慢性伤口治疗用组合物、其制备方法和利用其的慢性伤口治疗用敷料与流程

本发明涉及由可加载有多重生长因子的聚合物复合材料制成的慢性伤口治疗用组合物、其制备方法和利用其的慢性伤口治疗用敷料，更详细地涉及在作为复杂疾病的慢性伤口中相比单个生长因子可以提高治疗效果的慢性伤口治疗用组合物、其制备方法和利用其的慢性伤口治疗用敷料。
背景技术：
：随着向老龄化社会的转换、医疗技术的发展，预期寿命的延长和生活习惯等的改变，高血压、糖尿疾病等慢性疾病的发病率在世界范围内呈现增长趋势。据了解，由慢性疾病引起的伤口的恢复速度比急性伤口慢且不能很好地愈合。由于在褥疮、慢性溃疡(下肢溃疡，糖尿病足溃疡)等的慢性伤口中生长因子的表达常常减少，因此很长时间以来提出生长因子被用来诱导慢性伤口的愈合的假设并进行了许多研究，其中一些研究已经被商品化并用于临床。另外，市场上销售含有表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)和成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,fgf)作为成分的产品，但这些生长因子产品的价格昂贵，由于需要冷冻保存而使用不便，且具有在将冷冻产品解冻并使用时其生物活性降低的缺点。另外，由于在向伤口施用生长因子产品后进一步使用敷料时大部分生长因子被伤口敷料吸收，因此具有效果降低的问题。为了提高该生长因子的效果，在日本授权专利第3761816号中公开了通过使用聚乙烯醇水凝胶来稳定表皮生长因子而提高持久性的方法。然而，由于上述方法需要在水溶液状态下保管生长因子，因此活性降低的可能性高而难以大幅提高稳定性。此外，美国专利公开第2013-054300号中公开了使成纤维细胞生长因子和羧基多糖形成共价键的方法，且在美国专利公开第2014-0335045号中公开了在仿肝素聚合物(heparinmimickingpolymer)上形成与碱性成纤维细胞生长因子的共价键以提高生长因子的稳定性的方法。然而，上述专利仅限于和单个生长因子的键合，因此难以治疗需要多重生长因子的慢性伤口等复杂疾病。技术实现要素：技术问题为了解决上述现有技术的问题，本发明的目的在于提供通过稳定地结合有多重生长因子而能够更有效地应用于慢性伤口的慢性伤口治疗用组合物及其制备方法。此外，本发明的目的在于提供利用所述组合物的慢性伤口治疗用敷料。本发明的上述目的和其他目的可以通过下面描述的内容来实现。技术方案为了实现上述目的，本发明提供慢性伤口治疗用组合物及其制备方法，其中，所述慢性伤口治疗用组合物包含多重生长因子作为有效成分且包含阴离子聚合物、阳离子聚合物和交联剂。此外，本发明提供利用所述组合物的慢性伤口治疗用敷料。有益效果本发明具有如下效果：提供具有在伤口部位连续7天以上不容易降解的效果且具有适合于体外细胞培养和移植后组织再生的性质的慢性伤口治疗用组合物、其制备方法和利用其的慢性伤口治疗用敷料。附图说明图1是示出在实施例1至实施例3以及比较例1中所制备的加载有多重生长因子的交联基质的生物降解性评估结果的图表。图2是示出在实施例1至实施例3以及比较例1、4、5和6中所制备的加载有多重生长因子的交联基质中包含的生长因子的体外释放行为的测量结果的图表。图3是示出在实施例3以及比较例1至6中所制备的加载有多重生长因子的交联基质的慢性伤口治愈性能的评估结果的图表。具体实施方式以下，详细说明本发明。本发明的慢性伤口治疗用组合物、其制备方法和利用其的慢性伤口治疗用敷料的特征在于包含多重生长因子作为有效成分且包含阴离子聚合物、阳离子聚合物和交联剂。由于生长因子随着20多种氨基酸的种类和排列而具有不同的等电点(isoelectricpoint，pi)(在等电点状态下，正电荷和负电荷相等)，因此在中性溶液中根据等电点，每种生长因子具有不同的电荷。例如，egf的pi值为约4.5至6，从而在ph值为7的溶液中具有负电荷，fgf的pi值为约9至11，从而在ph值为7的溶液中具有正电荷。