活化的ec50值实施例16全血中folr1tcb抗体对红细胞的结合和t细胞活化为了证明在folr1表达性肿瘤细胞缺失下没有自发活化，我们测试了是否有folr1克隆对可能潜在表达folr1的红细胞的结合。我们未能观察到9d11igg，16d5igg和mov19igg对红细胞的任何特异性结合，正如包括在内的阴性对照dp47igg(图8)。为了排除任何别的folr1tcb对血细胞的非特异性结合或经由folr1tcb的非特异性活化，将9d11tcb，16d5tcb和mov19tcb添加入全血，并通过流式细胞术分析cd4+t细胞和cd8+t细胞上cd25和cd69的上调。包括dp47tcb作为阴性对照。通过分析cd4+t细胞和cd8+t细胞上cd25和cd69的上调未能对任何测试的构建体观察到t细胞的活化(图9)。实施例17由不同单价和二价t细胞双特异性型式的36f2tcb和16d5tcb诱导的t细胞杀伤评估由36f2tcb，16d5tcb，16d5tcb经典的，16d5tcb1+1和16d5tcbht抗体介导的对hela，skov-3(中等folr1，约70000-90000个拷贝)和ht-29(低folr1，约10000个)人肿瘤细胞的t细胞杀伤。包括dp47tcb抗体作为阴性对照。使用人pbmc作为效应器，并在与双特异性抗体一起温育24小时时检测杀伤。简言之，用胰蛋白酶/edta收获靶细胞，清洗，并以25000个细胞/孔的密度铺于平底96孔板中。让细胞贴壁过夜。通过将自健康人供体获得的富集淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)进行histopaque密度离心来制备外周血单个核细胞(pbmc)。用无菌pbs稀释新鲜血液并在histopaque梯度(sigma,#h8889)上铺层。离心(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含pbmc的界面上方的血浆并将pbmc转移至新的falcon管，随后装满50mlpbs。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液，用无菌pbs清洗pbmc团粒两次(离心步骤350xg，10分钟)。对所得pbmc群进行自动计数(vicell)并在含10％fcs和1％l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(biochrom，k0302)的rpmi1640培养基中在细胞温箱(37℃,5％co2)中保存直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，以标示浓度添加抗体(范围0.01pm-100nm，一式三份)。以最终e:t比率10:1将pbmc添加至靶细胞。于37℃,5％co2温育24小时后通过对由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液中的ldh进行定量(ldh检测试剂盒,rocheappliedscience,#11644793001)来评估靶细胞杀伤。对靶细胞的最大裂解(＝100％)通过将靶细胞与1％tritonx-100一起温育来实现。最小裂解(＝0％)指在没有双特异性构建体的情况下与效应细胞一起共温育的靶细胞。结果显示由36f2tcb和16d5tcb诱导的对所有三种folr1+靶细胞系的靶物特异性杀伤(图10)。实施例18：抗tim3抗体的生成小鼠的免疫接种对nmri小鼠进行遗传免疫接种，其使用编码全长人tim-3的质粒表达载体通过皮内应用100ug载体dna(质粒15304_htim3-fl)，接着电穿孔(2个1000v/cm矩形脉冲，持续0.1ms，间隔0.125s；接着4个287.5v/cm矩形脉冲，持续10ms，间隔0.125s)进行。小鼠在第0，14，28，42，56，70，和84天连续接受6次免疫接种。在第36，78和92天采集血液并制备血清，用于通过elisa进行的滴度测定(见下文)。选择具有最高滴度的动物在第96天通过静脉内注射50ug重组人tim-3人fc嵌合物进行强化，并通过在强化后3天融合脾细胞与骨髓瘤细胞系通过杂交瘤技术分离单克隆抗体。血清滴度的测定(elisa)在pbs中以0.3ug/ml，100ul/孔在96孔nuncmaxisorp板上固定化人重组tim-3人fc嵌合物，接着是：用含2％croteinc的pbs，200ul/孔封闭板；应用抗血清的连续稀释液，一式两份，在含0.5％croteinc的pbs中，100ul/孔；用hrp缀合的山羊抗小鼠抗体(jacksonimmunoresearch/dianova115-036-071；1/16000)检测。对于所有步骤，将板于37℃温育1小时。在所有步骤之间，将板用含0.05％tween20的pbs清洗3次。通过添加bmbluepod底物溶液(roche)，100ul/孔来发生信号；并通过添加1mhcl，100ul/孔来终止。于450nm读取吸光度，针对690nm作为参照。滴度定义为产生半最大信号的抗血清的稀释度。实施例19：抗tim3抗体的表征针对tim3的elisa将nunc-maxisorp链霉亲合素板(microcoat#11974998/mc1099)用25μl/孔tim3-ecd-his-生物素(用bira连接酶生物素化)包被，并在400rpm旋转的摇动下于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔pbst缓冲液)后，添加25μlatim3样品或经过稀释的(1:2步幅)参照抗体atim3f38-2e2(biolegend)并于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔pbst缓冲液)后，以1:9000稀释度添加25μl/孔绵羊抗小鼠-pod(gena9310v)并在400rpm旋转的摇动下于室温温育1小时。清洗(4x90μl/孔pbst缓冲液)后，添加25μl/孔tmb底物(calbiochem，#cl07)并温育直至od1.5–2.5。然后通过添加25μl/孔1nhcl溶液来停止反应。于370/492nm进行测量。在下文汇总表17中作为ec50值[ng/ml]列出elisa结果。针对tim3的细胞elisa以1.2x10e6细胞/ml的浓度将用编码全长人tim3的质粒15312_htim3-fl_puc_neo稳定转染并用g418(质粒上的新霉素抗性标志物)选择的贴壁cho-k1细胞系接种入384孔平底板并生长过夜。在次日，添加25μl/孔tim3样品或atim3参照抗体f38-2e2(无叠氮化物)(biolegend，354004)并于4℃温育2小时(以避免内在化)。清洗(3x90μl/孔pbst，biotek清洗仪：程序29，1x90)后，通过弹掉残留缓冲液并添加50μl/孔0.05％戊二醛(25％戊二醛(sigma目录号：g5882)在1xpbs缓冲液中1:500稀释)并于室温温育1小时来固定细胞。清洗(3x90μl/孔pbst，biotek清洗仪：程序21，3x90greinlysin)后，添加25μl/孔二抗进行检测(绵羊抗小鼠-pod；辣根pod连接的f(ab′)2片段；gena9310)，接着在400rpm摇动下于室温温育2小时。清洗(3x90μl/孔pbst，biotek清洗仪：程序21，3x90greinlysin)后，添加25μl/孔tmb底物溶液(roche11835033001)并温育直至od1.5–2.5。然后通过添加25μl/孔1nhcl溶液来停止反应。于370/492nm进行测量。下文汇总表17中作为“ec50cho-tim3”值[ng/ml]列出细胞elisa结果。表17：例示性抗体的结合亲和力(elisa和biacore)tim3抗体的biacore表征已经使用基于表面等离振子共振(spr)的测定法来测定数种鼠tim3结合物以及商业性人tim3结合参照之间的结合的动力学参数。因此，通过胺偶联将抗小鼠igg固定化至(biacore)cm5传感器芯片的表面。然后捕捉样品并使人/食蟹猴tim3-ecd结合至它们。在每个分析循环后再生传感器芯片表面。最终通过将数据拟合至1:1langmuir相互作用模型来得到平衡常数kd。通过使用胺偶联试剂盒(gehealthcare)于ph5.0将约12000个响应单位(ru)的30μg/ml抗小鼠igg(gehealthcare#br-1008-38)偶联到biacoreb4000中的cm5传感器芯片的流动室1-4的点1，2，4和5上(点1，5是活动的而点2，4是参照点)。样品和运行缓冲液是hbs-ep+(0.01mhepes，0.15mnacl，3mmedta，0.05％v/v表面活性剂p20，ph7.4)。流动室温度设定为25℃，而样品隔室温度设定为12℃。用运行缓冲液使系统准备好。样品以200μg/ml的浓度注射30秒，并结合至每个流动室的点1和5，容许平行测量八份样品。然后在每份样品上注射一整套不同(单体食蟹猴，单体人和hufc融合的二聚体人tim3-ecd)浓度(见表x)240秒，接着是解离时间30/1800秒(见表1)。每个分析循环(样品捕捉，点1和5–tim3ecd注射)之后用30秒长时间注射甘氨酸-hclph1.7来再生。对于整个运行，流速设定为30μl/min。最终，用biacoreb4000评估软件将双重参照数据拟合至1:1langmuir相互作用模型。