包含纤溶酶原的药物组合物和其用途的制作方法

发明领域

本发明涉及医学领域。更具体地说，本发明涉及一种包含纤溶酶原的药物组合物和其治疗用途。

发明背景

纤溶酶原为如图1a中所示的纤溶酶的酶原。图1b中展示了人类纤溶酶原前体的氨基酸序列。人类纤溶酶原含有791个氨基酸(前体＝810个氨基酸)，并且分子量为约90kda并且pi为约7.0，不过差异糖基化和/或n端活化肽的移除可产生6.2至8.0的pi范围。具有24个链内二硫键、5个环状结构域(kringledomain)(结合于纤维蛋白和α2-抗纤溶酶抑制剂时所涉及)、丝氨酸蛋白酶结构域(p)以及活化肽(ap)的单链蛋白质组成头77个氨基酸。存在一个n-键联糖基化位点和一个o-键联位点，不过已识别出第二o-键联位点(goldberg,2006)。循环中的纤溶酶原约70％仅含有o-键联糖基化，而其余部分含有n-键联糖与o-键联糖两者。

天然纤溶酶原以两种主要形式产生，即glu-纤溶酶原(glu-pg)和lys-纤溶酶原(lys-pg)，它们是针对谷氨酸或赖氨酸的n端氨基酸加以命名。glu-pg由通过基因序列命名的整个氨基酸序列(排除活化肽)组成，而lys-pg为glu-pg在lys-77与lys-78(在图1b中加下划线)之间裂解的结果。lys-pg的循环半衰期明显比glu-pg短(glu-pg为2-2.5天，lys-pg为0.8天)。glu-pg为存在于血浆中的pg的主导形式，并且在循环中检测到极少的lys-pg(violand,b.n.,byrne,r.,castellinof.j.(1978)theeffectofα-,ω-aminoacidsonhumanplasminogenstructureandactivation.jbiolchem.253(15):5395-5401；collend,ongeb,johnsonaj.(1975)humanplasminogen:invitroandinvivoevidenceforthebiologicalintegrityofnh2-terminalglutamicacidplasminogen.thrombosisresearch.7(4):515-529)。

纤溶酶原是在肝脏中合成并且分泌至血浆中。纤溶酶原分布于整个身体中并且当存在活化的条件时，纤溶酶原(plasminogenpro-enzyme)由纤溶酶原活化剂(t-pa)或由尿激酶纤溶酶原活化剂(u-pa)转化为活性酶纤溶酶。然后，纤溶酶降解纤维蛋白并且将潜伏性基质金属蛋白酶(pro-mmp)转化成活性mmp，活性mmp又进一步降解细胞外基质(ecm)作为组织愈合/重建过程的一部分。纤维蛋白稳态中主要涉及由t-pa介导的纤溶酶原激活，而经由u-pa产生纤溶酶，从而与其受体u-par形成复合物在组织重建中起作用。

现在或曾经研究了纤溶酶用于清除人造装置和血液透析移植物中的血栓性阻塞以及用于治疗玻璃体后脱离(pvd)的潜在用途(us6,969,515；us2010/0104551)。

研究了纤溶酶原在治疗适应症，诸如伤口愈合、鼓膜穿孔愈合、牙周伤口愈合、传染性疾病、口腔健康、糖尿病性溃疡、溶栓适应症(诸如冠状动脉血栓形成)、组织的再灌注损伤、缺血、梗塞、脑水肿；改善微循环以及调节补体途径中的用途(us8,637,010；us8,679,482；us8,318,661；wo95/12407；ep0,631,786)。迄今为止，当前药物市场上仍没有作为药物的纤溶酶原。

历史上，lys-pg因血液学目的而在药学上商业化了一段时间，而自从2000年以来在科学上或医学上一直未被使用。schott等人,1998,thenewenglandjournalofmedicine,第339卷,第23期,第1679-1686页)中描述了lys-pg的制剂。同时，临床上使用了可获得的lys-pg并且针对木样结膜炎(基础病状低纤溶酶原血症(纤溶酶原缺乏i型)的临床表现)的治疗进行了研究。因此，已测试lys-pg浓缩物的全身性施用。kraft等人(kraftj,liebw,zeitlerp,schusterv.(2000)ligneousconjunctivitisinagirlwithseveretypeiplasminogendeficiency.graefesarchclinexpophthalmol.238(9):797-800)报导，在具有严重低纤溶酶原血症的儿童中每天输注lys-pg使得结膜假膜部分溶解。schott等人(1998)报导，在6月龄儿童中，以连续输注形式并且随后以每天快速注射形式用lys-pg制剂治疗在4周内使得木样结膜炎完全消退并且使呼吸道中的高粘分泌正常化并且使皮肤伤口愈合。schuster等人(schusterv,hugleb,tefsk(2007)plasminogendeficiency.jthrombhaemost5(12):2315-2322)报导，纯合或复合性杂合(在特定基因座存在两种不同突变等位基因，各自位于一对染色体的各染色体上)低纤溶酶原血症患者中的纤溶酶原水平为纤溶酶原抗原血浆水平在<1至9mg/dl范围内并且功能性纤溶酶原活性在<1％至51％范围内。重要的是，注意到这些患者中大部分具有一定的残余纤溶酶原活性水平。因此，纤溶酶原置换预期为有效的，因为它是内源性蛋白质并且预期不具有免疫原性或纤维蛋白溶解活性问题。虽然文献已明确记录全身性或局部纤溶酶原浓缩物为有效治疗，引起病变的消退并且使其再形成停止(wattsp,sureshp,mezere,ellsa,albisettim,bajzarl,marzinottov,andrewm,massicotlep,rootmand(2002)effectivetreatmentofligneousconjunctivitiswithtopicalplasminogen.amjophthalmol133(4):451-455；heidemanndg,williamsga,hartzerm,ohaniana,citronme(2003)treatmentofligneousconjunctivitiswithtopicalplasminandtopicalplasminogen.cornea22(8):760-762；以及schott,1998)，但不可商购获得用于局部或用于全身性治疗的纯化的纤溶酶原产品。

仅在最近，才进行了利用glu-pg来治疗i型纤溶酶原缺乏(clinicaltrials.govidentifier:nct02312180)以及使用glu-pg局部滴眼液治疗其临床表现之一(木样结膜炎)(clinicaltrials.govidentifier:nct01554956)的临床试验。

可通过改变蛋白质的结构特征(内部)和/或通过控制与其接触的组分(外部)来稳定蛋白质。一些蛋白质归因于其物理化学特性往往不幸地引起结构不稳定而在处理和药物制剂的性能方面提出特定挑战。它们可实际上经历如下所例示的各种类型的降解：1)导致形成相关杂质的化学过程，所述化学过程可涉及水解、氧化反应、脱酰胺基作用或结构重排，诸如异asp或分子内截短；或2)引起聚集/聚合的物理过程，由此产生结构变化，这可能会影响生物活性并且潜在地增强免疫原性。

制剂研制泛指在足够的程度上表征活性药物成分(api)，使其可转化为药学上可接受的原料药的过程。必须进行原料药的生物物理学表征以证实存在恰当折叠并且具生物活性的结构。可使用若干光谱技术(荧光、cd、dsc、dls等)来检验溶液中的蛋白质三级结构并且评估不同制剂的稳定性以及不同配制条件对蛋白质结构的的影响。(volkin,d.b.等人“preformulationstudiesasanessentialguidetoformulationdevelopmentandmanufactureofproteinpharmaceutical.”developmentandmanufactureofproteinpharmaceuticals.stevel.nail和michaelj.akers编,kluweracademic2002第1章,第1-39页；cheng,w.等人“comparisonofhigh-throughputbiophysicalmethodstoidentifystabilizingexcipientsforamodeligg2monoclonalantibody:conformationalstabilityandkineticaggregationmeasurements”journalofpharmaceuticalsciences,第101卷,第5期,第1701-1720页,2012)。此外，药物行业往往通过针对原料药的释放进行生物分析来证实api的结构完整性。总的来说，他们确认尚未因配制而无意中改变优选制剂。纤溶酶原为一种蛋白质，所述蛋白质主要用于制备纤溶酶，从而用于溶栓适应症(诸如冠状动脉血栓形成)、清除人造装置和血液透析移植物中的血栓性阻塞并且用于组织的再灌注损伤、治疗缺血、梗塞、脑水肿，或用于改善微循环(wo95/12407；us6,969,515；ep0,631,786)。