具有负电荷的生长因子形成coo-基团(-coo-)而与具有nh3+基团(-nh3+)的阳离子聚合物进行离子键合，具有正电荷的生长因子形成nh3+基团而与形成coo-基团的聚合物进行离子键合。作为一例，所述阴离子聚合物可以为选自由透明质酸(hyaluronicacid)、羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)、果胶(pectin)、角叉菜胶(carragreenan)、褐藻酸(alginate)、硫酸软骨素(chondroitinsulfate)、硫酸葡聚糖(dextransulfate)、角叉菜胶(carrageenan)、聚丙烯酸酯(polyarylate)、聚甲基丙烯酸(polymethacrylicacid)、聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate)、聚丙烯酸(polyacrylicacid)、聚磺酸(polysulfonicacid)、聚磷酸(polyphosphoricacid)及它们的盐化合物所构成的组中的一者以上，优选地，所述阴离子聚合物可以为透明质酸、褐藻酸或它们的混合物。作为一例，所述阴离子聚合物的重均分子量为10000至5000000g/mol、50000至4500000g/mol或100000至4000000g/mol，在该范围内具有借助交联剂的交联效果。所述阴离子聚合物的含量可以是39.8至98.9重量％、44.6至94.0重量％或49.4至89.0重量％，在该范围内具有能够均匀地形成基质表面的效果。作为一例，所述阳离子聚合物可以为选自由胶原蛋白(collagen)、明胶(gelatin)、几丁质(chitin)、壳聚糖(chitosan)、纤维蛋白(fibrin)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)、聚乙烯亚胺衍生物、聚丙烯亚胺(polypropyleneimine)、聚丙烯亚胺衍生物、聚赖氨酸(polylysine)、鱼精蛋白(protamine)、聚酰胺胺(polyamideamine)、聚凝胺(polybrene)及它们的盐化合物所构成的组中的一者以上，优选地，所述阳离子聚合物为胶原蛋白、壳聚糖或其混合物。作为一例，所述阳离子聚合物的重均分子量为1000至500000g/mol、5000至450000g/mol或10000至400000g/mol，在该范围内具有借助交联剂的交联效果。所述阳离子聚合物的含量可以是0.9至59.9重量％、4.9至54.9重量％或9.9至49.0重量％，在该范围内具有增加细胞生长的效果。作为一例，所述阴离子聚合物和所述阳离子聚合物的重量比为50～95:50～5、60～90:40～10或65～85:35～15，在该范围内具有由阴离子聚合物和阳离子聚合物构成的支架的物理强度优异而适于用作敷料且易于处理的效果。所述阴离子聚合物、所述阳离子聚合物和交联剂为交联支架即交联基质，在该情况下，具有稳定性优异且有利于治疗复杂疾病的效果。所述阴离子聚合物和所述阳离子聚合物借助所述交联剂进行交联，从而大幅提高体内稳定性。向所述阴离子聚合物和所述阳离子聚合物的混合溶液中混合交联剂，然后放入一定尺寸的模具中并进行冷冻干燥，然后经由洗涤过程而制备交联基质，或者制备由阴离子聚合物和阳离子聚合物构成的支架，然后浸入交联剂溶液中并进行交联，然后经由洗涤过程而制备交联基质。