所得kd值显示于表17和18。表18：通过biacore测定的结合亲和力-通过动力学spr测量得到的kd值-n.f.表示没有可能的拟合，最有可能是由于结合无或弱。实施例20：抗tim3抗体衍生物的生成嵌合抗体衍生物产生嵌合tim3抗体，其通过经由pcr自抗tim3小鼠抗体tim3-0016，tim3-0016变体(0018)，tim3-0021，tim3-0022，tim3-0026，tim3-0028，tim3-0030，和tim3-0033，tim3-0038扩增可变重和轻链区并将它们作为与人igg1主链/人ch1-铰链-ch2-ch3(具有消除效应器功能的lala和pg突变)(亮氨酸234变成丙氨酸，亮氨酸235变成丙氨酸，脯氨酸329变成甘氨酸)的融合蛋白克隆入重链表达载体，作为与人c-κ的融合蛋白克隆入轻链表达载体。然后将lc和hc质粒共转染入hek293并在7天后通过抗体纯化的标准方法自上清液纯化。去除糖基化位点nyt：通过将n用q或s替代来修饰tim3-0016，tim3_0016变体(命名为0018或tim3_0018)中的1个hvr-l1位置使用agilent“quickchangelightning定点诱变试剂盒”依照制造商的说明书通过体外诱变生成tim3_0016和tim3_0016变体(0018)的可变轻链区内的突变。通过这种方法，将轻链hvr-l1(seqidno:4)中的糖基化位点基序nyt的天冬酰胺(n)用谷氨酰胺(q)替换(产生seqidno:11＝tim3_0016_hvr-l1变体1_nq)，或者，将天冬酰胺(n)用丝氨酸(s)替换(产生seqidno:12＝tim3_0016_hvr-l1变体2_ns)。在这两个糖基化位点中成功修饰了基序nyt。然后将编码变体的lc和hc质粒共转染入hek293并在7天后通过抗体纯化的标准方法自上清液纯化。通过人tim3上的elisa，食蟹猴tim3上的elisa和表达全长人tim3的贴壁cho-k1细胞上的细胞elisa测试所生成的突变体。发现所生成的所有突变体均显示甚至分别比亲本抗体tim3_0016或tim3_0016抗体变体tim3_0018更加功能性的对人tim3(人)，食蟹猴tim3(食蟹猴)或cho细胞上的人timr的结合。表19：实施例21：荧光标记经过纯化的单克隆抗体使用alexafluor488单克隆抗体标记试剂盒(由invitrogen制造)依照制造商的说明书进行杂交瘤衍生的单克隆抗体的荧光标记。标记后，通过tim-3表达性rpmi-8226和pfeiffer细胞的facscalibur(由bdbiosciences制造)分析确认每种抗体是用alexafluor488(此后称作“alexa-488”)阳性标记的。实施例22：使用基于facs的竞争测定法对结合表位组分类通过基于facs的结合竞争测定法分析所生成的抗tim3抗体和六种抗tim3参照抗体之间表位的关系。tim3参照抗体如下：us2012/189617中记载的抗体4177和8213；wo2013/06490中记载的抗体1.7e10和27.12e12；抗体344823(克隆344823，由r&dsystems制造)和抗体f38-2e2(克隆f38-2e2，由biolegend和r&dsystems制造)。简言之，容许测试抗体与tim-3表达性rpmi-8226细胞(ccl-155tm)相互作用及结合，然后通过流式细胞术方法评估另一种抗tim-3抗体是否也能结合tim-3表达性细胞。简言之，将人tim3表达性rpmi-8226细胞与bd人fc封闭液一起于室温温育10分钟，并在两种不同实验设置中染色以排除所测试的抗体的亲和力的差异对结合的影响：1)凭借已公开的经过纯化的抗tim3(10μg/ml，在bd染色缓冲液中于4℃0.5小时)，依照制造商的说明书(molecularprobesa-20181)缀合有alexa*488，平均每个抗体有2.7个荧光团。然后添加a)未标记的(1-4)参照重组抗tim3抗体或同种型对照(10μg/ml)，在bdsb中于4℃0.5小时，并在用bdsb清洗后用pe标记的抗hufcγ抗体染色(jir，109-116-098，1:200，在bd染色缓冲液中于4℃0.5小时)。或者，添加b)pe标记的(5-6)可得参照抗tim3抗体或适宜的同种型对照(10μg/ml)，在bd染色缓冲液中于4℃0.5小时。在清洗和离心后，通过bdbiosciencesfacscanto流式细胞仪分析染色的rpmi-8226细胞的mfi信号。表20：表位表征的汇总来自基于facs的表位组定位的结果显示，tim3_0016和tim3_0016变体tim3_0018显示与任何所测试的抗tim-3参照抗体没有结合竞争，而且提示这些抗体识别与所有先前记载的tim3参照抗体识别的表位不同的新表位，而tim3_0022，tim3_0026，tim3_0028和tim3_0038与多种竞争者不同程度地竞争对jrpmi-8226细胞上表面表达的tim3的结合。实施例23：在混合淋巴细胞反应(mlr)中人抗tim-3抗体对细胞因子生成的影响使用混合淋巴细胞反应来展现阻断tim-3途径对淋巴细胞效应细胞的影响。在抗tim-3单抗存在或缺失下在该测定法中对t细胞测试活化和它们的ifn-γ分泌。使用leukosep(greinerbioone，227288)通过密度梯度离心自健康供体的外周血分离人淋巴细胞。简言之，用三倍体积的pbs稀释肝素化血液，并在50mlleukosep管中将稀释血液的25ml小样分层。于室温以800xg离心15分钟(无中断)后，收获含有淋巴细胞的级分，在pbs中清洗，并在功能测定法中直接使用，或者在冷冻介质(10％dmso，90％fcs)中以1.0e+07个细胞/ml重悬浮并在液氮中保存。在mlr测定法中使用1:1靶/响应细胞比(即每份mlr培养物在总体积200μl中含有来自每位供体的-2.0e+05个pbmc。以不同抗体浓度将抗tim3单克隆抗体tim3_0016，tim3_0016变体(tim3_0018)，tim3_0021，tim3_0022，tim3_0026，tim3_0028，tim3_0030，tim3_0033，tim3_0038和f38-2e2(biolegend)添加至每份培养物。或是不添加抗体或是添加同种型对照抗体作为阴性对照，并添加重组人il-2(20eu/ml)作为阳性对照。将细胞于37℃培养6天。在第6天后，自每份培养物取出100μl培养基用于细胞因子测量。使用opteiaelisa试剂盒(bdbiosciences)测量ifn-γ的水平。结果显示于表21(ifn-g分泌/释放)。抗tim-3单克隆抗体以浓度依赖性方式促进t细胞活化和ifn-γ分泌。抗tim3抗体tim3_0021，tim3_0022，tim3_0028，和tim3_0038比f38-2e2抗体更多地降低炎性细胞因子ifn-γ)的释放。tim3_0016，tim3_0016变体(tim3_0018)，tim3_0033和tim3_0038显示与f38-2e2抗体相比相似的释放。与之对比，含有同种型对照抗体的培养物没有显示ifn-γ分泌升高。表21：与作为阳性对照的重组人il-2(20eu/ml)(＝100％)和作为阴性对照的无抗体相比抗tim3抗体诱导的ifnγ释放的百分比(供体实施例24：抗tim-3抗体进入tim-3表达性细胞的内在化本文中描述的tim-3特异性抗体能内在化入tim-3表达性细胞，包括tim-3表达性淋巴瘤，多发性骨髓瘤和aml细胞。例如，已公开的tim-3特异性抗体及其片段显示出内在化入稳定表达人tim-3的重组tim3cho细胞，如通过基于细胞的elisa，流式细胞术(facs)和共焦显微术评估的。使用新鲜培养基将稳定的tim3转染cho-k1细胞(克隆8)(4x104个细胞/孔/100μl)接种入98孔mtp。在细胞贴壁过夜后，去除细胞培养基，将测试抗体添加至细胞(10μg/ml，在细胞培养基中)，并于4℃温育0.5小时。作为参照，使用商业性小鼠抗人抗体(tim3mab11e365，usbiological，t5469-92p)。清洗(2次，用细胞培养基)和离心后，将细胞在200μl细胞培养基中于a)4℃或b)37℃温育3小时。典型地，内在化发生于37℃，但是不发生于4℃，这为反应提供另一项对照。然后，将细胞用100μl/孔1xpbs中的0.05％戊二醛(sigma目录号：g5882)于室温(rt)固定10分钟。这之后是三个200μlpbs-t清洗步骤，并添加二抗绵羊抗小鼠-pod(辣根pod连接的f(ab′)2片段；gena9310))，于室温1小时。最终的清洗步骤(3xpbs-t)后，添加tmb底物(roche定购号11835033001)达15分钟，并使用1nhcl停止显色。通过elisa读数仪中的450/620nm处的测量来测定最终的od。将这种细胞elisa规程用于自杂交瘤上清液纯化的测试抗体的内在化能力的中等通量评估。如下计算内在化的百分比：内在化[％]＝(1-od样品_37℃/od样品_4℃)*100结果显示于图29a和b(内在化)。几乎所有测试的抗tim-3单克隆抗体于37℃温育3小时后相似好地内在化入稳定的tim3转染cho-k1细胞(未显示所有数据)。通过facs对选定的候选物评估ec50内在化值(时间依赖性)的测定以及依赖于单价性对二价性的内在化的动力学的比较。简言之，使用新鲜培养基将人tim3稳定表达性cho-k1细胞接种(4x105个细胞/孔/50μl)入98孔v底mtp，并与nf液一起于室温温育10分钟以封闭非特异性结合。