还已发现施用纤溶酶原适合用于许多治疗适应症(诸如溶栓适应症，诸如冠状动脉血栓形成)、治疗组织的再灌注损伤、治疗缺血、梗塞、脑水肿或用于改善微循环、伤口愈合、鼓膜穿孔愈合、牙周伤口愈合、传染性疾病、口腔健康、糖尿病性溃疡、纤溶酶原缺陷型受试者以及调节补体途径(wo95/12407；ep0,631,786；us8,637,010；us8,679,482；us8,318,661)。

在配制纤溶酶原时遇到若干挑战。一些问题起因于纤溶酶原制剂的纤溶酶污染，其降解纤溶酶原。已使用多种方法来避免纤溶酶原的降解，包括添加抑肽酶、赖氨酸、苯基甲磺酰氟、大豆胰蛋白酶抑制剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂(us4,177,262；us4,361,653；us5,304,383)。

其他困难由当纤溶酶原溶解于水性溶剂中时的浊度或存在丝状物质代表。为克服此缺点，已提出将纤溶酶原与例如非离子表面活性剂或与蔗糖、氨基酸以及白蛋白的混合物组合(wo94/15631)。

不存在已知用于人类治疗用途的glu-pg商业制剂。仅有的已知glu-pg制剂仅用于研究。

对研制纤溶酶原的药物组合物存在需要。

本说明书提到许多文献，这些文献的内容以全文引用的方式并入本文中。

发明概要

本发明涉及一种包含纤溶酶原的药物组合物和其用途。

本发明涉及以下第1项至第61项：

1.一种药物组合物，其包含：

-纤溶酶原，或其生物活性变体；

-张力调节剂；以及

-稳定剂；

其中所述组合物具有约3.0至约10.0的ph值。

2.如第1项所述的药物组合物，其中所述ph值为5.0至8.0；或6.0至8.0；或6.5至7.5。

3.如第1项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体的浓度为约0.01mg/ml至约80mg/ml，或约5mg/ml至约60mg/ml。

4.如第3项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体的浓度为约40、30、20、10或5mg/ml。

5.如第1项至第4项中任一项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体占所述组合物的总蛋白含量的至少80％或所述组合物的总蛋白含量的90％以上。

6.如第5项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体占所述组合物的总蛋白含量的95或98％以上。

7.如第1项至第6项中任一项所述的药物组合物，其中所述稳定剂包含(i)氨基酸，(ii)氨基酸盐，(ii)氨基酸类似物，或(iv)(i)、(ii)和/或(iii)的任何混合物。

8.如第7项所述的药物组合物，其中所述氨基酸、氨基酸盐或氨基酸类似物为精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、赖氨酸类似物或ε-氨基己酸。

9.如第8项所述的药物组合物，其中所述稳定剂为精氨酸。

10.如第1项至第9项中任一项所述的药物组合物，其中所述稳定剂的浓度为约20mm至约200mm。

11.如第10项所述的药物组合物，其中所述稳定剂的浓度为约25mm至约75mm。

12.如第1项至第11项中任一项所述的药物组合物，其中所述张力调节剂为氯化钠、氯化钙、氯化镁、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、乳糖、山梨糖醇、右旋糖、环糊精、棉子糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)或其任何组合。

13.如第12项所述的药物组合物，其中所述张力调节剂为氯化钠。

14.如第1项至第13项中任一项所述的药物组合物，其中所述张力调节剂以约30mm至约250mm的浓度存在。

15.如第14项所述的药物组合物，其中所述张力调节剂以约25mm至约50mm或约35mm的浓度存在。

16.如第1项至第15项中任一项所述的药物组合物，其进一步包含填充剂。

17.如第16项所述的药物组合物，其中所述填充剂为甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘露糖醇、山梨糖醇、羟乙基淀粉、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、甘露糖醇、聚乙二醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇、木糖醇或其任何组合。

18.如第17项所述的药物组合物，其中所述填充剂为甘露糖醇或山梨糖醇。

19.如第16项至第18项中任一项所述的药物组合物，其中所述填充剂的浓度为约50mm至约300mm。

20.如第19项所述的药物组合物，其中所述填充剂的浓度为约50至约125mm。

21.如第1项至第20项中任一项所述的药物组合物，其进一步包含还原糖。

22.如第21项所述的药物组合物，其中所述还原糖为果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖或其任何组合。

23.如第1项至第22项中任一项所述的药物组合物，其进一步包含非还原糖。

24.如第23项所述的药物组合物，其中所述非还原糖为蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖或其任何组合。

25.如第1项至第24项中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有约180mosm与约350mosm之间的渗透压。

26.如第1项至第25项中任一项所述的药物组合物，其进一步包含防腐剂。

27.如第26项所述的药物组合物，其中所述防腐剂为间甲酚、苯甲醇、甲醇、乙醇、异丙醇、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、苯酚、甘油、木糖醇、间苯二酚、儿茶酚、2,6-二甲基环己醇、2-甲基-2,4-戊二醇、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、2-氯酚、苄索氯铵、硫柳汞(硫汞撒)、苯甲酸(对羟苯甲酸丙酯)mw180.2、苯甲酸mw122.12、苯扎氯铵、氯丁醇、苯甲酸钠、丙酸钠、氯化十六烷基吡啶或其任何组合。

28.如第26项或第27项所述的药物组合物，其中所述防腐剂的浓度为约0.005至约10％(w/v)。

29.如第1项至第28项中任一项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体为人类纤溶酶原。

30.如第1项至第29项中任一项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体由80％以上的glu-纤溶酶原构成。

31.如第1项至第29项中任一项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体为glu-纤溶酶原。

32.如第1项至第31项中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物含有低于每100ml6000个粒子的量的等于或大于10μm的粒子。

33.如第32项所述的药物组合物，其中所述粒子量低于每100ml2000或1000个粒子。

34.如第1项至第33项中任一项所述的药物组合物，其适合用于经静脉内、皮下、局部、真皮内、眼部和/或肌肉内施用。

35.如第1项至第34项中任一项所述的药物组合物，其为液体组合物、适合于冻干的液体组合物、适合于冷冻的液体组合物、冻干组合物、冷冻组合物或复原组合物。

36.如第1项至第34项中任一项所述的药物组合物，其为液体、凝胶、乳膏或软膏。

37.如第1项至第36项中任一项所述的药物组合物，其用作药剂。

38.一种包含纤溶酶原或其生物活性变体的药物组合物，其含有低于每100ml6000个粒子的量的等于或大于10μm的粒子。

39.如第38项所述的药物组合物，其中所述粒子量低于每100ml2000或1000个粒子。

40.如第38项或第39项所述的药物组合物，其进一步包含稳定剂。

41.如第40项所述的药物组合物，其中所述稳定剂包含(i)氨基酸，(ii)氨基酸盐，(ii)氨基酸类似物，或(iv)(i)、(ii)和/或(iii)的任何混合物。

42.如第41项所述的药物组合物，其中所述氨基酸、氨基酸盐或氨基酸类似物为精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、赖氨酸类似物或ε-氨基己酸。

43.如第42项所述的药物组合物，其中所述稳定剂为精氨酸。

44.如第40项至第43项中任一项所述的药物组合物，其中所述稳定剂的浓度为约25mm至约75mm。

45.如第38项至第44项中任一项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体的浓度为约0.01mg/ml至约80mg/ml。

46.如第45项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体的浓度为约5mg/ml至约60mg/ml。

47.如第38项至第46项中任一项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体占所述组合物的总蛋白含量的约95％以上或所述组合物的总蛋白含量的约98％以上。

48.如第38项至第47项中任一项所述的药物组合物，其进一步包含张力调节剂。

49.如第48项所述的药物组合物，其中所述张力调节剂为氯化钠、氯化钙、氯化镁、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、乳糖、山梨糖醇、右旋糖、棉子糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)或其任何组合。

50.如第49项所述的药物组合物，其中所述张力调节剂为氯化钠。

51.如第48项、第49项或第50项所述的药物组合物，其中所述张力调节剂以约30mm至约250mm的浓度存在。

52.如第38项至第51项中任一项所述的药物组合物，其进一步包含填充剂。

53.如第52项所述的药物组合物，其中所述填充剂为甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘露糖醇、山梨糖醇、羟乙基淀粉、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、甘露糖醇、聚乙二醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇、木糖醇或其任何组合。