作为一例，所述交联剂为选自由乙二醇二缩水甘油醚(ethylenediglycidiylether，egdge)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butandioldiglycidylether，bdde)；1,6-己二醇二缩水甘油醚(1,6-hexandioldiglycidylether)、丙二醇二缩水甘油醚(propyleneglycoldiglycidylether)、聚丙二醇二缩水甘油醚(polypropylemeglycoldiglycidylether)、双甘油聚缩水甘油醚(diglycerolpolyglycidylether)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，edc)和六甲撑二异氰酸酯(hexamethylenedisocyanate，hmdi)所构成的组中的一者以上。所述交联剂的含量可以是0.099至40.93重量％、0.496至37.49重量％或0.98至33.33重量％，在该范围内具有可以吸收体液而不溶于体液从而吸收伤口中产生的渗出物的效果。术语“多重生长因子”指的是两种以上的生长因子。作为一例，所述多重生长因子包括选自由表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，fgf)、转化生长因子(transforminggrowthfactor，tgf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)、集落刺激因子(colonystimulatingfactor，csf)和血小板衍化生长因子(plateletderivedgrowthfactor，pdgf)所构成的组中的两者以上，优选地，所述多重生长因子为egf和fgf，在该情况下，对伤口部位有持续效果且对体外细胞培养和移植后组织再生具有优异的效果。所述多重生长因子的含量可以是0.00058至0.175重量％、0.003至0.156重量％或0.006至0.133重量％，在该范围内具有优异的慢性伤口治疗效果。作为一例，所述多重生长因子中的两种生长因子的混合比为1～9:9～1、2～8:8～2或3～7:7～3，在该范围内具有优异的慢性伤口治疗效果。加载有所述多重生长因子、尤其是egf和fgf的交联基质具有保持水化状态以使生长因子能够持续作用于伤口部位且在伤口部位存在7天以上的效果。所述慢性伤口治疗用组合物还可以包含选自由稳定剂、赋形剂、等渗剂、保湿剂、ph调节剂、抗氧化剂、抗菌剂和抗炎剂所构成的组中的一者以上。本发明的慢性伤口治疗用组合物可以用作敷料。本发明的制备慢性伤口治疗用组合物的方法包括如下步骤：向蒸馏水中添加酸成分以将ph调整为3.0至5.0，然后添加阳离子聚合物以制备混合溶液i；向所述混合溶液i中添加碱成分以将ph调整为6.0至8.0，然后添加阴离子聚合物以制备混合溶液ii；通过向所述混合溶液ii中混合交联剂而进行交联以制备交联基质；以及向所述交联基质中添加多重生长因子并进行冷冻，然后经过冷冻干燥而制备加载有生长因子的交联基质。作为一例，所述多重生长因子包括选自由表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，fgf)、转化生长因子(transforminggrowthfactor，tgf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)、集落刺激因子(colonystimulatingfactor，csf)和血小板衍化生长因子(plateletderivedgrowthfactor，pdgf)所构成的组中的两者以上，优选地，所述多重生长因子为egf和fgf，在该情况下，对伤口部位有持续效果且对体外细胞培养和移植后组织再生具有优异的效果。在制备所述混合溶液i的步骤中在混合阳离子聚合物后使用均质器进行均质化，且在制备所述混合溶液ii的步骤中在混合阴离子聚合物后使用均质器进行均质化。所述酸成分可以为选自由盐酸、硫酸、磷酸和硝酸所构成的组中的一者以上。所述碱成分可以为选自由氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾和氢氧化铵所构成的组中的一者以上。