本发明涉及一种防治牛支原体病的中药复方喷鼻剂的制备方法。
背景技术：
牛支原体(mycoplasmabovis)是一种能够导致牛产生各种疾病和高感染率的重要病原体。它可以导致牛发生肺炎、关节炎、久治不愈乳腺炎、结膜角膜炎、怀孕母牛流产、生殖器感染等疾病。症状为发烧、咳嗽、鼻孔流有铁锈色鼻液、腹泻、关节肿大、严重乳房炎、头胎牛发生流产、死胎，新生犊牛在饲喂乳房炎奶牛的乳汁后，逐渐出现关节和蹄部肿大，行走困难，甚至无法站立等。牛支原体肺炎有传染性，故影响集约化牛场的生产，且常常由于高病死率、治疗昂贵以及病牛生长缓慢而给奶牛养殖企业带来巨大的经济损失。据文献记载欧洲每年因牛病损失的5.79亿欧元中有1/3是由牛支原体引起的在英国，约有190万头牛患有牛支原体肺炎，死亡可达15.7万头，经济损失超过5400万英镑，在这些呼吸道感染牛中，至少有1/4-1/3是由牛支原体引起的。在我国，1983年黎济申首次报道了从乳房炎牛乳中分离得到牛支原体，此后仅少数临床报道证实了牛支原体导致奶牛乳房炎；2008年湖北多地报道了牛支原体可导致牛传染性支原体肺炎。
目前，牛支原体病的临床处置主要以西药防治为主，而长期使用西药不仅会产生许多副作用，损伤肝肾，同时处理炎症时抗生素的使用也会导致耐药菌株的产生，而且药物的残留对食品安全及人类的健康也会产生不良影响。中草药属于纯天然物质，含有多种生物活性成分，具有疏通消导和降逆、健脾益气、增强机体免疫力，毒害作用小、环保等特点，并且利用中药制剂防治牛支原体病属于非抗生素疗法，因此应用前景广阔。
技术实现要素：
本发明目的在于防治牛支原体病传统中药验方的基础上，提取中药有效成分，进一步离心、过滤、浓缩，制备出的一种主要具有牛支原体抑菌效果、治疗牛支原体所引起肺炎，用药安全、方便、低残留与的特点的中药复方喷鼻剂。
本发明的方案如下：一种防治牛支原体病的中药复方喷鼻剂由苦参3份、鱼腥草3份、大黄3份、黄柏3份、透骨草3份、胡黄连3份、花椒2份、黄连2份、丁香2份、甘草2份、连翘3份；所有药材分别提取有效成分后混合提取物，分装喷雾瓶制成。
采用本发明方法制备中药复方喷鼻剂的有益效果是：
1、本发明的制剂为纯中药制剂，具无残留、无公害、抑菌消炎等作用，可有效缓解由牛支原体引起的呼吸道症状，组方药物疗效确切。
2、现有的抗生素西药治疗方法在临床上有一定的治疗效果。但易引起菌株的耐药性，还会造成药物残留，影响畜产品质量。本发明的中药复方喷鼻剂，纯中药配方，无残留且不易耐药。
3、治疗效果：在实验室建立的牛支原体家兔感染模型上进行治疗实验，喷鼻剂喷鼻给药，0.5ml/kg体重，1次/天，连续给药5天，治疗效果显著。药物安全性检测结果显示，本药物安全无毒。
具体实施方式
实施例：
1、各种中药有效成分提取：
（1）苦参的提取：
首先将苦参粉碎至40目，然后将粉碎后的苦参放入药材8倍量，体积浓度为65%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取3次，每次提取时间1.5h，提取温度80℃，将三次提取的溶液混合、单层滤纸真空抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
（2）鱼腥草的提取：
首先将鱼腥草粉碎至40目，然后将粉碎的鱼腥草放入药材20倍、体积浓度为70%的乙醇溶液中，采用超声震荡的方法提取，提取1~3次，每次提取时间为1.5h，提取温度为55℃，功率为100w，然后将3次提取的溶液混合、单层滤纸真空抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
（3）大黄的提取：
首先将大黄粉碎至40目，然后将粉碎后的大黄放入药材10倍量，体积浓度为80%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取3次，每次提取时间1.5h，提取温度80℃，将三次提取的溶液混合、单层滤纸真空抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
（4）黄柏的提取：首先将黄柏切成厚度为2mm的薄片，然后将切片的黄柏放入药材10倍量、体积浓度为75%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取3次，每次提取时间2h，提取温度80℃，将3次提取的溶液混合、单层滤纸真空抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
（5）透骨草的提取：
首先将透骨草粉碎至40目，然后将粉碎的透骨草放入药材10倍、体积浓度为80%的乙醇溶液中，采用超声震荡的方法提取，提取3次，每次提取时间为2.5h，提取温度为55℃，功率为100w，然后将3次提取的溶液混合、单层滤纸真空抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
（6）胡黄连的提取：
首先将胡黄连粉碎至40目，然后将粉碎后的黄连放入药材12倍量、体积浓度为65%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取1次，再放入药材8倍量、体积浓度为60%的乙醇溶液中再提取一次，每次提取时间3h，提取温度80℃，然后将2次提取的溶液混合、单层滤纸真空抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