54.如第53项所述的药物组合物，其中所述填充剂为甘露糖醇或山梨糖醇。

55.如第52项、第53项或第54项所述的药物组合物，其中所述填充剂的浓度为约50mm至约300mm。

56.如第38项至第55项中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有约180mosm与约350mosm之间的渗透压。

57.如第38项至第61项中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有约6.5至约8.0的ph值。

58.如第38项至第57项中任一项所述的药物组合物，其中纤溶酶原或其生物活性变体为人类纤溶酶原。

59.如第38项至第58项中任一项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体由80％以上的glu-纤溶酶原构成。

60.如第38项至第58项中任一项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原或其生物活性变体为glu-纤溶酶原。

61.如第38项至第60项中任一项所述的药物组合物，其用作药剂。

由以下描述、权利要求以及本文的概述本发明的其他方面对本领域技术人员来说将显而易见。

附图简单说明

图1a为纤溶酶原的一级结构的示意图，示出其环状结构域、纤溶酶裂解位点和链激酶结合位点。

图1b示出了人类纤溶酶原前体的氨基酸序列。以粗体示出成熟形式的序列，并且将存在裂解以产生lys-pg的两个赖氨酸残基加下划线。

图2为含有冻干之后的制剂1的安慰剂(不含pg)的小瓶的图片。

图3为含有冻干之后的制剂1(表1a中所描述)的小瓶的图片。

图4为含有冻干之后的制剂2的安慰剂(不含pg)的小瓶的图片。

图5为含有冻干之后的制剂2(表1a中所描述)的小瓶的图片。

图6为含有冻干之后的制剂3的安慰剂(不含pg)的小瓶的图片。

图7为含有冻干之后的制剂3(表1a中所描述)的小瓶的图片。

图8为含有冻干之后的制剂4的安慰剂(不含pg)的小瓶的图片。

图9为含有冻干之后的制剂4(表1a中所描述)的小瓶的图片。

图10为含有冻干之后的制剂5的安慰剂(不含pg)的小瓶的图片。

图11为含有冻干之后的制剂5(表1a中所描述)的小瓶的图片。

图12第f0498号冻干组合物的小瓶的图片，所述冻干组合物含有于10mmtris-hcl、35mmnacl(ph8.0)以及28.5mm(0.5％)精氨酸中的20mg/ml纤溶酶原。

图13第f0449号冻干组合物的小瓶的图片，所述冻干组合物含有于10mm磷酸钠、35mmnacl(ph7.2)、28.5mm(0.5％)精氨酸以及54mm(1％)甘露糖醇中的10mg/ml纤溶酶原。

图14第f0459号冻干组合物的小瓶的图片，所述冻干组合物含有于10mm磷酸钠、35mmnacl(ph7.2)、28.5mm(0.5％)精氨酸以及54mm(1％)甘露糖醇中的20mg/ml纤溶酶原。

图15为在0.02、20、100、800ntu的浊度标准液旁边的分别含有于水(样品0)、10mm柠檬酸钠缓冲液(ph6.5)(样品1)、10mm磷酸钠缓冲液(ph7.2)(样品2)以及10mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)(样品3)中的5mg/ml纤溶酶原的小瓶的图片。

图16为与图12中所示相同的小瓶的图片，除了已向样品1、2以及3中添加35mmnacl和28.5mm(0.5％)arg。

图17、18以及19为示出了含有10mg纤溶酶原、35mmnacl加上0.5％甘氨酸、精氨酸、丙氨酸而不含氨基酸的组合物在ph6.5下在柠檬酸钠缓冲液中(图17)、在ph7.2下在磷酸钠缓冲液中(图18)以及在ph8.0下在tris缓冲液中(图19)历经4小时的时间的浊度的图。

图20、21以及22为示出了含有10mg纤溶酶原、35mmnacl、0.5％甘露糖醇加上0.5％甘氨酸、精氨酸、丙氨酸而不含氨基酸的组合物在ph6.5下在柠檬酸钠缓冲液中(图20)、在ph7.2下在磷酸钠缓冲液中(图21)以及在ph8.0下在tris缓冲液中(图22)历经4小时的时间的浊度的图。

发明详述

本文公开一种包含纤溶酶原或其生物活性变体的药物组合物。

本文还公开一种包含以下组分的药物组合物：

-纤溶酶原，或其生物活性变体；

-张力调节剂；以及

-稳定剂；

组合物具有约3.0至约10.0；优选约5.0至约8.0；更优选约6.0至约8.0；且进一步优选约6.5至约7.5的ph值。

本发明涉及一种具有增加的稳健性的包含纤溶酶原或其生物活性变体的药物组合物。本发明涉及一种包含纤溶酶原或其生物活性变体的药物组合物，所述药物组合物具有计数低于每100ml组合物6000个粒子或低于每100ml组合物5000个粒子或低于每100ml组合物4000个粒子或低于每100ml组合物3000个粒子或低于每100ml组合物2000个粒子或低于每100ml组合物1000个粒子的10μm或更大的粒子。在本发明的一个实施方案中，在冻干和复原之后粒子的计数仍较低。在本发明的一个实施方案中，相同组合物的重复制备未提供粒子计数改变。

如本文所用的术语“纤溶酶原”是指来自任何动物(例如哺乳动物，例如人类)的任何形式的天然纤溶酶原多肽(例如glu-纤溶酶原或lys-纤溶酶原)。纤溶酶原为由组织型纤溶酶原活化剂(t-pa)或由尿激酶纤溶酶原活化剂(u-pa)转化为活性酶纤溶酶的酶原。然后，纤溶酶降解纤维蛋白并且将潜伏性基质金属蛋白酶(pro-mmp)转化成活性mmp，活性mmp又进一步降解细胞外基质(ecm)作为组织愈合/重建过程的一部分。如本文所用的术语“生物活性变体”是指保留天然纤溶酶原的生物活性(即转化为能够降解纤维蛋白并且将潜伏性基质金属蛋白酶(pro-mmp)转化成活性mmp的纤溶酶多肽(由t-pa和或u-pa)的能力)的突变纤溶酶原多肽。变体可包含一个或多个氨基酸取代、缺失/截短(n端、c端和/或内部氨基酸缺失/截短)、添加(n端、c端和/或内部氨基酸添加)。生物活性变体可展现更低、更高或类似于天然纤溶酶原多肽的生物活性(例如所得纤溶酶的酶活性)。在实施方案中，变体与天然纤溶酶原多肽具有至少60、70、75、80、85、90或95％氨基酸序列同一性。例如wo2012/093132、wo2013/024074以及wang等人(1995,proteinscience4,1758-1767)中描述了生物活性纤溶酶原变体，并且包括通常称为“中型纤溶酶原(midiplasminogen)”、“小型纤溶酶原(miniplasminogen)”、“微型纤溶酶原(microplasminogen)”以及“δ-纤溶酶原”纤溶酶原的缺少一个或多个环状结构域和/或其部分的截短变体。在一个实施方案中，纤溶酶原为人类纤溶酶原。在另一个实施方案中，组合物包含天然人类纤溶酶原。纤溶酶原可获自若干来源。它可通过重组合成来获得，或从血液、血浆或血液衍生溶液萃取/纯化。可通过科恩分级分离(cohnfractionation)或通过沉淀从血液或血浆萃取纤溶酶原。可通过结合亲和色谱(诸如wo2006/120423中所描述的方法)从血浆或血液衍生的溶液纯化，或者重组产生纤溶酶原。

在一个实施方案中，纤溶酶原或其生物活性变体以约0.01mg/ml至约80mg/ml；优选约1mg/ml至约60mg/ml；优选约5mg/ml至约60mg/ml；优选约5mg/ml至约40mg/ml；优选约2mg/ml至约30mg/ml，更优选约2mg/ml至约20mg/ml并且进一步优选约80、70、60、50、40、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.05或0.01mg/ml的浓度存在。

在本发明的一个实施方案中，药物组合物中所含的纤溶酶原或其生物活性变体具有超过约80％或超过约90％或超过约95％或超过约98％的纯度。术语“约”是指值偏差大约10％。