作为一例，所包含的所述阴离子聚合物的浓度为4至10mg/g、4.5至9.5mg/g或5至9mg/g，在该范围内具有均匀地形成基质表面的效果。作为一例，所包含的所述阳离子聚合物的浓度为0.1至6mg/g、0.5至5.5mg/g或1至5mg/g，在该范围内具有增加细胞生长的效果。作为一例，所述阴离子聚合物和所述阳离子聚合物的重量比为50～95:50～5、60～90:10～40或65～85:35～15，在该范围内具有由阴离子聚合物和阳离子聚合物构成的支架的物理强度优异而适于用作敷料且易于处理的效果。向所述混合溶液ii中混合交联剂并在25至35℃的温度下进行交联3至24小时以制备交联基质。作为一例，所包含的所述交联剂的浓度为0.01至7mg/g、0.5至6mg/g或0.1至5mg/g，在该范围内具有可以吸收体液而不溶于体液从而吸收伤口中产生的渗出物的效果。向所述交联基质中添加多重生长因子以制备加载有生长因子的交联基质。作为一例，所包含的所述多重生长因子的浓度为0.1至30μg/g、0.5至25μg/g或1.0至20μg/g，在该范围内具有优异的慢性伤口治疗效果。作为一例，所述多重生长因子中的两种生长因子的重量比为1～9:9～1、2～8:8～2或3～7:7～3，在该范围内具有优异的慢性伤口治疗效果。将加载有所述生长因子的交联基质注入一定形状的模具中，然后在-85℃至-75℃的温度下冷冻4至12小时，然后在冷冻干燥器中在-40℃至-10℃的温度下干燥12至35小时。以下，为了帮助理解本发明而示出了优选实施例，但本领域的技术人员明白，下列实施例仅用于例示本发明且在本发明的范畴和技术思想的范围内可以进行各种变更和修改，这种变更和修改也理应包含在所附权利要求书的范围内。[实施例]实施例1在100ml蒸馏水中添加盐酸或硫酸以使ph值为4，且混合胶原蛋白(重均分子量为300000g/mol)以使其相对于酸水溶液的浓度为1mg/g并利用均质器以制备混合溶液i。向所述混合溶液i中添加氢氧化钠以将ph值调节为7.0至8.0，然后混合透明质酸(重均分子量为1500000g/mol)以使相对于酸水溶液的浓度为9mg/g并使用均质器以制备混合溶液ii。向所述混合溶液ii中混合作为交联剂的1,4-丁二醇二缩水甘油醚以使其浓度为5mg/g(相对于固体成分)，且在30℃下进行交联12小时以制备交联基质。向所述交联基质中添加egf和fgf并进行混合以使egf和fgf的重量比为5：5且总浓度为5μg/g，然后注入一定形状的模具中。在-80℃的温度下对所述模具进行冷冻6小时，然后在冷冻干燥器中在-20℃的温度下干燥24小时，以制备加载有多重生长因子的交联基质。实施例2除了上述实施例1中的胶原蛋白的使用量使其最终浓度为2mg/g和透明质酸的使用量使其最终浓度为8mg/g之外，以与上述实施例1相同的方法制备加载有多重生长因子的交联基质。实施例3除了上述实施例1中的胶原蛋白的使用量使其最终浓度为5mg/g和透明质酸的使用量使其最终浓度为5mg/g之外，以与上述实施例1相同的方法制备加载有多重生长因子的交联基质。实施例4除了用edc代替在上述实施例1中用作交联剂的1,4-丁二醇二缩水甘油醚之外，以与上述实施例1相同的方法制备加载有多重生长因子的交联基质。实施例5除了用hmdi代替在上述实施例1中用作交联剂的1,4-丁二醇二缩水甘油醚之外，以与上述实施例1相同的方法制备加载有多重生长因子的交联基质。比较例1除了在上述实施例1中不使用交联剂之外，以与上述实施例1相同的方法制备加载有多重生长因子的交联基质。比较例2除了在上述实施例1中仅使用egf以使其浓度为5μg/g之外，以与上述实施例1相同的方法制备加载有多重生长因子的交联基质。比较例3除了在上述实施例1中仅使用fgf以使其浓度为5μg/g之外，以与上述实施例1相同的方法制备加载有多重生长因子的交联基质。