然后添加50μl/孔选定的经过纯化的抗tim3(10μg/ml，在细胞培养基中)，并于4℃温育1小时。清洗(用细胞培养基)和离心后，将细胞在200μl细胞培养基中于a)4℃或b)37℃温育0.25，0.5，1，2，3，4，6和24小时。然后用pbs/1％bsa清洗细胞，并添加二抗alexafluor488山羊抗小鼠igg，f(ab)2，于4℃1小时。清洗和离心后，添加125μl细胞固定液(bdbioscience，1:1000)，并通过bdbiosciencesfacscanto流式细胞仪分析染色的细胞的mfi信号。如下计算内在化的百分比：内在化[％]＝(1-mfi样品_37℃/mfi样品_4℃)*100在rpmi-8226细胞(ccl-155tm)上评估抗tim3抗体tim3_0016，tim3_0016变体(tim3_0018)，tim3_0021，tim3_0028，tim3_0030，tim3_0033，tim3_0038的时间依赖性内在化的实施例：当前公开的抗tim3抗体以高水平快速内在化入tim3表达性rpmi-8226细胞(ccl-155tm)。如上文所述用tim3表达性rpmi-8226细胞(ccl-155tm)代替表达hutim-3的重组chok1细胞进行实验。结果显示于表22。使用下述抗体作为tim3参照抗体：us2012/189617中记载的抗体8213，wo2013/06490中记载的抗体27.12e12。以人igg1嵌合型式使用tim3_0016，tim3_0016变体(tim3_0018)，tim3_0038。表22：指示时间点时的百分比内在化(0分钟设定为0百分比)结果显示，与参照抗体相比，测试抗体在rpmi-8226细胞(ccl-155tm)上以高百分比快速内在化。实施例25：抗tim-3抗体对分离的表达tim-3的人单核细胞的结合使用ficoll-paque(gehealthcare)(见用户手册中的通用方案或拜访www.miltenyibiotec.com/protocols)通过密度梯度离心自健康供体的抗凝外周血分离cd14+单核细胞，随后经由cd14微珠进行正选择。首先用cd14微珠磁标记cd14+细胞。然后将细胞悬浮液加载到放置在macs分离仪的磁场中的柱上。磁标记的cd14+细胞保留在柱中。未标记的细胞运行穿过，此细胞级分消减了cd14+细胞。自磁场取出柱后，可以作为正选择的细胞级分洗脱磁保留的cd14+细胞。于室温以200xg离心10分钟后，收获单核细胞，并在结合测定法中直接使用，或者以1.0e+07个细胞/ml在冷冻培养基(10％dmso，90％fcs)中重悬浮并在液氮中保存。如文献中显示的，单核细胞在它们的表面上组成性表达tim3。在新鲜培养基中将1x105个cd14+分离的人单核细胞(50μl/孔)放入98孔v底mtp，并与nf液一起于室温温育15分钟以封闭非特异性结合。然后添加50μl/孔公开的抗tim3单抗或参照抗tim-3单抗344823(r&d)和f38-2e2(biolegend)(10μg/ml，在细胞培养基中)，并于4℃温育1小时。然后用pbs/1％bsa清洗细胞，并添加二抗pe标记的山羊抗小鼠f(ab′)2(jacksonlab115-006-072)，于4℃1小时。清洗和离心后，通过bdbiosciencesfacscanto流式细胞仪分析染色的细胞的mfi信号。如下计算特异性结合：特异性结合[mfi]＝几何均值mfi样品-几何均值mfi同种型对照结果显示于表8：(对人单核细胞的结合)。tim3克隆tim3_0016，tim3_0018，tim3_0020，tim3_0028和tim3_0038结合不同供体的人单核细胞，甚至好于参照抗tim-3抗体。表23：对人单核细胞的结合实施例26：抗tim-3抗体对分离的表达tim-3的食蟹猴单核细胞的结合使用ficoll-paque(gehealthcare)(见用户手册中的通用方案或拜访www.miltenyibiotec.com/protocols)通过密度梯度离心自食蟹猴抗凝外周血(covance)分离cd14+单核细胞，随后经由nhpcd14微珠进行正选择。首先用cd14微珠磁标记cd14+细胞。然后将细胞悬浮液加载到放置在macs分离仪的磁场中的柱上。磁标记的cd14+细胞保留在柱中。未标记的细胞运行穿过，此细胞级分消减了cd14+细胞。自磁场取出柱后，可以作为正选择的细胞级分洗脱磁保留的cd14+细胞。于室温以200xg离心10分钟后，收获单核细胞，并在结合测定法中直接使用，或者以1.0e+07个细胞/ml在冷冻培养基(10％dmso，90％fcs)中重悬浮并在液氮中保存。如文献中显示的，单核细胞在它们的表面上组成性表达tim3。在新鲜培养基中将1x105个cd14+分离的食蟹猴单核细胞(50μl/孔)放入98孔v底mtp，并与nf液一起于室温温育15分钟以封闭非特异性结合。然后添加50μl/孔alexa488标记的抗tim3(10μg/ml，在细胞培养基中)，并于4℃温育1小时。清洗和离心后，通过bdbiosciencesfacscanto流式细胞仪分析染色的细胞的mfi信号。如下计算特异性结合：特异性结合[mfi]＝几何均值mfi样品-几何均值mfi同种型对照结果显示于表9(对食蟹猴单核细胞的结合)。tim3克隆tim3_0016，tim3_0018，tim3_0026，tim3_0028，和tim3_0030结合不同食蟹猴供体的食蟹猴单核细胞。表24：对食蟹猴单核细胞的结合实施例27：抗tim-3抗体对表达tim-3的nhl和mm细胞系的结合通过facs分析公开的抗tim3抗体和两种抗tim3参照抗体克隆(1)4177和(2)8213(kyowa)的结合能力。简言之，将人tim3表达性b细胞淋巴瘤细胞(以pfeiffer细胞例示)和多发性骨髓瘤细胞(以rpmi-8226细胞例示)与bd人fc封闭液一起于室温温育10分钟以封闭非特异性结合。然后将2x105个细胞(50μl/孔)放置入98孔v底mtp，添加50μl/孔alexa488标记的抗tim3(10μg/ml，在bd染色缓冲液中)，并于4℃温育1小时。清洗和离心后，通过bdbiosciencesfacscanto流式细胞仪分析染色的细胞的mfi信号。如下计算特异性结合：特异性结合[mfi]＝几何均值mfi样品-几何均值mfi同种型对照结果显示于图2a和2b(对rpmi-8226和pfeiffer细胞的结合)。实施例10：抗tim-3抗体对tim-3表达性nhl和mm细胞的细胞毒性活性缀合有假单胞菌外毒素(pe24)的tim3特异性抗体有效杀伤tim3表达性细胞。用promegacelltiter-glo发光细胞存活力测定法分析公开的抗tim3抗体和一种可商购抗tim3参照抗体克隆11e365(可得自usbiological)的细胞毒性活性。简言之，对5x103个(50μl/孔，在98孔mtp中，一式三份)稳定表达人tim-3的重组chok1或2x104个细胞(50μl/孔，在98孔mtp中，一式三份)人tim3表达性b细胞淋巴瘤细胞(以pfeiffer细胞例示)或多发性骨髓瘤细胞(以rpmi-8226细胞例示)添加25μl/孔公开的抗tim-3抗体的1:5连续稀释液，最高浓度10μg/ml，或者将适宜培养基添加至未处理细胞或将同种型对照添加至非靶向处理细胞。处理的范围为10μg/ml至1ng/ml，一式三份。以全长小鼠fcγ型式使用所有抗体。为了缀合假单胞菌外毒素，添加10μg/ml缀合有pe24的小鼠fcγ片段特异性fab，并于37℃温育3天。作为真核细胞中的一种已知的蛋白质合成抑制剂，使用环己酰亚胺作为阳性对照。用promegacelltiter-glo发光细胞存活力测定法测量经过处理的细胞的存活力。如下计算细胞毒性活性：相对抑制[％]＝(1-(e样品-e阴性对照)/(e阳性对照-e阴性对照))*100结果显示于表25(抗tim3单抗对tim-3表达性重组nhl和mm细胞系的细胞毒性活性，三明治格式)。表25：所有测试的tim3克隆对稳定表达人tim-3的重组chok1和表达高和中等水平tim-3的pfeiffer细胞高度有力(ic50范围0.01-0.2nm)，而且在它们的细胞毒性活性方面甚至比强内在化参照抗tim-3抗体克隆11e365，usbiological更加有力。tim3克隆0016，0018，0021，0022，0033和0038对rpmi-8226细胞(表达与重组chotim-3细胞相比低5倍的tim-3水平)也是有力的。实施例28：公开的抗tim3抗体与两种抗tim3参照抗体1.7.e10和27-12e12(如wo2013/06490中记载的)的细胞毒性活性的比较。如上文所述用promegacelltiter-glo发光细胞存活力测定法分析公开的抗tim3抗体和两种抗tim3参照抗体(wo2013/06490中记载的tim3参照抗体1.7e10和27.12e12)的细胞毒性活性。以包括人fcγ部分的全长人igg1格式使用所有抗体。在这项实验中，假单胞菌外毒素的缀合经由缀合有pe24的人fcγ片段特异性fab(10μg/ml)来实现，添加并于37℃温育5天。结果显示于表26。表26：抗tim3单抗对tim-3表达性nhl和mm细胞系的细胞毒性活性的比较所有公开的tim3克隆对表达tim-3的pfeiffer和rpmi-8226细胞是高度有活性的(ic50范围0,02-0,08nm)，而且在它们的细胞毒性活性方面甚至比强内在化参照抗tim-3抗体克隆27-12e12更加有力。