本发明组合物的ph值可为约3.0至约10.0；约5.0至约8.0；约6.0至约8.0；或约6.5至约7.5。在实施方案中，本发明组合物的ph值为约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、8.0、8.5、9.0或10.0。为使组合物维持在此类ph值，本发明组合物优选包含缓冲液。视所需ph值而定，在本发明范围内可使用许多缓冲液，包括以下缓冲液：

在一个实施方案中，缓冲液包含两种缓冲液的组合；诸如柠檬酸盐/磷酸盐、柠檬酸盐/组氨酸、乙酸盐/组氨酸或琥珀酸盐/组氨酸。在本发明的一个实施方案中，缓冲液不包含柠檬酸盐缓冲液。在另一个实施方案中，缓冲液为柠檬酸盐、磷酸盐(k2hpo4/nahpo4)、组氨酸或琥珀酸盐。在另一个实施方案中，缓冲液为磷酸盐(k2hpo4/nahpo4)、组氨酸或琥珀酸盐。

在一个实施方案中，缓冲液的浓度为约10mm至约50mm，或约10mm至约30mm，例如约2mm或约10mm。

如本文所用，“张力调节剂”是指用于调节药物组合物的张力的化合物。在一个实施方案中，张力调节剂以使得组合物等张的量存在。在另一个实施方案中，张力调节剂以使得组合物高张或低张的量存在。在一个实施方案中，张力调节剂为氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、na2so4、zncl2、硼酸盐、药学上可接受的单价盐、药学上可接受的二价盐、药学上可接受的三价盐、药学上可接受的四价盐、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、乳糖、山梨糖醇、右旋糖、环糊精、棉子糖、糖醇、聚乙二醇、羟乙基淀粉、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)或其任何组合。“等张”意味着本发明的组合物具有与人类血液的渗透压基本上相同的渗透压。等张组合物通常具有约250至约330mosm的渗透压。渗透压可使用例如蒸气压或冰冻型渗透压计来测量。在一个实施方案中，药物组合物包含两种张力调节剂的混合物。在另一个实施方案中，药物组合物包含三种张力调节剂的混合物。在一个实施方案中，张力调节剂为糖或包含糖，或为糖的混合物。在一个实施方案中，张力调节剂为氯化钠。在一个实施方案中，张力调节剂浓度的浓度为约30mm至约250mm，或约20mm至约150mm，或约30mm至约100mm。在一个实施方案中，张力调节剂浓度的浓度为约约34mm，或约35mm，或约68mm，或约75mm。在一个实施方案中，调节张力调节剂的浓度，使得组合物的所得渗透压属于所需范围内。

在一个实施方案中，组合物进一步包含填充剂。如本文所用，“填充剂”是指增加组合物的体积量(bulkmass)的化合物/试剂。填充剂的实例包括但不限于甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘露糖醇、羟乙基淀粉、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、甘露糖醇、山梨糖醇、寡糖源生的糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇、木糖醇、聚乙二醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖醇、nacl或其任何组合。这些试剂还可充当张力调节剂。在实施方案中，填充剂的浓度为约50mm至约300mm；或约100mm至约200mm，或约150mm，或约50mm至约150mm，或约108mm，或约54mm。

在一个实施方案中，张力调节剂和填充剂的浓度使得张力调节剂/填充剂比率为约1.0至约15.0(wt/wt)；约1.0至约10.0、约3.0至约10.0、约5.0至约10.0(例如约5.0、约8.0或约10.0)。在一个实施方案中，基于张力调节剂的浓度调节填充剂的浓度，使得张力调节剂/填充剂比率在所需范围内。

在实施方案中，组合物进一步包含一种或多种其他药学上可接受的成分，诸如载体、赋形剂、稀释剂、稳定剂、缓冲液等。

在一个实施方案中，药物组合物进一步包含糖，例如还原和/或非还原糖。如本文所用，“还原糖”为含有可还原金属离子或与蛋白质中的赖氨酸和其他氨基共价反应的半缩醛基的糖，而“非还原糖”为不具有还原糖的这些性质的糖。在一个实施方案中，还原糖为果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖或其任何组合。在一个实施方案中，非还原糖为蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖或其任何组合。在一个实施方案中，将本发明的药物组合物在还原糖存在下冻干。在一个实施方案中，将本发明的药物组合物在非还原糖存在下冻干。

在实施方案中，本发明的药物组合物具有约180mosm至约350mosm；或约250mosm至约350mosm或约200mosm至约300mosm的渗透压。在某些实施方案中，例如当制备本发明组合物用于冻干时，它可具有高于350mosm的渗透压。在此类情况下，复原溶液可具有超过组合物的体积的体积，以稀释组分并且降低渗透压。另外，当将组合物设计成用于小体积施用时，组合物的渗透压可高于350mosm。

如本文所用，“稳定剂”是指使溶液中的纤溶酶原稳定的试剂。在一个实施方案中，稳定剂包含氨基酸、氨基酸盐、氨基酸类似物或其任何混合物。在另一个实施方案中，氨基酸、氨基酸盐、氨基酸类似物或其混合物为精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、赖氨酸类似物(诸如ε-氨基己酸)或其任何组合。在一个优选实施方案中，所述氨基酸可呈诸如精氨酸盐酸盐及赖氨酸盐酸盐等氨基酸碱的形式。在一个实施方案中，药物组合物包含两种氨基酸、氨基酸盐和/或氨基酸类似物。在另一个实施方案中，药物组合物包含三种氨基酸、氨基酸盐和/或氨基酸类似物。在实施方案中，氨基酸的浓度为约10mm至约300mm、约20mm至约200mm或约10mm至约100mm或约25mm至约75mm或约10mm或约25mm或约50mm或约75mm或约100mm、约150mm、约200mm、约250mm或约300mm。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物进一步包含抗氧化剂。在一个实施方案中，抗氧化剂为甲硫氨酸、氧化型谷胱甘肽(glu-cys-gly)2(613kda)、抗坏血酸、n-乙酰基-l-半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸硫辛酸、硫代硫酸钠、铂、甘氨酸-甘氨酸-组氨酸(三肽)、丁基化羟基甲苯(bht)或其任何组合。在实施方案中，抗氧化剂的浓度为约10mm至约200mm，例如约10mm、约50mm、约100mm、约150mm或约200mm。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物进一步包含抗表面活性剂。如本文所用，“表面活性剂”是指降低液体与固体(当溶解于溶液中时)之间的界面张力的化合物/试剂。在一个实施方案中，表面活性剂为80、20、f-68或35；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188或f-68)；十二烷基硫酸钠(sds)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-磺基甜菜碱、肉豆寇基-磺基甜菜碱、亚油烯基-磺基甜菜碱或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-肌氨酸、肉豆寇基-肌氨酸、亚油烯基-肌氨酸或硬脂基-肌氨酸；亚油烯基-甜菜碱、肉豆寇基-甜菜碱或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-甜菜碱、椰油酰胺丙基-甜菜碱、亚油酰胺丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基-甜菜碱、棕榈酰胺丙基-甜菜碱或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-二甲胺、棕榈酰胺丙基-二甲胺或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基-牛磺酸钠或甲基油烯基-牛磺酸二钠；以及monaquat^tm系列(monaindustries,inc.,paterson,n.j.)、聚乙二醇、聚丙二醇或乙二醇以及丙二醇的共聚物或其任何组合。在一个实施方案中，调节表面活性剂的浓度以减少纤溶酶原、其生物活性变体或片段的聚集并且/或者使组合物中微粒的形成降至最低程度并且/或者减少吸附。在一个实施方案中，表面活性剂以约0.001-1％(w/v)、约0.002％至约0.02％(w/v)或约0.002％至约0.006％(w/v)的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，组合物包含表面活性剂，所述表面活性剂为泊洛沙姆。在一些实施方案中，组合物包含f68。在特定实施方案中，组合物包含约0.01％(w/v)至约1％(w/v)的f68，例如约0.1％(w/v)的f68。在一个实施方案中，组合物大体上不含或不含非离子表面活性剂，例如组合物包含低于约0.02％、0.01％、0.006％或0.004％(w/v)的非离子表面活性剂。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物进一步包含聚合稳定剂。在一个实施方案中，聚合稳定剂为肝素(6至30kda)；聚氨基酸(2至100kda)，诸如聚(glu)、聚(asp)以及聚(glu，phe)；羧甲基纤维素(10-800cp)环糊精；右旋糖酐硫酸盐或其任何组合。在实施方案中，聚合稳定剂的浓度为约0.001％至约0.50％，或约0.001％至约0.25％。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物进一步包含聚乙二醇，例如peg200、peg400、peg1000、peg4000、peg8000、peg10000或其任何组合。在一个实施方案中，聚乙二醇的浓度为约0.5％至约10％(w/w)。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物进一步包含防腐剂。如本文所用，“防腐剂”是指可添加至药物组合物中以使其中的细菌活性基本上降低，由此促进例如多用途药物组合物的制备的化合物/试剂。防腐剂的实例包括间甲酚、苯甲醇、甲醇、乙醇、异丙醇、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、苯酚、甘油、木糖醇、间苯二酚、儿茶酚、2,6-二甲基环己醇、2-甲基-2,4-戊二醇、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、2-氯酚、苄索氯铵、硫柳汞(硫汞撒)、苯甲酸(对羟苯甲酸丙酯)mw180.2、苯甲酸mw122.12、苯扎氯铵、氯丁醇、苯甲酸钠、丙酸钠或氯化十六烷基吡啶。选择与缓冲液和药物组合物的其他组分相容(即溶液透明)的防腐剂。举例来说，当缓冲液为乙酸钠或磷酸钠时，相容防腐剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、甘油、间苯二酚、2-甲基-2,4-戊二醇、硫柳汞(硫汞撒)、苯扎氯铵、苯甲酸钠或氯化十六烷基吡啶。可根据本领域技术人员的判断来确定本发明组合物中所用的防腐剂的浓度。在一些实施方案中，防腐剂的浓度为约0.005至约10％(w/v)、约0.1至约1.0％(w/v)或约0.3至约0.7％(w/v)。在一些实施方案中，防腐剂的浓度为约0.005、0.1、0.3、0.5、0.7或1.0％(w/v)。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物不含防腐剂。