比较例4除了用葡聚糖代替上述实施例1中的透明质酸和胶原蛋白以使其浓度为1mg/g之外，以与上述实施例1相同的方法制备加载有多重生长因子的交联基质。比较例5除了用透明质酸代替上述实施例1中的透明质酸和胶原蛋白以使其浓度为10mg/g之外，以与上述实施例1相同的方法制备加载有多重生长因子的交联基质。比较例6除了用胶原蛋白代替上述实施例1中的透明质酸和胶原蛋白以使其浓度为10mg/g之外，以与上述实施例1相同的方法制备加载有多重生长因子的交联基质。[实验例]实验例1.加载有多重生长因子的交联基质的生物降解性评估将在实施例1、2、3和比较例1中所制备的加载有多重生长因子的交联基质切割为2×2cm的大小，然后放入器皿中。将添加有200单位(unit)的透明质酸酶和200单位的胶原蛋白酶的20ml磷酸盐缓冲溶液放入所述器皿中，在37℃下以50rpm保存，且在第1、3、7、14、21天测量加载有多重生长因子的交联基质的大小变化并在图1中示出。从实验结果可以确认到，不进行交联的基质(比较例1)迅速降解并在第一天就全部降解，而加载有交联的多重生长因子的交联基质(实施例1至3)保持7天以上。实验例2.交联度评估通过吸水性评估交联度。将在实施例3至5中所制备的加载有多重生长因子的交联基质切割为一定大小并测量初始重量后，放入器皿中使其充分吸收蒸馏水后测量重量。吸水性通过下列数学式1计算，其结果在表1中示出。[数学式1]吸水性＝(吸收蒸馏水后的重量(mg)–初始重量(mg))/初始重量(mg)[表1]取决于交联剂的吸水性评估初始重量吸水后重量吸水性实施例316.889.74.33实施例417.5105.65.03实施例517.275.13.36比较例113.9无法测量无法测量从实验结果可以确认到：实施例3至5吸收水分，但不会容易地溶解于水中。因此，本发明的组合物可以在伤口表面中保持稳定的形态且可以吸收渗出物且保持水分环境，从而可以提供对慢性伤口恢复有利的环境。相反，没有使用交联剂的比较例1立即溶解到水中，因此无法进行测量。实验例3.多重生长因子的稳定性评估测量在实施例1、2、3和比较例1、4、5、6中所制备的加载有多重生长因子的交联基质中包含的生长因子的体外释放行为。将实施例1和比较例1、4、5、6中所制备的加载有多重生长因子的交联基质切割为直径为30mm的圆形并安装在franz池中。在franz池填充14ml的磷酸盐缓冲溶液且在37℃下以50rpm搅拌。在第1、3、7、14、21、28天取样1ml且再添加1ml的磷酸盐缓冲溶液。用elisa试剂盒对egf和fgf进行定量分析，结果如图2所示。从实验结果可以确认到：与在比较例1、4、5、6中所制备的基质相比，在实施例1中所制备的加载有多重生长因子的交联基质在更长时间内持续释放生长因子。因此，本发明的组合物通过提高生长因子的持续性而更有效地作用于慢性伤口从而能够提高伤口的恢复速度。实验例4.慢性伤口动物模型中的伤口治愈性能评估对在实施例3和比较例1至6中所制备的加载有多重生长因子的交联基质的慢性伤口治愈性能进行评估。为了实现慢性伤口模型，开发了利用链脲霉素(streptozotocin，stz)的1型糖尿病模型，并且为了诱导1型糖尿病模型而将六周龄的小鼠稳定一周后禁食12小时，然后腹腔注射200mg/kg的stz。在注射后1周内，每天测量血糖以筛选糖尿病被诱发的实验动物且在背部中央诱发直径为1cm2的深部伤口(去除筋膜层)，然后为了防止伤口收缩，利用硅胶环通过缝合线缝合，然后测量伤口大小。在7天和14天后通过伤口的面积变化率评估愈合性能，其结果在图3中示出。实验结果示出在多重生长因子(egf,fgf)与基质稳定地结合的实施例3中示出最快的伤口恢复速度。实施例3随着时间的推移也持续释放多重生长因子，从而在第14天实施例3相比比较例1至6显著减小伤口面积。因此，多重生长因子通过与阳离子聚合物和阴离子聚合物的离子键合而提高持续性，且多重生长因子相比单一生长因子能够提高慢性伤口中的伤口恢复速度。当前第1页12