在相同条件下使用相同假单胞菌外毒素作为假单胞菌外毒素(pe24)缀合物比较所有抗体。实施例28：公开的抗tim3抗体的fab-pe24构建物对mm，nhl和aml细胞系(表达tim3，但不表达psma)的细胞毒性活性。如上文所述用promegacelltiter-glo发光细胞存活力测定法分析细胞毒性活性。将直接缀合至pe24的公开的抗tim3抗体的fab片段的1:5连续稀释液(最高浓度50μg/ml)或适宜培养基(对未处理细胞)或非结合性抗psmafab-pe24对照(对非靶向处理细胞)与7.5x103个pfeiffer细胞或2x103个rpmi-8226细胞(50μl/孔，在98孔mtp中)一起于37℃温育4天。处理的范围为50μg/ml至8ng/ml，一式三份。使用环己酰亚胺作为阳性对照。结果显示于表27。表27：公开的抗tim3抗体的fab-pe24构建物对mm，nhl和aml细胞系的细胞毒性活性所有测试的公开的抗tim3抗体的fab-pe24构建物对表达中等水平tim-3的mm(rpmi-8226)和nhl(karpas-299)细胞是高度有力的(ic50范围1-10nm)，而且对表达很低水平tim-3的aml细胞系(cmk，tf-1，molm-13)展现显著的细胞毒性活性。实施例29：公开的抗tim3的免疫缀合物(假单胞菌外毒素a缀合物)(fab-pe24构建物)对来自复发性/顽固性患者的原代白血病干/祖aml细胞的细胞毒性活性来自复发性/顽固性患者外周血的cd34+细胞是自allcell，llc，alameda，ca获得的。确认所有样品的纯度和存活力(纯度范围84-94％和存活力范围95-99％)后，如实施例7中所述使用抗tim-3单抗344823(r&d)通过facs评估tim-3表达水平(见图31)。所有测试的(4/4)来自复发性/顽固性患者的原代白血病干/祖(cd34+)aml样品以不同水平展现均质tim-3表达。为了评估公开的抗tim3克隆0016和0022的fab-pe24构建物对原代cd34+aml细胞的细胞毒性活性，将1x104个细胞(50μl/孔，在98孔mtp中，一式三份)与fab片段的1:5连续稀释液(最高浓度50μg/ml)或适宜培养基(对未处理细胞)或非结合性抗psmafab-pe24对照(对非靶向处理细胞)一起于37℃温育3天。使用环己酰亚胺作为阳性对照。如上文实施例28中所述用promegacelltiter-glo发光细胞存活力测定法分析细胞毒性活性。结果显示于表28(公开的抗tim3抗体的fab-pe24构建物对原代cd34+aml细胞的细胞毒性活性)。表28：公开的抗tim3抗体的fab-pe24构建物对原代cd34+aml细胞的细胞毒性活性抗tim3抗体tim3_0016和tim3_0022的fab-pe24构建物对(2/4)原代aml样品(pb0142和pb0135)是高度有力的(ic50范围30-116nm)，而且对所有(4/4)表达不同水平tim-3的原代白血病干/祖(cd34+)aml细胞展现显著的细胞毒性活性。实施例30：选定的抗tim3抗体的fab-pe24构建物对nhl和mm细胞系的效力的比较如上文实施例28中描述的用promegacelltiter-glo发光细胞存活力测定法分析选定的公开的抗tim3抗体的分选酶偶联的fab-pe24构建物的细胞毒性活性的评估。结果显示于表29。表29：选定的抗tim3抗体fab-pe24构建物对nhl和mm细胞的细胞毒性活性所有选定的公开的抗tim3抗体的fab-pe24构建物对表达中等水平tim-3的nhl(pfeiffer)和mm(rpmi-8226)细胞展现高细胞毒性效力(ic50范围0.3-5nm)。对公开的抗tim3抗体tim3_0016和tim3_0038的fab-pe24构建物观察到最高细胞毒性活性。实施例31：公开的抗tim-3抗体的相同克隆的fab-pe24构建物与整个igg-鹅膏蕈毒素缀合物对pfeiffer细胞的细胞毒性活性的比较如上文实施例12中描述的用promegacelltiter-glo发光细胞存活力测定法分析公开的抗tim3克隆0016的缀合的fab-pe24构建物与缀合有鹅膏蕈毒素的相同克隆的整个igg(依照wo2012/041504中记载的规程，经由鹅膏蕈毒素氨基酸4的6′c原子缀合，特别是经由结合至鹅膏蕈毒素氨基酸6′c原子的氧原子，且其中该tim3抗体是经由脲模块通过接头连接的)的细胞毒性活性的评估。结果显示于表30。表30：抗tim3克隆0016的fab-pe24构建物与整个igg-鹅膏蕈毒素缀合物对nhl细胞的细胞毒性活性鹅膏蕈碱缀合的抗tim-3克隆0016(ic500.8nm)对表达中等水平tim-3的nhl(pfeiffer)细胞的细胞毒性活性与相同克隆的fab-pe24构建物的细胞毒性活性(ic500.3nm)相当。实施例32患者和肿瘤样品加工自34名具有非小细胞肺癌的患者，7名具有卵巢癌的患者和1名具有肾细胞癌(rcc)的患者收集新鲜切除的实体瘤损害和恶性渗出液。机械剥离实体瘤损害并在切除后直接使用accutase(paa)，胶原酶iv(worthington)，透明质酸酶(sigma)，和iv型dna酶(sigma)消化。制备单细胞悬浮液。使用histopaque-1119(sigma)通过密度梯度离心分离恶性渗出液的细胞级分。所有样品保存于液氮中直至进一步使用。研究得到了当地伦理审查委员会(ethikkommissionnordwestschweiz)的批准。实施例33肿瘤样品表征通过多色流式细胞术全面表征所有肿瘤样品。使用下述抗体进行流式细胞术分析：α-cd4-pe，α-cd8-pe-cy7，α-cd11b-percp-efluor710，α-cd45-pe-cy7，α-cd45-percp-cy5.5，α-cd137-fitc，α-btla-生物素，α-ctla-4-pe，α-icos-fitc，α-ifn-γ-fitc，α-lag-3-apc(均ebioscience)，α-cd3-pecf594，α-cd25-bv605，α-cd69-fitc，α-epcam-fitc，α-粒酶b-pe，α-活性胱天蛋白酶3-pe，α-pd-1-bv605，链霉亲合素-bv711(均bdbioscience)，α-cd45ra-bv421，α-ccr7-alexafluor647，α-foxp3-alexafluor647，α-tim-3-bv421，α-tim-3-bv605(均biolegend)。用可固定近ir死细胞染色试剂盒或可固定蓝色死细胞染色试剂盒(invitrogen)对死细胞染色。对于细胞内染色，使用来自ebioscience的固定和透化缓冲液。在bdlsrfortessa上获取样品进行流式细胞术分析。人il-2，ifn-γ和tnfelisa套组均得自bdbioscience。对cd8+和cd4+t细胞(cd45+cd3+)表征表面标志物pd-1，tim-3，ctla-4，lag-3，btla，cd25，cd69，cd137，icos，cd45ra和ccr7的表达。对肿瘤细胞(cd45-epcam+)表征folr1的表达，与它的匹配同种型对照比较folr1特异性抗体的结合。只有对folr1表达呈阳性的样品用于folr1-tcb的处理，而且只有表达epcam的样品用于catumaxomab的处理。实施例34folr1-tcb对肿瘤样品的离体处理将folr1阳性肿瘤消化物或恶性渗出液融化，清洗，并在完全培养基(dmem+丙酮酸钠(1mm)+mem非必需aa(1x)+l-glutamin(2mm)+青霉素/链霉素(100ng/ml)+2-巯基乙醇(50nm)+ciproxin(1mg/ml)+10％人血清)中以3x105个细胞/200μl/孔的密度分配入96孔平底细胞培养板(bdfalcon)。样品在浓度为2nm的folr1-tcb或dp47tcb存在或缺失下培养24小时。通过测量细胞表面标志物cd25，cd69，cd137，icos，pd-1和tim-3的表达，通过多色流式细胞术测定folr1-tcb处理后cd8+和cd4+t细胞(cd45+cd3+)的活化。另外，通过细胞内染色测定粒酶b和ifn-γ的表达。通过elisa(人il-2elisa套组，bdopteia)遵循制造商的用法说明书测量细胞培养物上清液中il-2的浓度。实施例35卡妥索单抗(catumaxomab)对肿瘤样品的离体处理三功能tcb卡妥索单抗得自fresenius。实验条件与上文关于folr1-tcb指出的相似。简言之，epcam阳性肿瘤消化物或恶性渗出液在浓度为10ng/ml的卡妥索单抗存在或缺失下培养24小时。如上文描述的那样实施对cd8+和cd4+阳性t细胞(cd45+cd3+)的分析。实施例36杀伤测定法为了测定folr1-tcb诱导的肿瘤细胞杀伤，3x104个cfse标记的skov3细胞与肿瘤样品一起在浓度为2nm的folr1-tcb存在或缺失下在96孔平底细胞培养板中共培养24小时。在每个孔中将e:t比(e：效应cd45+cd3+细胞；t：来自肿瘤的靶folr1+细胞和添加的skov3细胞)调整至1:1，并依照之前通过流式细胞术进行的表征为每份样品计算添加的肿瘤样品的细胞数。通过测量活化的胱天蛋白酶3和活/死标志物live/dead-近ir，通过流式细胞术测定skov3细胞的细胞死亡。一式三份实施测定法。