本发明组合物中可包括一种或多种其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，诸如描述于remington'spharmaceuticalsciences第19版,genarro,a.编(1995)中的那些，前提条件是它们不显著不利影响本发明的药物组合物的所需特征。本发明的组合物的其他组成元素可包括水(例如注射用水)、植物油、增稠剂(诸如甲基纤维素)、抗吸附剂、润湿剂、抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)、螯合剂(诸如edta)、金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)、可生物降解聚合物(诸如聚酯)和/或盐形成反离子(诸如钠)等。可接受的载体、赋形剂或稳定剂以使得它们在所使用的剂量和浓度下对受试者无毒的量存在。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物在冻干时具有约3.5％至约8％、优选约3.5％至约6％并且更优选约3.8％至约5.5％的固体总重量。增加本发明的药物组合物中的组分的浓度使得冻干组合物中的总固体百分比增加并且改善冻干组合物的饼状物外观。

在一个实施方案中，纤溶酶原或其变体为lys-纤溶酶原或glu-纤溶酶原。在另一个实施方案中，纤溶酶原或其变体为glu-纤溶酶原。在一个实施方案中，纤溶酶原或其变体由各种类型的纤溶酶原和/或变体组成。优选地，glu-纤溶酶原的含量占纤溶酶原或其变体的总含量的50％以上，或60％以上，或70％以上，或80％以上，或90％以上。

本发明的一个实施方案为包含纤溶酶原或其变体的药物组合物，其中组合物中除纤溶酶原或其变体以外的蛋白质总量小于约10％，小于约5％或小于约2％。本发明的一个实施方案为包含纤溶酶原或其变体的药物组合物，其中组合物不包含或大体上不含另一蛋白质(即除纤溶酶原或其变体之外)。在本发明的一个实施方案中，组合物不包含或大体上不含白蛋白。在本发明的一个实施方案中，组合物不包含或大体上不含抑肽酶。在本发明的一个实施方案中，组合物不包含或大体上不含胰蛋白酶抑制剂。在本发明的一个实施方案中，组合物不包含或大体上不含丝氨酸蛋白酶抑制剂。在本发明的一个实施方案中，组合物不包含或大体上不含纤溶酶。在本发明的一个实施方案中，组合物大体上不含或不含表面活性剂，即表面活性剂的浓度小于0.01mm。

在一个实施方案中，本发明的包含纤溶酶原的药物组合物在室温下稳定至少2小时、24小时、一周或一个月。

在一个实施方案中，本发明的包含纤溶酶原的药物组合物在低于0℃的温度下稳定至少3个月、至少6个月、至少12个月或至少24个月。所述低于0℃的温度为约-20℃、约-30℃、约-60℃、约-70℃或约-80℃。

在实施方案中，包含纤溶酶原的药物组合物为液体组合物、适合于冻干的液体组合物、适合于冷冻的液体组合物、冻干组合物、冷冻组合物或复原组合物。

术语“药物组合物”命名用于药物、医疗或治疗目的的组合物。

本公开具体考虑本文所描述的组分的所有组合(ph、缓冲液、张力调节剂、填充剂、稳定剂等)以及其在本发明的药物组合物中的相应浓度。表1a中呈现了根据本发明的纤溶酶原(pg)的药物组合物的代表性实例。

下表1b中呈现了根据本发明的药物组合物关于具有约0.01mg/ml至约80mg/ml并且优选5至60mg/ml的纤溶酶原或其变体并且具有6.5至8.0的ph值的组合物的其他代表性实例。在所有这些实例中，纤溶酶原的含量优选主要由glu-纤溶酶原组成，并且纤溶酶原或变体的总含量为5mg/ml至60mg/ml。

在一个实施方案中，本发明的包含纤溶酶原的药物组合物适合用于经静脉内、皮下、局部、真皮内、眼部和/或肌肉内施用。

根据一个实施方案，本发明的药物组合物用于在人类受试者中施用。优选地，本发明的药物组合物用于经静脉内、皮下、局部、肌肉内或眼部施用。在一个实施方案中，本发明的组合物呈液体、凝胶、乳膏或软膏形式。

可从若干来源获得配制于本发明的组合物中的纤溶酶原。它可通过重组合成来获得，或从血液、血浆或血液衍生的溶液萃取/纯化。可通过科恩分级分离或通过沉淀从血液或血浆萃取纤溶酶原。可通过结合亲和色谱(诸如wo2006/120423中所描述的方法)从血浆或血液衍生的溶液纯化纤溶酶原。纤溶酶原的变体包括但不限于对氨基酸序列的任何修饰或向其添加任何基团或向其添加任何氨基酸或氨基酸序列。纤溶酶原的片段包括但不限于其氨基酸或氨基酸序列的任何缺失。

如本文所用，术语“约”旨在覆盖对应值+或-10％。

术语“受试者”包括可受益于纤溶酶原、其变体或其片段的施用的活有机体。术语“受试者”包括诸如哺乳动物或鸟的动物。优选地，受试者为哺乳动物。更优选地，受试者为人类。最优选地，受试者为需要治疗的人类患者。

如本文所用，“预防(preventing/prevention)”旨在指至少降低获得疾病或病症的风险的可能性(或对疾病或病症的敏感性)(即使得在可能暴露于或倾向于患所述疾病但尚末经历或展现所述疾病的症状的患者中所述疾病的临床症状中的至少一者不发生)。本文中提供了用于识别此类患者的生物和生理参数且其还为医师熟知的。

术语“治疗(treatment/treating)”受试者包括向受试者应用或施用本发明的组合物(或向受试者的组织或器官应用或施用本发明的组合物)，目的为延迟、稳定、治愈、愈合、缓解、减轻、改变、得到补救、更少恶化、改善、改进或影响疾病或病状、疾病或病状的症状或疾病或病状的风险(或对疾病或病状的敏感性)。术语“治疗”是指在治疗或改善外伤、病变或病状时成功的任何指示，包括任何客观或主观参数，诸如消除；缓解；恶化速率减小；疾病严重性减轻；症状稳定、削弱或使得损伤、使受试者更能耐受病变或病状；退变或衰退速率减慢；使得退变终点衰弱程度更低；或改进受试者的身体或心理健康。在一些实施方案中，术语“治疗”可包括增加受试者的预期寿命和/或延迟对其他治疗的需要。