（7）花椒的提取：
首先将干燥花椒（去仁、去梗），然后将干燥的花椒放入药材10倍量、体积浓度为90%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取2次，每次提取时间3h，提取温度80℃，然后将2次提取的溶液混合、单层滤纸加压抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
（8）黄连的提取：
首先将黄连粉碎至40目，然后将粉碎后的黄连放入药材10倍量、体积浓度为60%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取2次，每次提取时间2h，提取温度80℃，然后将2次提取的溶液混合、单层滤纸真空抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
（9）丁香的提取：
首先将丁香粉碎至40目，然后将粉碎的甘草放入药材14倍、体积浓度为60%的乙醇溶液中，采用超声震荡的方法提取，提取3次，每次提取时间为60min，提取温度为60℃，功率为180w，然后将3次提取的溶液混合、单层滤纸真空抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
（10）甘草的提取：
首先将甘草粉碎至40目，然后将粉碎的甘草放入药材10倍、体积浓度为75%的乙醇溶液中，采用超声震荡的方法提取，提取3次，每次提取时间为40min，提取温度为45℃，功率为200w，然后将3次提取的溶液混合、单层滤纸真空抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
（11）连翘的提取：
首先将连翘粉碎至40目，然后将粉碎后的连翘放入药材10倍量，体积浓度为80%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取4次，每次提取时间2h，提取温度60℃，将4次提取的溶液混合、单层滤纸真空抽滤后收集滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的流浸膏，即原药材1g制成1ml的流浸膏；
2、配置复方中药：
将从所有药材中分别提取到的有效成分混合，在常温下静置18-24小时后，以3000-3500r/min离心25-30min然后收集上清液，弃去残渣，再将上清液置于旋转蒸发仪上浓缩，最终制成1:1的混合液，即原药材1g制成1ml的混合溶液。
3、喷鼻剂的制备：
静置、过滤、离心取上清后，溶液无残渣、均匀、透亮，含有糖成分所以有一定粘性，可以附着在鼻腔、气管、支气管及肺泡内部以释放有效成分达到治疗效果。将药液分装于喷雾瓶中，即得到含量为1g原药/ml溶剂的中药复方喷鼻剂。
4、体外抑菌试验：
使用中药提取物及复方中药溶液，针对牛支原体致病菌株进行药敏片法体外抑菌实验：常用治疗西药抗牛支原体药物抑菌圈直径为四环素d=31.17±1.04mm、泰秒菌素d=47.17±1.61mm、环丙沙星d=21.50±2.60mm，自制中药液药敏片（含药量20mg/片）抑菌圈直径：鱼腥草d=26.67±0.89mm、黄连d=50.00±1.33mm、黄柏d==24.83±1.89mm、透骨草d=21.33±0.76mm、大黄d=26.33±0.89mm、胡黄连d=24.50±0.33mm、苦参d=14.67±3.01mm、甘草d=20.83±0.56mm、丁香d=20.50±3.04mm、花椒d=17.17±0.76mm、连翘d=25.50±2.04mm、复方制剂d=28.56±1.33mm。与治疗常用西药抑菌圈直径结果进行比较，证明中药组方各成分以及混合液均有较好的抑制牛支原体生长的效果。
5、临床治疗效果：
在制造的牛支原体感染家兔模型上进行治疗，待体温升高，出现一定临床症状后，通过喷鼻给药，药量0.5ml/kg，1次/天，连续给药五天。治疗第二天体温开始下降，第三天即＜35℃回归正常范围；剖检情况可知，感染牛支原体20d未治疗家兔的肺脏有明显红色肉变、出血点密集、轻微皱缩现象，气管环出血，淋巴结肿大粘连且内有脓液。而感染20d经过治疗的家兔肺部出血点轻微、略微水肿、无其他病变，气管环出血不明显，淋巴结轻微肿大无脓液；病理组织切片结果可知，感染未治疗组组织切片结果出现肺组织淤血、肺组织出血、肺泡塌陷、小血管淤血、肺泡隔增厚等，而治疗组则未见明显出血，也无纤维素性渗出、淤血及水肿、肺泡隔清晰；所以该中药复方制剂有较好的临床治疗效果。
6、安全性检测结果：
在spf小鼠上进行急性毒性实验安全性检测，实验结果显示腹腔注射急性毒性试验，小鼠的最大耐受量ld0=20000mg/kg，最小致死量mld=25940mg/kg，根据改良寇氏法计算公式：ld50=lg-1[xm-i(∑p-0.5)]，式中xm为最大剂量的对数，p为各组动物的死亡率，∑p为各组动物死亡率总和，i为组间距（相邻两组对数剂量的差值），计算出ld50=41438mg/kg。根据公式slogld50=d