依照下述方程计算folr1-tcb介导的杀伤：％特异性杀伤＝100–[(folr1-tcb处理样品中skov3活细胞的％/未处理样品中skov3活细胞的％)x100]。为了在肿瘤样品之间比较folr1-tcb诱导的t细胞杀伤能力及排除别的遏制t细胞功能性的因素，诸如肿瘤细胞上pd-l1的表达，我们对肿瘤消化物外源添加cfse标记的folr1+skov3细胞，并将e:t比调整至1:1，本质上如上文描述的。然后我们测量folr1-tcb诱导的cfse标记的skov3细胞杀伤，这还容许我们在分析中包括folr1-肿瘤样品。由于一些来自初始分组的肿瘤不能用于表征tcb介导的肿瘤细胞杀伤(由于效应细胞的量很低)，因此分析一个分开的分组，来自15名非小细胞肺癌(nsclc)和2名上皮卵巢癌(eoc)患者的12份肿瘤消化物和5份恶性渗出液。对所有样品表征它们的cd3+效应细胞和folr1+靶细胞含量(图39)。比较来自患者的cd3+t细胞的肿瘤细胞杀伤与来自健康供体的pbmc衍生的t细胞。24小时之后观察到患者个体之间肿瘤细胞杀伤的实质性异质性(26±11.8％)(图12o)。注意，来自健康供体的cd3+t细胞诱导比til显著更好的杀伤(42.8±9.7％，p＝0.013)。对不结合肿瘤抗原的对照tcb(dp47-tcb)的暴露没有诱导任何肿瘤细胞杀伤。实施例37抗cd3/cd28抗体的多克隆刺激将96孔平底板用0.5ug/ml抗cd3ε(克隆okt3，biolegend)于37℃预包被2小时。之后，去除抗体溶液，并充分清洗板。将冷冻的肿瘤悬浮液融化，清洗，并以3x105个细胞/200μl/孔在含2μg/ml抗cd28抗体(克隆28.2，ebioscience)的完全培养基中培养24小时。温育24小时之后，收集细胞，清洗，并通过流式细胞术分析cd8+t细胞上活化标志物(例如cd25)的表达和t细胞效应器功能(例如粒酶b和ifn-γ)。收集上清液进行il-2，ifn-γ和tnf-αelisa，依照制造商的用法说明书实施。实施例38通过pd-1阻断恢复t细胞功能如上文描述的那样在每孔10μg/ml抗pd-1抗体(mdx5c4)存在或缺失下通过激动性抗cd3和抗cd28抗体刺激肿瘤消化物，并温育24小时。24小时后，收集细胞，清洗，并通过流式细胞术分析。收集上清液进行il-2，ifn-γ和tnf-αelisa，依照制造商的用法说明书实施。实施例39肿瘤消化物和恶性渗出液中folr1tcb对t细胞的活化啮合cd3和叶酸受体1的t细胞双特异性抗体(基于mov19的folr1-tcb)和对照抗体dp47-tcb由rocheglycart提供。抗pd-1抗体5c4是美国专利no.8,008,449中描述的。使用抗tim3抗体f38-2el。对于folr1表达的流式细胞术表征，使用来自lifespanbiosciences的抗体抗folr1-apc(aa25-233)和它的匹配同种型对照(biolegend)。对来自15名具有folr1+肿瘤的患者的肿瘤损害表征由folr1tcb诱导的t细胞活化。样品由衍生自具有nsclc(n＝7)，卵巢癌(n＝7)，和肾细胞癌(n＝1)的患者的9份单细胞悬浮液和6份恶性渗出液组成。cd3+t细胞和folr1+肿瘤细胞的量在患者之间高度可变(cd3+：均值33.9％±标准偏差16.6％，folr1+：17.1％±16.8％)。t细胞上抑制性受体pd-1，tim-3，ctla-4，lag-和btla表达的表征揭示了患者间极大的异质性(图11a-b)。虽然肿瘤浸润性cd8+t细胞显示高水平的pd-1，tim-3和ctla-4(分别为31.6％±25％；22.2％±20.8％和18.7％±14.4％)，但是lag-3和btla只在这个分组的所有患者中的少数细胞上表达(分别为3.5％±4.9％和2.3％±1.7％)。cd4+t细胞上的抑制性受体的分布相似，ctla-4有略微更加突出的表达。为了测定folr1-tcb诱导的t细胞活化，在folr1-tcb或对照tcbdp-47存在或缺失下培养肿瘤样品。然后，通过多色流式细胞术对t细胞表征活化标志物的表达和t细胞效应器功能，如上文描述的。图12a-o揭示了患者之间folr1-tcb诱导的t细胞活化中极大的异质性。特别是，虽然绝大多数患者在基线时就表达cd69，但是分别观察到9-80％，2.5-50％和3.5-71％变化的cd25，cd137，和icos上调。观察到效应器功能(诸如ifn-γ分泌，cd107脱粒和粒酶b表达)的获得，范围分别为3.7-59％，倍数变化1-7或1.3-64(图12a-i)。作为folr1-tcb处理后活化的一项标志物，抑制性受体pd-1和tim-3进一步上调，不管它们的基线表达。对tcbdp-47的暴露没有诱导任何t细胞活化。由folr1-tcb刺激诱导的cd25和icos上调在来自健康供体的外周cd8+t细胞中比肿瘤衍生的cd8+细胞显著更强(分别为p＝0.002和p<0.001；图12j，图12l，图12m)。folr1-tcb刺激后t细胞效应器细胞因子ifn-γ，il-2，和tnf的分泌在大多数肿瘤中的til中与来自健康供体的pbmc相比大大降低(分别为p＝0.0047，p<0.001，和p＝0.006；图12n)。folr1-tcb诱导的穿孔素分泌在til中是高度可变的，而且在一个患者子集中严重受损(图12n)。类似地，尽管有更低的粒酶b上调，folr1-tcb诱导cd4+t细胞的活化和效应器功能获取(图25a-i)。为了评估肿瘤内t细胞或folr1表达的丰度是否影响tcb暴露后的t细胞活化，将活化标志物的上调与e:t比(e：效应cd45+cd3+t细胞；t：folr1+细胞)和folr1+细胞的百分比和肿瘤抗原表达水平关联起来(图13a-c)。后者是使用流式细胞术通过肿瘤细胞(cd45-epcam+)上folr1的均值荧光强度测定的(图13c)。然而，这些参数无一影响t细胞活化，就是说即使小量的folr1+细胞，高e:t比，或差的t细胞浸润也足以实现活化和功能性标志物的有效上调。另外，潜在免疫遏制性细胞群体(诸如调节性t细胞或未成熟髓样细胞)的存在不影响t细胞活化或t细胞功能。实施例40folr1-tcb诱导的t细胞活化与pd-1和tim-3的表达逆相关抑制性受体的高表达已经描述为t细胞耗竭的一项标志。因此，肿瘤浸润性t细胞的功能障碍性状态可能影响folr1tcb的功效，而且可能对tcb暴露后的异质t细胞活化负有责任(至少部分)。为此，将抑制性受体的共表达(如在基线时测定的)与folr1tcb诱导的t细胞效应器功能和活化标志物上调关联起来。cd8+t细胞上的pd-1和tim-3表达均由此与通过cd25，cd137和icos的表达测定的t细胞活化负相关。具有高pd-1或tim-3表达的cd8+t细胞在folr1-tcb处理后显示边缘效应，而具有这些抑制性受体的低表达的t细胞能在folr1-tcb处理后强活化(图14a-i)。folr1-tcb诱导的il-2分泌针对样品中t细胞的含量标准化的测量揭示对pd-1和tim-3表达的相同依赖性(图15a-c)，而folr1-tcb诱导的粒酶b上调对这些抑制性受体的在先表达的依赖性较小(图14j-l)。有趣的是，cd8+t细胞上ctla-4，lag-3和btla的基线表达与folr1-tcb诱导的t细胞活化没有关联(图26a-c)。与cd8+t细胞上相同受体的表达相比，cd4+t细胞上抑制性受体的表达关于folr1-tcb诱导的cd4+t细胞活化的预测性低得多。实施例41folr1-tcb诱导的肿瘤细胞杀伤与pd-1和tim-3的表达逆相关为了在经过调整的e:t比1:1调查folr1-tcb诱导的肿瘤细胞杀伤，将cfse标记的skov3细胞外源添加至肿瘤消化物，该肿瘤消化物含有先前使用多色流式细胞术测定量的cd3+t细胞。通过测量活化的胱天蛋白酶3和活/死标志物测定folr1-tcb诱导的skov3细胞杀伤。与通过cd25上调测量的folr1-tcb诱导的t细胞活化一致，folr1-tcb暴露后的特异性杀伤与cd8+t细胞上pd-1和tim-3的单一或共表达负相关。而且，folr1-tcb诱导的杀伤还受到ctla-4的基线表达和pd-1和ctla-4的共表达影响。然而，与pd-1和tim-3表达相比，ctla-4表达对folr1-tcb诱导的肿瘤细胞杀伤的影响不太突出。实施例42用catumaxomab处理新鲜肿瘤损害-使用catumaxomab对肿瘤浸润性t细胞的活化及与抑制性受体的表达的关联为了测定catumaxomab诱导t细胞活化的程度及使用第二种，独立的t细胞双特异性分子确认上文描述的发现，将4份来自具有nsclc的患者的肿瘤消化物暴露于catumaxomab，一种识别t细胞上的cd3和肿瘤细胞上的epcam的三功能性双特异性抗体。然后，通过流式细胞术对t细胞表征活化标志物的表达和t细胞效应器功能(图17a-d)。验证上文我们关于folr1-tcb的数据，我们观察到catumaxomab诱导的t细胞活化中惊人的异质性。因而，抑制性受体的基线表达在患者之间有差异(图17e-h)。对catumaxomab处理后t细胞活化和效应器功能的分析揭示了依照cd8+t细胞上的pd-1和/或tim-3表达的两组患者，确认我们用folr1-tcb得到的发现(图18a-r)。pd-1低，tim-3低，和甚至更加突出的pd-1低/tim-3低二者表达性细胞未能被catumaxomab活化，而pd-1高，tim-3高，和pd-1高/tim-3高t细胞实质性上调cd25，cd69，cd137，icos，粒酶b和ifn-γ。