如本文所用，术语“治疗有效量”意味在向受试者施用化合物以治疗或预防特定病症、疾病或病状时足以实现对病症、疾病或病状的此类治疗或预防作用的量。如本文所用，术语“治疗有效量”进一步意味在受试者中纤溶酶原、其变体或其片段有效愈合伤口、愈合鼓膜穿孔、愈合牙周伤口、治疗传染性疾病、提高或维持口腔健康、治疗玻璃体后脱离(pvd)、糖尿病性溃疡和纤溶酶原缺陷型受试者溶栓适应症(诸如冠状动脉血栓形成)、治疗组织的再灌注损伤、治疗缺血、梗塞、脑水肿、用于改善微循环、治疗纤溶酶原缺陷型受试者以及调节补体途径的量。剂量和治疗有效量可例如视包括以下的多种因素而不同：的活性受试者的年龄、体重、总体健康、性别以及膳食；施用次数、施用途径、排泄速率以及任何药物组合(如果适用)、从业者希望化合物对受试者具有的作用以及受试者罹患的特定病症。此外，治疗有效量可取决于受试者的血液参数(例如脂质型态、胰岛素水平、血糖)、疾病状态的严重性、器官功能或基础疾病或并发症。此类适当剂量可使用包括本文所描述的分析的任何可获得的分析来确定。当向人类施用本发明的药物组合物时，医师可例如首先开出相对低剂量，随后增加剂量直至获得适当反应。所要施用的剂量将最终由医师决定。

试剂盒

可将本发明的化合物作为任选包括容器(例如包装、盒子、小瓶等)的试剂盒的一部分加以包装。可在商业上根据本文所描述的方法使用试剂盒并且其可包括关于在本发明的方法中使用的说明。

可能或可能不与另一活性成分同时、在其之前或之后并且通过相同施用途径或通过另一施用途径向患者施用本发明的组合物。因此，本发明还涵盖试剂盒，当执业医师使用所述试剂盒时可使向患者单独或与另一活性成分组合施用适当量的本发明组合物简化。

本发明的试剂盒可进一步包含用于冻干组合物的复原的药学上可接受的液体。举例来说，如果以在肠胃外施用时必须加以复原的固体形式提供活性成分，那么试剂盒可包含密封可溶解活性成分以形成适合用于肠胃外施用的不含微粒的无菌溶液的适合的药学上可接受的液体的容器。

在某些实施方案中，本发明组合物含于用于单次或多次施用的小瓶、瓶子、管子、注射器或其他容器中。此类容器可例如由玻璃或诸如以下的聚合物材料制成：聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯或聚烯烃。在一些实施方案中，容器可包括密封件，或其他闭合系统，诸如针可穿透的橡胶塞，以抽出单次剂量并且然后在将针移除后再密封。目前所公开的组合物和方法中预期使用所有此类用于可注射液体、冻干组合物、复原冻干组合物或本领域中已知用于复原和注射的粉末的容器。在一个特定实施方案中，容器为包含单次剂量或多次剂量的笔型传送设备。此类笔型递送设备可为永久性的，例如容纳含有单次剂量或多次剂量的一次性药筒的永久性笔，或者整个设备可为一次性的，例如含有单次剂量或多次剂量的一次性笔。在某些实施方案中，其中笔型递送设备包含多次剂量，剂量可为预置的，即，固定的。在其他实施方案中，剂量可为灵活剂量，即，由用户拨入。在一些实施方案中，笔型递送设备包含鲁尔锁(luer-lock)、鲁尔锥(luer-cone)或促进连接一次性针头的其他针头配合连接件。在其他实施方案中，笔型递送设备包含押针(stakedneedle)，即永久性针头。在另一个特定实施方案中，容器为注射器。在一些实施方案中，注射器包含鲁尔锁、鲁尔锥或促进连接一次性针头的其他针头配合连接件。在其他实施方案中，注射器包含押针，即永久性针头。在一些实施方案中，用单次剂量或多次剂量预装填注射器。

稳定性分析

“稳定”组合物包括如下组合物，在所述组合物中在储存后其中的蛋白质(纤溶酶原或其变体)基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术为本领域中可获得的并且在例如lee,v.,1991,peptideandproteindrugdelivery,247-301(marceldekker,inc.,newyork,n.y.)以及jones,a.1993,adv.drugdeliveryrev.10:29-90中进行了综述。可在所选温度下在所选时间段内测量稳定性。在一个实施方案中，组合物在室温(约25℃)下或在40℃下稳定至少1、2、3、4、5或6个月以及/或者在约2-8℃下稳定至少1、2、3、4、5或6个月。此外，在某些实施方案中，组合物在冷冻(例如-30℃)后稳定。在某些实施方案中，稳定性准则如下：(1)通过目视分析组合物保留透明；(2)组合物的浓度、ph值以及渗透压改变不超过约±10％；(3)如通过sec-hplc所测量，不超过约10％、不超过约5％或不超过约1％的聚集物形成；以及(4)如通过本领域中已知并且沿用已久的分析法所测量，不超过10％、不超过约5％或不超过3％的纤溶酶原分解。

热变性：可使用来自pall的optim2^tm；或用于监测蛋白质的去折叠的其他替代生物物理学技术(标准pcr(具有加热块)、荧光计或cd分光光度计(具有温度控制件)来进行针对纤溶酶原或其变体或其片段对hts制剂进行筛选的热变性实验。作为实例，optim2系统同时测量一系列蛋白质稳定性指示参数，包括去折叠转变温度(tm)、聚集发生温度(tagg)以及聚集速率。

赋形剂对热稳定性的影响：在更高熔融温度(tm)和聚集发生温度(tagg)情况下在最佳ph值范围内确定窄ph值。如果在6.5-7.5的生理范围内获得更高tm；那么接下来的测试为使用至少3种缓冲系统进行筛检。

另外，可测试ief(等电聚焦)或cief(毛细管等电聚焦)以评估溶液中纤溶酶原的物理构象。

稳定化百分比基于在60℃下孵育1-8小时之后针对各缓冲液/赋形剂并且针对仅含有纤溶酶原的参比溶液的纤溶酶原酶活性测量。在另一测试中，可在37℃下在1-8小时内评估稳定化。如下计算稳定化的百分比：

稳定化的百分比＝100x[s-t]/[t]

其中s为在35℃下10天之后所要测试的含赋形剂的酶溶液的残余酶活性；并且t为在相同条件下储存的在不存在任何赋形剂情况下的参考物的活性。

聚集和粒子测量计数(pmc)：通过光线遮蔽粒子计数测试(lightobscurationparticlecounttest)来计算pmc。分析员应使用适合的仪器，所述仪器是基于光阻断原理并且允许自动测定粒度和粒子数目。所选传感器必须适合于预期粒度范围和预期粒子计数。标准粒度范围通常在2与100mm之间。分析员应使用分散于适当体积的不含粒子的水中的usp粒子计数rs验证设备的性能。必须小心操作以避免在校准过程中在分散期间发生粒子聚结。

方法：将产物样品以最适当代表递送(例如排出的注射器内容物)的方式进行测试。对于具有足够的体积(即体积大到足以促进测试)的肠胃外物质，测试单个单元往往有助于判断。对于不具有足够的体积的肠胃外产物，小心并且彻底地混合各单元，然后将适当数目的单元的内容物在单独的容器中组合以获得为单一测试所需的体积(通常为0.2-5.0ml)。如果进行稀释，那么确保空白容器对于产物和稀释剂来说具有足够的体积并且在所述过程中引进极少(如果有的话)粒子。小心打开各单元，移除密封闭合件，并且在取样、稀释或(必要时)汇集之前避免污染内容物。当指定产物溶剂时，例如对于用于肠胃外用途的冻干固体或粉末，必须用适当量的指定溶剂进行复原或稀释。在这种情况下，可测试溶剂本身以确保它不为显著粒子来源。不允许从总计数中扣除溶剂粒子计数。消除气泡为关键步骤，尤其对于容易夹带气体的蛋白质产物来说。建议使用两种方法：要么允许产物流忍受环境压力，要么施加温和(例如75托(torr))真空。当被证实适合时，还可使用其他方法。应避免超声处理。在样品已脱气后，必须通过适当手段(例如用手缓慢搅动容器)轻轻地但充分地混合样品的内容物来将其轻轻地再混合以悬浮所有粒子。任何时候都不建议将混合产物流倒置。在混合之后，立即抽出不少于四个等分试样，各自的体积适合于仪器的容量(通常0.2-5.0ml)。计算所选尺寸范围内的粒子的数目，包括等于或大于10和25mm的粒子。不管第一等分试样所获得的结果，并且计算正在测试的制剂的剩余等分试样在各尺寸范围内的平均粒子数目。皮体积还可适用于对照取样，其应代表传感器动态范围和针头体积。

评估：像fda(食品和药物管理局)等管理机构以及usp/ep/jp(美国药典)章节(787、788以及789)、ep欧洲药典(2.9.20particulatecontamination)以及jp日本药典jp(16:6.06.6.07foreigninsolublemattertest)对微粒物质的要求如下规定了供人类使用的液体制剂中可接受的粒子水平。对于作为供应于标称含量小于或等于100ml的容器中的用于输注或注射的治疗性蛋白质注射剂的肠胃外产品：存在于所测试单元中的平均粒子数目不应超过每个容器6000个等于或大于10μm，并且不应超过每个容器600个等于或大于25μm。对于供应于标称含量超过100ml的容器中的治疗性蛋白质注射剂，以及标称含量超过100ml的肠胃外输注制剂或注射剂：存在于所测试单元中的平均粒子数目不应超过每毫升25个等于或大于10μm，并且不应超过每毫升3个等于或大于25μm。另外，总粒子负荷不应超过每个容器6000个等于或大于10μm，并且不应超过每个容器600个等于或大于25μm。在施用期间在最终过滤器(串联)情况下使用的产品免于受这些要求限制，条件是可获得科学数据证明免于受限制。然而，期望滤液符合所述准则。对于所供应或首先于<100ml中复原并且然后于>100ml的体积中稀释以用于输注的产品，应在稀释之前与之后均评估粒子含量并且基于其最终体积进行评估。因此，在此文件中在本文中包括usp/ep/jp方法。因此，术语“粒子”是指“微粒”并且反之亦然；这些术语可互换使用。

使用optim-2^tm在476nm/600nm下通过光散射或通过标准uv分光光度计在uv下在350nm下测量的动力学研究：选择诸如高温(65℃)和酸性溶液ph值(4.5)或碱性溶液ph值(9.5)的加速条件以更快速地筛选不同稳定化赋形剂。组合物的组分被评估为在1至4小时内在固定温度(55-60℃)下随时间变化增加tagg。在55-60℃下在长达4h内测量纤溶酶原溶液的聚集动力学性质，装备有温度控制件(测定发生tm)。针对赋形剂对如通过光散射在267nm、467nm或350nm下所测量的纤溶酶原聚集的抑制的影响对赋形剂进行筛选(cheng,w.等人“comparisonofhigh-throughputbiophysicalmethodstoidentifystabilizingexcipientsforamodeligg2monoclonalantibody:conformationalstabilityandkineticaggregationmeasurements”journalofpharmaceuticalsciences,第101卷,第5期,第1701-1720页,2012)。

蛋白质浓度对热稳定性的影响：optim-2^tm或双重扫描荧光计(dsf，使用sypro染料)的优点之一为在高度浓缩的蛋白质溶液中进行tm和tagg测量的能力。无论是研究潜在候选物的相对稳定性还是针对蛋白质稳定化对不同配制条件进行筛选，在可获得的表征方法的数量有限的情况下，识别在高浓度下蛋白质溶液的性质均可能为重要的。

制剂组成对最终渗透压的影响：在最终药物组合物中，缓冲液、赋形剂以及盐浓度归因于亲本注射剂的实际限制而优选不非常高。替代地，为获得在240至400mosm范围内的渗透压，更适度的浓度(诸如更生理)为优选的。因此，计算渗透压以在最初确定此范围；然而，对于静脉注射，如果在复原之后将纤溶酶原或其变体或片段用用于复原的溶液稀释，那么在开发冷冻干燥方法期间还可使用更高渗透压浓度。

应注意，术语“制剂”和“组合物”在本文中可替换使用，并且旨在命名相同对象。

本文中包括标题供参考并且用于帮助定位某些部分。这些标题不旨在限制其中所描述概念的范围，并且这些概念可在整个说明书通篇中的其他部分中具适用性。因此，本发明不旨在限于本文所示的实施方案，而是与符合本文所公开的原理和新颖特征的最宽范围相一致。

除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括相应复数参考物。

除非另外指出，否则本说明书和权利要求中所用的所有表示成分的量、反应条件、浓度、性质等的数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。最低限度地，各数值参数至少应根据具有所报导有效数字的数字并且通过应用一般舍入技术来理解。因此，除非指示为相反，否则本说明书和所附权利要求中所阐述的数值参数为近似值，所述近似值可视设法获得的性质而变化。尽管阐述实施方案的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但特定实例中所阐述的数值为尽可能精确报导的。然而，任何数值固有地含有因实验、测试测量、统计分析以及此类因素的变化而产生的某些误差。

应了解，本文所描述的实例和实施方案仅用于说明性目的，并且将向本领域技术人员建议对其作出的各种修改或变化，并且它们应包括在本发明和随附权利要求的范围内。

实施例

以下实施例进一步说明对本发明的实践，但不旨在限制本发明。

实施例1：冷冻制剂中的纤溶酶原的稳定性

包含根据wo2006/120423中所描述的结合亲和力技术从血浆萃取的5mg/ml人类纤溶酶原、10mm柠檬酸盐、150mmnacl的在ph6.5下的药物组合物(批号：2002.pc02_pg140210.01)的稳定性测试结果是在-20℃、-30℃以及-80℃下储存长达6个月。稳定性数据表明纤溶酶原在这些冷冻条件下稳定。在-20℃、-30℃以及-80℃下测试纤溶酶原批号：2002.pc02_pg140210.01。通过sec-hplc研究聚集水平，在还原和非还原条件下通过sds-page研究纯度水平，通过bcs活性研究活性水平，并且通过在280nm下的吸光度(abs280)研究蛋白质浓度。6个月之后的稳定性数据的结果证实所有稳定性指示分析均实现所需规格。

实施例2：渗透压分析和总固体百分比分析

表2中报导了制剂1至6的渗透压和制剂1-9在冻干之后的总固体百分比。表1a中规定了制剂1-9的内容物。

表2

渗透压在240-400mosm的生理范围内。所测试组合物的所得渗透压有利地属于或非常接近于生理范围的渗透压。对于所有组合物和安慰剂来说，总固体饼状物百分比(每100ml冻干前液体组合物在冻干之后的固体组合物的克数)为约4％，这在3.5至8％的优选范围内。

实施例3：纤溶酶原的分子量

纯化过并且配制于本发明的药物组合物中的纤溶酶原的分子量具有87,000(mw)的分子量，这是通过计算纤溶酶原的一级氨基酸序列来确定并且通过质谱法加以验证。

实施例4：冻干之后的饼状物的外观研究

已遵循表5中详述的循环过程将制剂1至5冻干。表1a中规定了制剂1-5的内容物。

表5

图2至11为分别含有12.5ml制剂1至5或其相应安慰剂(在不存在纤溶酶原的情况下)的小瓶的图片。因此，已研究了纤溶酶原的存在对组合物稳定性的影响。对已通过冻干过程形成的饼状物的外观的物理检查。所有饼状物均一直维持均匀密度，没有任何变色。制剂2、3以及5的安慰剂的测试小瓶的小于10％已提供熔融回缩。制剂1的安慰剂的测试小瓶的小于10％已崩溃。制剂1-5的安慰剂以及制剂4的安慰剂的测试小瓶的小于10％已显示底部收缩。饼状物的外观总体令人满意。

组合物的内容物指示崩溃温度。各纯无定形赋形剂具有特征tg’和崩溃温度；制剂的崩溃温度为无定形相中所有组合物的质量平均温度。设计一种具有最高崩溃温度的制剂是重要的，因为在冻干期间干燥速率与样品温度成正比。

最后，如果盐(nacl)和赋形剂未最大限度地结晶，那么崩溃温度将降低。举例来说，甘氨酸具有-45℃的tg’，并且其对无定形相的贡献可使崩溃温度降至低得不适当的值。