实施例43cd3/cd28对肿瘤浸润性t细胞的多克隆刺激-非小细胞肺癌样品中肿瘤浸润性t细胞子集的免疫表型测定我们使用多色流式细胞术调查了来自34名nsclc患者的肿瘤浸润性cd3+cd8+和cd3+cd4+t细胞子集上共抑制性t细胞受体和分化标志物的表达。大多数肿瘤显示抑制性受体pd-1(t细胞耗竭的一种主要调节物)的高表达(图19a-b)。值得注意的是，其它检查点抑制剂诸如tim-3，ctla-4，lag-3或btla的表达显示自不同肿瘤获得的t细胞之间的实质性变异(图19a-b)。实施例44抑制性受体的累积表达定义t细胞功能障碍在这个实施例中，以亚最佳剂量使用多克隆刺激来评估抑制性受体对t细胞功能的影响。激动性抗cd3和抗cd28抗体刺激对t细胞活化(如通过cd25表达例示的)和t细胞效应器功能(如通过ifn-γ，tnf-α和il-2生成以及粒酶b表达分析的)的影响在患者之间实质性变化，如通过流式细胞术(图20a-b)和elisa(图20c-e)测定的。值得注意的是，我们观察到不同水平的t细胞功能，自展现大量保留t细胞功能(即持久的cd25和粒酶b表达，以及il-2，ifn-γ和tnf-α生成)的t细胞群体至t细胞功能消除(丧失cd25和粒酶b表达和细胞因子生成)的那些变化。为了分析多种抑制性受体对t细胞功能性的影响，我们将抑制性受体(ir)得分定义为t细胞上抑制性受体的累积表达的标志物。为此，分析所有nsclc样品中pd-1，tim-3，ctla-4，lag-3和btla的表达的百分比，并基于每种所表达的受体的中值和四分位间范围定义得分并为每份样品计算(例如图21f)。表达指示多种抑制性受体表达的高ir得分的肿瘤浸润性cd8+t细胞在多克隆刺激后显示边缘效应，与它们的高度功能障碍性状态有关，而具有低ir得分的t细胞能在多克隆刺激后强活化(图21a-e)。由il-2，ifn-γ和tnf-α生成指示的t细胞效应器功能上调不仅与抑制性受体的累积表达有关，而且相似地与pd-1和tim-3表达以及与这两种受体的共表达有关(图22a-i)，指示pd-1和tim-3对t细胞功能障碍的重大贡献。实施例45抑制性受体表达抑制性受体的单一和累积表达随肿瘤进展而升高。抑制性受体的表达与肿瘤阶段和肿瘤进展有关。pd-1，tim-3和lag-3阳性细胞的数目在高级肿瘤阶段明显升高(图21g-k)。对ctla-4的表达没有观察到明显的关联，这可能指示这种受体经由一种不同的抑制机制起作用。btla一般以低水平表达，而且仅仅在高级肿瘤阶段找到小升高(图21k)。在具有节结阳性癌症和高级肿瘤阶段的患者中观察到通过ir得分反映的抑制性受体的累积表达显著升高，而原发性肿瘤尺寸与ir得分没有显著关联(图21l-m)。这些数据提示肿瘤进展期间抑制性受体的逐渐且连续上调，它们最有可能牵涉nsclc中的t细胞耗竭。抑制性受体在肿瘤浸润性t细胞上逐渐表达。为了探索单一t细胞上不同抑制性受体的同时表达的作用，相对于五种所分析的受体任一的表达，分析cd8+t细胞中这些受体的伴随表达(图32，33)。表达作为热图显示，展示患者个体的表达的百分比(图32)，或者作为雷达图显示，作为针对第五种指定免疫检查点预设门的cd8+t细胞上四种相应受体的均值和标准偏差显示表达(图33)。cd8+pd-1+t细胞平均而言表达最低百分比的其它抑制性受体，而cd8+btla+t细胞以高水平表达所有四种其它抑制性受体，指示btla标志着一种特别耗竭的t细胞子集(图32，33)。自cd8+tim-3+t细胞胜过cd8+ctla-4+t细胞至cd8+lag-3+t细胞观察到共表达的抑制性受体的数目的增加(图32，33)。这些发现提示用pd-1逐渐获取抑制性受体是广泛表达的早期标志物，而btla在t细胞耗竭期间相当晚期上调。实施例46阻断pd-1能部分恢复t细胞功能由pd-1阻断性抗体挽救t细胞功能取决于pd-1表达的水平。因为我们发现多克隆刺激之后抑制性受体(特别是pd-1和tim-3)的表达和t细胞活化之间清楚的关联，所以阻断pd-1或pd-1/tim-3途径可能恢复t细胞功能。然而，在用激动性抗cd3和抗cd28抗体刺激后添加针对pd-1的阻断性抗体(5c4)或组合阻断pd-1和tim-3仅仅在一些患者中能恢复t细胞效应器功能诸如il-2，ifn-γ和tnf-α的生成和分泌，而在其他患者中仅仅看到边缘效应(图23a-d)。正如在慢性鼠lcmv感染模型中观察到的(blackburnetal.,pnas105(39):15016(2008))，我们在来自nsclc患者的肿瘤浸润性cd8+t细胞中鉴定出pd-1高和pd-1中子集。简言之，pd-1高，pd-1中，和pd-1阴性子集能基于它们的测量荧光强度来鉴定。对来自33名患者的细胞分析pd-1表达以定义用于这三种子集的可再现区分的统一参数。该分析涵盖整个pd-1表达水平谱，而且包括具有清楚区分的pd-1阴性或pd-1高群体的肿瘤样品。这容许为这项分析设置门，然后应用于所有样品。仅仅pd-1中表达性t细胞子集看来在pd-1或组合pd-1/tim-3阻断后得到活化的挽救，而在pd-1高细胞中在阻断后没有观察到对t细胞活化的影响(图24)。后者可能展现更加耗竭的表型，它看来对单独的pd-1阻断有抗性。这一发现在由folr1tcb活化的t细胞中得到确认。如上文描述的那样用folr1刺激t细胞。阻断pd-1进一步增强来自一个患者子集的t细胞的folr1-tcb诱导的t细胞活化。folr1-tcb诱导的ifn-γ，tnf和il-2分泌针对样品中t细胞的含量标准化的测量揭示具有实质量的pd-1高表达性(大约>15％)细胞的患者细胞群体没有能力分泌这些细胞因子。相反，在大多数具有更低量的pd-1高表达性(大约<15％)细胞的患者细胞群体中能诱导细胞因子分泌(图27a-c)。在后一组中，在folr1-tcb刺激的刺激后添加针对pd-1的阻断性抗体或组合阻断pd-1和tim-3提高il-2，ifn-γ和tnf-α的生成(图28a-f)。因此pd-1高表达性子集可展现更加耗竭的表型，它看来对单独的pd-1阻断是有抗性的。如此，t细胞效应器功能诸如il-2，ifn-γ和tnf-α的生成在来自一些nsclc患者的til中能恢复，而在其他患者中仅仅能实现t细胞功能的边缘性恢复。将与pd-1阻断性抗体组合暴露于抗cd3/cd28刺激后细胞因子生成的升高与来自每名患者的pd-1阳性群体的pd-1高cd8+t细胞的百分比比较。pd-1阻断后细胞因子表达的升高与pd-1高t细胞的百分比逆相关，指示表达大数目的pd-1高t细胞的患者对单独的pd-1阻断响应较差(图24a-c)。因为t细胞功能障碍与多种抑制性受体的表达(即具有高ir得分的患者)有关，而且对pd-1定向疗法的响应与cd8+t细胞上pd-1的表达水平有关，所以我们进一步分析pd-1高和pd-1中cd8+t细胞中tim-3，ctla-4，lag-3和btla的表达。引人注目的是，pd-1高t细胞表达与pd-1中子集相比显著更高水平的另外的受体(图34)。如此，pd-1高和pd-1中可鉴定两种独特t细胞群体，其中pd-1高t细胞可展现更加耗竭的表型，它不能通过单独的pd-1阻断来恢复。本文中呈现的数据第一次提供来自nsclc患者的肿瘤浸润性cd8+t细胞的全面表型和功能分析。数据显示这些细胞主要拥有效应记忆表型(ccr7-cd45ra低)，而且显示抑制性受体诸如pd-1，tim-3，ctla-4，lag-3和btla表达的较大异质性。无论如何，观察到来自晚期阶段肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(til)上表达的受体的数目的清楚增加，这反映了肿瘤形成期间t细胞功能障碍的进展。本文中呈现的数据显示til的效应器功能在绝大多数患者中是受损的，而且损害与抑制性受体的表达有关。为了在临床相关设置中恢复t细胞功能，我们组合了多克隆t细胞刺激与抗体介导的对pd-1的抑制。pd-1阻断对t细胞功能性的影响在来自不同患者的til之间变化，但是能通过评估以高水平表达pd-1的cd8+t细胞的百分比来预测。这里，我们能证明til的功能性能与抑制性受体的数目和表达水平关联起来且受到大大影响。值得注意的是，甚至表达低水平的抑制性受体的t细胞显示一些程度的受损的功能性，因为绝大多数患者中il-2的分泌是受损的。总体上，cd8+t细胞的活化和效应器功能与抑制性受体的累积表达逆相关，指示nsclc中不同抑制性途径对t细胞功能障碍的直接贡献。我们对肿瘤浸润性cd8+t细胞上的五种抑制性受体的分析显示来自呈现肿瘤阳性淋巴结和高级肿瘤阶段的nsclc患者的肿瘤组织中这些抑制性受体的单一和累积表达的清楚升高。ctla-4的表达不同于其它四种受体(在早期阶段具有最高百分比的阳性细胞)，这可能指示ctla-4在调节t细胞免疫中的独特作用(topalianetal.,safety,activity,andimmunecorrelatesofanti-pd-1antibodyincancer.n.engl.j.med.366，2443(jun28,2012))。单一细胞上另外的抑制性受体的共表达分析相对于一种给定受体的表达显示逐渐表达，分别具有pd-1和btla的早期和晚期上调。这可能反映t细胞耗竭的动态过程。本文中呈现的发现强调了nsclc肿瘤进展期间的抑制性受体表达的临床相关性，它与对肿瘤生长的免疫控制的逐渐失败有关。我们在这里记录了cd8+肿瘤浸润性t细胞的两种群体，其特征在于不同水平的pd-1表达(pd-1高和pd-1中子集)。pd-1高t细胞的发生与pd-1表达的百分比没有关联。有趣的是，我们观察到pd-1阻断的效果与pd-1表达的水平有关，对具有高比例的pd-1高亚群的til的响应性的影响最小。这些发现与鼠慢性lcmv感染模型中的实验一致，其中pd-1中dbgp33-特异性cd8+t细胞子集能在pd-1阻断后得到恢复。相反，pd-1高子集看来更加“耗竭”，即展现功能性耗竭的迹象，而且对pd-1阻断的响应较差。如此，pd-1表达的水平可能代表定义人癌症中的独特t细胞子集的一种新颖标志物，而且可充当对pd-1阻断性抗体治疗的响应的预报器。实施例47folr1-tcb对来自健康供体和癌症患者的t细胞的活化为了评估folr1-tcb对t细胞活化的影响，将来自健康供体的外周血单个核细胞(pbmc)与folr1+卵巢癌细胞系skov3共培养(图40a)。暴露于范围为0.6pm至2nm的渐增浓度的folr1-tcb达24小时后，我们观察到cd8+t细胞的强活化及cd25，cd137，和icos的上调。另外，t细胞分泌il-2，ifn-γ，和tnf。暴露于dp47-tcb(一种针对无关抗原的tcb)没有诱导任何t细胞活化(图40b和c)。实施例48肿瘤浸润性cd8+t细胞中的抑制性受体表达是高度多样的因为肿瘤驻留性t细胞频繁展示高度功能障碍性表现，在folr1-tcb刺激后在不同患者间观察到的t细胞活化的异质性可能是由于受损的til功能性。慢性病毒感染和肿瘤二者中功能障碍性t细胞的一项标志是抑制性受体的过表达。为此，我们测定了所有肿瘤样品中肿瘤浸润性cd8+t细胞上免疫检查点pd-1，tim-3，ctla-4，lag-3，和btla的表达。我们观察到不同肿瘤间这些受体的频率和组合表达的高多样性；发现pd-1是最突出的抑制性受体，具有最高百分比的表达的(60.2±30％)，接着是tim-3(29.5±24.4％)，ctla-4(24.6±17.6％)，lag-3(7.0±5.9％)，和btla(3.9±2.6％)(图35f)。如先前在鼠慢性病毒感染模型中描述的(blackburnetal.,procnatlacadsciusa2008；105(39):15016-21)及如本文在人肿瘤中显示的，pd-1+群体可以分成pd-1高和pd-1中表达亚群(图35a)。对这些特定子集上表达的另外的抑制性受体的分析显示pd-1高亚群中所有其它抑制性受体(包括tim-3，ctla-4，lag-3，和btla)的表达与pd-1中和pd-1阴性子集中这些受体的表达相比显著更高(图36a-d)。因此，我们使用cd8+子集中pd-1高t细胞的百分比作为抑制性受体的累积表达的替代标志物。肿瘤样品依照pd-1高细胞的频率分成分别具有高(pd-1高丰富的肿瘤)和低(pd-1高贫乏的肿瘤)频率的pd-1高表达性t细胞的两组。选择30％pd-1高表达的截留值来分开这两组。pd-1高细胞的百分比的范围，pd-1高丰富的组中为39.1-60.5％(49.5±7.9％)，pd-1高贫乏的组中为2.65-19.5％(8.4±5.7％；图36e)。在具有相似pd-1高细胞频率分布的14名nsclc和2名卵巢癌患者的第二分组中验证了截留值，其中我们在抗cd3/抗cd28抗体的多克隆刺激后观察到相当的结果(图39)。实施例49folr1-tcb诱导的t细胞活化大大依赖于cd8+t细胞上pd-1表达的水平我们分析了抑制性受体的表达是否能与folr1-tcb处理后降低的t细胞功能性关联起来。与上文实施例41中描述的结果一致，与pd-1高贫乏的肿瘤相比，folr1-tcb诱导的t细胞活化(以cd25，cd137，和icos表达例示，分别为p＝0.028，p<0.001，和p＝0.008)和t细胞效应器功能(以ifn-γ，il-2，tnf，以及穿孔素分泌指示)在pd-1高丰富的肿瘤中显著受损(分别为p＝0.019，p＝0.007，p＝0.028，和p＝0.029；图37a-g)。类似地，pd-1高丰富的肿瘤在folr1-tcb刺激后展示显著降低的细胞毒性，而在大多数pd-1高贫乏的肿瘤中能观察到强肿瘤细胞杀伤(p＝0.021；图37h)。实施例50pd-1阻断只在pd-1高贫乏的肿瘤中恢复folr1-tcb诱导的t细胞功能由于til上pd-1表达的水平与folr1-tcb的功效有关，我们分析了与folr1-tcb处理组合阻断pd-1/pd-l1轴是否可能能够恢复t细胞功能。我们发现在用folr1-tcb和pd-1阻断性抗体nivolumab(mdx5c4)组合处理后效应器细胞因子ifn-γ，tnf，和il-2以及穿孔素的分泌只在一些pd-1高贫乏的肿瘤中能升高。相反，在pd-1高丰富的肿瘤中，pd-1阻断未能引发任何响应(图38a-d)。值得注意的是，在来自pd-1高贫乏的或pd-1高丰富的肿瘤的t细胞中均不能通过另外的pd-1阻断来改善细胞毒性肿瘤细胞杀伤(图38e)。本文中给出的例子描述了cd3xfolr1特异性tcb在来自具有非小细胞肺癌(nsclc)，上皮卵巢癌(eoc)和肾细胞癌(rcc)的患者的原发性癌症损害中的免疫调控能力。与来自健康供体的完全功能性的外周t细胞相比，我们观察到不同人肿瘤样品间folr1-tcb诱导的肿瘤细胞杀伤和t细胞活化的实质性异质性，导致对大多数患者中t细胞功能的部分或完全损害。对肿瘤内t细胞的细胞表面上的抑制性受体表达的全面分析揭示了folr1-tcb的t细胞活化的功效与pd-1的表达水平逆相关。具有pd-1高丰富的肿瘤的患者在folr1-tcb处理后展示受损的t细胞活化和效应器功能。另外，这些患者不响应pd-1阻断，与它们的pd-1高贫乏的表达对应物形成对比。如此，双特异性抗体的生物活性受到t细胞功能障碍的可观妨碍，这至少部分伴有持久且高度多样的抑制性受体表达。我们在来自健康供体的pbmc中在folr1-tcb刺激后观察到t细胞活化标志物，效应器细胞因子分泌和肿瘤细胞杀伤的强上调(图40)。恰恰相反，然而，t细胞效应器功能大大变化，而且在肿瘤内t细胞中一般降低。特别是，在大多数肿瘤中il-2生成完全丧失和tnf和ifn-γ分泌严重受损的til中的杀伤能力和效应器细胞因子生成显著更低。我们记录了肿瘤内cd8+t细胞上抑制性受体pd-1，tim-3，ctla-4，lag-3，和btla的表达。pd-1展示所有分析的抑制性受体中最广泛的表达。blackburn得出的来自慢性鼠lcmv感染的观察结果提示功能上不同的pd-1阳性t细胞子集的存在，它们可以使用流式细胞术基于mfi水平分开(blackburnetal.,pnas105(39):15016(2008))。值得注意的是，pd-1高t细胞子集展示tim-3和ctla-4的高共表达及lag-3和btla的程度较低的共表达，而它们的pd-1中对应物只表达低水平的其它抑制性受体，与pd-1阴性t细胞相当。pd-1高cd8+t细胞的频率在患者间大大不同，而且容许我们区分pd-1高丰富的和贫乏的肿瘤。与具有pd-1高贫乏表型的患者形成对比，展示pd-1高丰富表型的肿瘤中folr1-tcb介导的t细胞活化和肿瘤细胞杀伤显著受损。这些数据延伸及确认先前的观察结果，即cd8+t细胞的活化和效应器功能与多种免疫检查点的共表达有关(sakuishietal.，jexpmed2010；207(10):2187-94；fourcadeetal.,jexpmed2010；207(10):2175-86；grossoetal.,jimmunol2009；182(11):6659-69；matsuzakietal.,procnatlacadsciusa2010；107(17):7875-80；fourcadeetal.,cancerres2012；72(4):887-96)。因此pd-1高t细胞的频率可能作为tcb活化后til功能性的替代标志物是有用的以及充当针对tcb处理的治疗性响应的预测标志物。这种免疫概况能指导选择很可能响应免疫疗法诸如tcb的患者。它与临床好处的关联有待在前瞻性临床干预中确定。改善tcb的治疗功效的一条有希望的路径是阻断t细胞上的抑制性信号。因为pd-1是所有分析的肿瘤中最突出表达的抑制性受体，我们评估了pd-1阻断是否能在tcb活化后增强t细胞效应器功能。值得注意的是，我们在组合folr1-tcb和抗pd-1处理后观察到升高的效应器细胞因子分泌，尽管只在pd-1高贫乏的肿瘤中。如此，显然需要利用pd-1高转变成pd-1中t细胞来提高对pd-1/pd-l1阻断的易感性的新颖治疗策略。引人注目的是，我们在伴随pd-1阻断后在所有肿瘤样品中没有观察到肿瘤细胞杀伤的改善。如此，阻断单一免疫检查点可能不足以恢复til的溶胞能力。然而，在小鼠肿瘤模型中，阻断pd-1/pd-l1轴已经显示出提高t细胞浸润入肿瘤中(curranetal.，procnatlacadsciusa2010；107(9):4275-80)，这种处理的这种特征是我们的体外办法无法解决的。如此，pd-1阻断的体内治疗效果可能不仅源自改善残留的肿瘤内t细胞的t细胞细胞毒性，而且源自新浸润的t细胞的持久功能性。tcb诱导的t细胞活化已经显示出上调pd-1表达，这在肿瘤细胞和浸润性免疫细胞二者上表达的pd-l1存在下可导致继发抗性(secondaryresistance)，正如最近用her2特异性tcb和癌胚抗原(cea)特异性tcb二者证明的(junttilaetal.，cancerres2014；74(19):5561-71；osadaetal.,cancerimmunolimmunother2015)。