实施例5：氨基酸对溶液中的纤溶酶原聚集的影响

单独纤溶酶原于水中产生fda不可接受的大量纤溶酶原聚集物，即10μm或更大者高于每100ml组合物6000个粒子(参见表6中的样品f0406)。已研制出各种基于蔗糖的制剂来配制纤溶酶原。虽然这些制剂大多数继续达到每100ml6000个10μm或更大的粒子的阈值，但已研制出含有更低粒子含量的制剂并且本文中研究了氨基酸稳定纤溶酶原的作用。这些其他制剂含有10mg的纤溶酶原和35mmnacl，并且已测试三种缓冲液/ph值，即10mm柠檬酸钠(ph6.5)、10mm磷酸钠(ph7.2)以及10mmtrishcl(ph8.0)。已比较存在与不存在0.5％浓度的选自精氨酸、丙氨酸以及甘氨酸的氨基酸的情况。所测试制剂为新鲜的，即在冻干之前。表6报导了10μm或更大以及25μm或更大的粒子的pmc计数。氨基酸的存在已证实稳定作用有助于降低聚集水平。

表6

实施例6：甘露糖醇与氨基酸组合对纤溶酶原聚集的影响

已测试在存在和不存在氨基酸(0.5％精氨酸盐酸盐、丙氨酸或甘氨酸)的情况下，填充剂(0.5％甘露糖醇)的存在对含有10mg纤溶酶原和35mmnacl加上10mm柠檬酸钠(ph6.5)、10mm磷酸钠(ph7.2)或10mmtrishcl(ph8.0)的制剂并且在表7中进行了报导。在此研究中测试新鲜制剂(冻干之前)。一般来说，甘露糖醇的存在使粒子计数降低。一般来说，甘露糖醇与氨基酸的组合有助于降低粒子计数，并且尤其在精氨酸与甘露糖醇组合的情况下。

表7

实施例7：防腐剂对纤溶酶原聚集的影响

已在含有9或10mg纤溶酶原和35mmnacl加上10mm柠檬酸钠(ph6.5)、10mm磷酸钠(ph7.2)或10mmtrishcl(ph8.0)加上0.5％精氨酸盐酸盐或0.5％精氨酸盐酸盐与0.5％甘露糖醇的组合的制剂中测试了防腐剂(诸如0.1％苯酚)的存在。在此研究中测试新鲜制剂(冻干之前)。表8中已报导了粒子物质计数(pmc)。有利地，苯酚的存在未显著影响粒子计数。

表8

比较了若干防腐剂。表9报导了对在含有10mg纤溶酶原和35mmnacl加上10mm柠檬酸钠(ph6.5)、10mm磷酸钠(ph7.2)或10mmtrishcl(ph8.0)以及0.5％精氨酸盐酸盐的制剂内的0.5％cmc、0.1％苯酚以及0.5％右旋糖酐的比较。在此研究中测试新鲜制剂(冻干之前)。右旋糖酐或苯酚的存在未显著影响聚集。然而，cmc使聚集显著增加。这不令人惊讶，因为已知cmc增加溶液的粘度并且经常用于制备滴眼剂制剂。

表9

实施例8：氨基酸和其浓度对纤溶酶原聚集的影响

在纤溶酶原10mg/ml、35mmnacl、10mm磷酸钠(napi)(ph7.2)的制剂中在冻干和复原之后测试了0.5％和1％的精氨酸。表10中报导了粒子计数(pmc)，表10表明两种浓度的精氨酸用于维持低pmc值非常好。

表10

在纤溶酶原10mg/ml、35mmnacl、10mm磷酸钠(napi)(ph值7.2)的制剂中在冻干和复原之后，对1％的精氨酸、甘氨酸以及丙氨酸进行了比较。表11中报导了粒子计数(pmc)，表11表明精氨酸在测试条件下用于维持低pmc值优于丙氨酸和甘氨酸，不过所有这三种氨基酸均提供可接受的pmc值，即每100ml不到6000个等于或大于10μm的粒子。

表11

实施例9：总固体百分比和渗透压

表12中报导了10mg/ml纤溶酶原的若干制剂的渗透压以及用于制备所述制剂的固体物质的百分比。表13中报导了20mg/ml纤溶酶原的若干制剂的渗透压以及用于制备所述制剂的固体物质的百分比。所测试制剂的所得渗透压有利地属于或非常接近于生理范围的渗透压。总固体物质百分比是由纤溶酶原、其中的张力调节剂以及填充剂的含量来计算，并且为冻干之后所得饼状物的尺寸的良好指示。

表12

表13

实施例10：粒子计数(pmc)

表14中报导了表12中所描述的制剂的关于等于或大于10μm的粒子的粒子计数(pmc)；并且表15中报导了表13中所描述的制剂的关于等于或大于10μm的粒子的粒子计数(pmc)。

表14

表15

图12、13以及14中示出了分别含有制剂f0498、f0449以及f0459的小瓶的图片，作为表12-15中报导的冻干制剂的外观的代表性实例。

实施例10：可逆纤溶酶原聚集

如由此研究所证实，纤溶酶原聚集为可逆的。将在dh2o中渗析并且严重沉淀的冷冻纤溶酶原样品(pg原液)5mg/ml解冻，经由1.2μm注射器过滤器过滤，并且用作对照(pg对照对照)的起始物质。将2mlpg对照的等分试样添加至玻璃小瓶中，分别预先外加1m柠檬酸钠ph6.5(样品1)、0.5m磷酸钠ph7.2(样品2)或1mtris-hclph8.0(样品3)缓冲储备液以在各ph值下获得最终10mm缓冲液浓度。图15中示出了样品1、2以及3，其中未外加pg对照为样品0。样品1、2以及3进一步外加5mnacl和0.8m精氨酸的储备溶液，以在各样品中获得35mmnacl和28.5mm(0.5％)arg的最终浓度并且在图16中示出。在图15和16中分别使用0.02、20、100、800ntu的浊度标准液作为参考。由图15可注意到ph值调节已溶解大量聚集物。在图16中，通过添加精氨酸和nacl使得样品1、2以及3透明，并且视觉不可检测到聚集物。

使用标准校正使用图15和16中所示的浊度参考标准液通过读出550nm下的光密度(od)来测量图16的样品0、1、2以及3的浊度。在表16中以比浊法浊度单位(nephelometricturbidityunit，ntu)报导了浊度。在对样品1、2以及3外加缓冲液、nacl以及精氨酸之前(t＝0)和之后在0.1小时、17小时、21小时以及24小时时测量1ml各样品的等分试样。解聚作用为快速的，因为它仅可在外加之后0.1小时时被注意到，并且它维持历时24小时。

表16

实施例11：氨基酸随时间推移对组合物浊度的影响

已在含有10mg纤溶酶原和35mmnacl加上0.5％甘氨酸、精氨酸、丙氨酸而不含氨基酸的组合物中在ph6.5下在柠檬酸钠缓冲液中(图17)、在ph7.2下在磷酸钠缓冲液中(图18)以及在ph8.0下在tris缓冲液中(图19)对浊度进行了测量。

在存在0.5％甘露糖醇作为填充剂的情况下重新制备图17、18以及19中所测试的组合物，并且分别在图20、21以及22中进行报导。

在所有情况下，氨基酸的存在提供稳定化作用并且维持或降低浊度。比较氨基酸的类型，精氨酸显示最佳稳定化作用并且在所有所测试的ph值下并且在存在和不存在填充剂(即0.5％甘露糖醇)的情况下均降低浊度。

实施例12：具有升高浓度的纤溶酶原的组合物

已研究了含有高浓度的纤溶酶原的组合物。对于在存在及不存在1％精氨酸的情况下，20mg/ml纤溶酶原于10mm或100mm柠檬酸钠、35mmnacl(ph6.5)中的组合物，以及在存在1％精氨酸的情况下，37和56mg/ml纤溶酶原于100mm柠檬酸钠、35mmnacl(ph6.5)中的组合物，表17中已报导了10μm或更大以及25μm或更大的粒子的pmc计数。

表17表明本发明的制剂有利地允许制备包含升高浓度的纤溶酶原(37和56mg/ml)的组合物而不会引起不可接受的粒子水平。

表17

实施例13：纤溶酶原活性

对本文所例示的各制剂的纤溶酶原活性进行测试并且与初始制剂或原液制剂(pg原液)的纤溶酶原活性相比较。已注意到纤溶酶原活性不受这些制剂中任一者的影响。

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