重要的是，阻断pd-1/pd-l1轴在体外及在小鼠肿瘤模型中均能完全恢复tcb诱导的t细胞功能。这些观察结果指示共施用检查点抑制剂能够预防继发抗性，它可能叠加til的功能障碍性状态及限制tcb的治疗功效。显然需要进一步的工作来确定检查点抑制剂和tcb的最佳组合方案。鉴定具有非冗余功能的抑制性和活化性t细胞受体作为潜在治疗靶也会是至关紧要的。我们的发现清楚地指示双特异性抗体诸如folr1-tcb能够引起t细胞上调共刺激分子，生成炎性细胞因子，及获取溶胞功能。我们观察到不同状态的t细胞功能障碍，它们至少部分伴有抑制性受体的表达，而且在一些情况中降低tcb的有效性。因为pd-1阻断只能部分恢复folr1-tcb诱导的效应器功能，我们的结果提示一种有点复杂的免疫调节，它利用多种且最终无冗余的途径来维持肿瘤环境内的t细胞功能障碍。序列例示性实施方案的氨基酸序列1)在共同轻链型式中有用的folr结合物，可变重链2)cd3结合物，共同轻链(clc)3)cd3结合物，重链4)对于crossfab型式有用的folr结合物5)在crossfab型式中有用的cd3结合物6)cd3-folr双特异性抗体2+1倒转的crossmab型式的例示性氨基酸序列7)具有共同轻链的cd3-folr双特异性抗体的例示性氨基酸序列8)具有降低的亲和力的例示性16d5变体a.具有降低的亲和力的例示性轻链变体b.具有降低的亲和力的例示性重链变体9)自噬菌体展示文库生成的另外的例示性实施方案(cdr标有下划线)10)9d11糖位点变体：例示性实施方案的可变轻链(cdr标有下划线)11)脱氨变体12)例示性实施方案的基于mov19的folr1tcb(cdr标有下划线)13)具有中等亲和力结合物的另外的folr1tcb(依照kabat的cdr标有下划线)14)抗原序列2)例示性实施方案的核苷酸序列例示性抗pd-1拮抗剂序列例示性抗tim3抗体序列如下，下文序列表中列出了例示性抗tim3抗体氨基酸序列和例示性tim3序列：尽管为了理解清楚的目的已经通过例示和实施例较为详细地描述了前述发明，但是该描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提述明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。序列表<110>豪夫迈·罗氏有限公司（f.hoffmann-larocheag）<120>t细胞活化性双特异性抗原结合分子cd3abd叶酸受体1(folr1)和pd-1轴结合拮抗剂的组合疗法<130>32401<140><141><150>ep15167173.2<151>2015-05-11<150>ep15152141.6<151>2015-01-22<150>ep14194136.9<151>2014-11-20<160>430<170>patentinversion3.5<210>1<211>120<212>prt<213>人工序列<220><221>来源<223>/注解="人工序列的描述:合成的多肽"<400>1glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphe505560glnglyargvalthrmetthrargaspthrserthrserthrvaltyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasntyrtyralaglyvalthrpropheasptyrtrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserser115120<210>2<211>120<212>prt<213>人工序列<220><221>来源<223>/注解="人工序列的描述:合成的多肽"<400>2glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphe505560glnglyargvalthrmetthrargaspthrserthrserthrvaltyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasntyrtyrthrglyglyserseralapheasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalser115120<210>3<211>120<212>prt<213>人工序列<220><221>来源<223>/注解="人工序列的描述:合成的多肽"<400>3glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphe505560glnglyargvalthrmetthrargaspthrserthrserthrvaltyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasntyrtyrleupheserthrserpheasptyrtrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserser115120<210>4<211>120<212>prt<213>人工序列<220><221>来源<223>/注解="人工序列的描述:合成的多肽"<400>4glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphe505560glnglyargvalthrmetthrargaspthrserthrserthrvaltyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasntyrtyrileglyilevalpropheasptyrtrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserser115120<210>5<211>120<212>prt<213>人工序列<220><221>来源<223>/注解="人工序列的描述:合成的多肽"<400>5glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphe505560glnglyargvalthrmetthrargaspthrserthrserthrvaltyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasntyrtyrvalglyvalserpropheasptyrtrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserser115120<210>6<211>120<212>prt<213>人工序列<220><221>来源<223>/注解="人工序列的描述:合成的多肽"<400>6glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphe505560glnglyargvalthrmetthrargaspthrserthrserthrvaltyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasnphethrvalleuargvalpropheasptyrtrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserser115120<210>7<211>120<212>prt<213>人工序列<220><221>来源<223>/注解="人工序列的描述:合成的多肽"<400>7glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala15101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注解="此区域可包含3-6个"glyglyglyser"重复单元"<220><221>变异<222>(25)..(27)<223>/替换=""<220><221>混杂特征<222>(1)..(27)<223>/注解="序列中给出的变异残基就注释中关于变异位置的那些而言没有偏爱"<400>429glyglyglyserglyglyglyserglyglyglyserglyglyglyser151015glyglyglyserglyglyglyserglyglygly2025<210>430<211>28<212>prt<213>人工序列<220><221>来源<223>/注解="人工序列的描述:合成的肽"<220><221>变异<222>(11)..(25)<223>/替换=""<220><221>混杂特征<222>(1)..(25)<223>/注解="此区域可包含2-5个"glyglyglyglyser"重复单元"<220><221>变异<222>(26)..(28)<223>/替换=""<220><221>混杂特征<222>(1)..(28)<223>/注解="序列中给出的变异残基就注释中关于变异位置的那些而言没有偏爱"<400>430glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly151015glyglyglyserglyglyglyglyserglyglygly2025当前第1页12