2R-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的制备及其在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用的制作方法

本发明涉及2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的结构、制备方法，以及2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

背景技术：

类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，ra)是以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性、自身免疫性疾病，是在环境因素、遗传背景以及两者交互作用下，高度异质性的自身免疫性疾病。ra是造成人类丧失劳动能力和致残的主要原因之一，全世界平均发病率为0.2％～1.2％，我国患病率为0.2％～0.93％。ra患者的治疗需要长期服药以控制病程并改善症状，治疗成本高、社会负担重。目前临床用于治疗ra的药物主要有非甾体抗炎药(non-steroidalanti-inflammatorydrugs，nsaids)、糖皮质激素、改变病情抗风湿药、生物制剂与植物药制剂等，虽然具有一定的疗效，却大都有较强的毒副作用，这与需要长期服药的理想抗类风湿药物尚存较大差距。因此更安全、更高效的具有抗ra活性的化合物，在研制ra治疗药物方面，具有重大价值。

本发明所涉及的化合物2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate是本发明申请人从传统中药珍珠梅sorbariasorbifolia(l.)a.brown.中纯化制备的一个新化合物，研究发现该化合物具有明显的抗ra活性，具有新型抗ra药物开发的价值。该化合物的化学结构、制备方法及其抗ra活性均为首次公开，因此具有突出的实质性特点。

技术实现要素：

本发明提供一种新化合物的制备方法，及其在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。

本发明所涉及的用于制备类风湿关节炎的化合物为2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate，其化学式是：c18h21no9，结构式是：

本发明所涉及的2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的制备方法为：

取珍珠梅药材，粉碎成最粗粉，加入20倍量的适当浓度的有机醇水溶液作提取溶剂，浸泡提取1～3次，每次10小时左右，合并提取液，过滤，脱醇浓缩至有机醇浓度20％左右，加 样于大孔吸附树脂柱，先用20％左右有机醇水溶液洗脱5个柱体积去除杂质，再用50～95％有机醇洗脱4个柱体积，收集50～95％有机醇洗脱部分，减压干燥后上100～200目的硅胶柱，选择合适的硅胶层析洗脱体系进行洗脱，收集含2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的洗脱部位，浓缩，结晶，过滤，即得到2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate粗晶。粗晶溶于重结晶溶剂后形成过饱和溶液，重结晶，可得纯度达98％以上的2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate样品。

本工艺中所涉及的用作提取溶剂的有机醇，为甲醇、乙醇中的一种，优选为乙醇。

本工艺中所涉及的大孔吸附树脂柱，为弱极性或非极性的大孔吸附树脂，优选弱极性。

本工艺中所涉及的硅胶层析洗脱体系，为二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、石油醚中的一种或几种，优选二氯甲烷-甲醇体系。

本工艺中所涉及的重结晶溶剂，可用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等溶剂中的一种或几种，优选甲醇或乙酸乙酯。

本发明还提供了该化合物在制备治疗抗风湿性关节炎药物中的应用。

本发明涉及的化合物，其化学结构、制备方法及其抗类风湿性关节炎的活性，均为首次公开，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，且有望用于一种新型抗类风湿性关节炎治疗药物的开发。

附图说明

图1是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate正离子质谱图(hr-esi-ms)。

图2是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate紫外光谱图(溶剂：cd3od)。

图3是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate¹hnmr谱图(溶剂：cd3od)。

图4是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate¹³cnmr谱(溶剂：cd3od)。

图5是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoatedept谱(溶剂：cd3od)。

图6是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate¹h-¹hcosy谱(溶剂：cd3od)。

图7是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoatehmqc谱(溶剂：cd3od)。

图8是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoatehmbc谱(溶剂：cd3od)。

具体实施方式

下面的实施例用以解释本发明，但是并非对本发明实质内容的限制。

实施例1.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的制备

取珍珠梅药材，粉碎成最粗粉，加入20倍量95％乙醇，浸泡提取1～3次，每次10小时左右，合并提取液，过滤，脱醇浓缩至乙醇浓度20％左右，加样于ab-8型弱极性大孔吸附 树脂柱，先用20％的乙醇溶液洗脱5个柱体积去除杂质，再用95％乙醇洗脱4个柱体积，收集95％乙醇洗脱部分，减压干燥后上100～200目的硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇为洗脱体系，按甲醇浓度由低到高进行阶段洗脱，收集甲醇浓度15～25％的洗脱部分，浓缩，结晶，过滤，减压干燥，得到2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate粗晶。将粗晶溶于乙酸乙酯，形成过饱和溶液进行重结晶，过滤，减压干燥，即得。

实施例2.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的制备

取珍珠梅药材，粉碎成最粗粉，加入20倍量甲醇，浸泡提取1～3次，每次10小时左右，合并提取液，过滤，脱醇浓缩至适当体积，补水至醇浓度20％左右，加样于d-101型非极性大孔吸附树脂柱，先用20％的甲醇溶液洗脱5个柱体积去除杂质，再用90％甲醇洗脱4个柱体积，收集90％甲醇洗脱部分，减压干燥后上100～200目的硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇为洗脱体系，按甲醇浓度由低到高进行阶段洗脱，收集甲醇浓度15～25％的洗脱部分，浓缩，结晶，过滤，减压干燥，即得到2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate粗晶。将粗晶溶于乙酸乙酯，形成过饱和溶液进行重结晶，过滤，减压干燥，即得。

实施例3.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的结构确证

1.仪器与材料

jascop-1020数字式旋光仪，agilenttof/6500高分辨率质谱，岛津uv-2401型可见-紫外分光光度计，核磁为brukeavanceiii500nmrspectrometer，熔点测定仪为yanacomp53型(熔点未校正)。2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate样品为按上述实施例1步骤制备。

2.化合物结构鉴定

无色粘稠油状物(甲醇),易溶于二甲亚砜、甲醇，微溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、水，不溶于石油醚，正离子esi-msm/z：396[m+h]⁺，418[m+na]⁺；负离子esi-msm/z：394[m-h]^-，430[m+cl]^-，789[2m-h]^-。正离子hr-esi-msm/z：实测值418.1108[m+na]⁺，计算值418.1114(c18h21no9na[m+na]⁺)；负离子hr-esi-msm/z：实测值394.1145[m-h]^-，计算值394.1138(c18h20no9[m-h]^-)。uvλmaxnm(logε)inmeoh：258(3.28)，209(3.31)，197(3.42)。¹h-nmr(500hz,cd3od)δ：7.97(2h,brd,j＝8.8hz,h-3',7')，6.86(2h,brd,j＝8.8hz,h-4',6')，5.74(1h,brs,ha-4)，5.55(1h,brs,h-2)，5.65(1h,brs,hb-4)，5.02(1h,brd,j＝13.5hz,ha-5)，4.97(1h,brd,j＝13.5hz,hb-5)，4.41(1h,d,j＝7.7hz,h-1”)，3.91(1h,dd,j＝11.9,1.8hz,ha-6”)，3.71(1h,dd,j＝11.9,5.6hz,hb-6”)，3.39-3.26(4h,m,h-2”,3”,4”,5”)。¹³c-nmr(125hz,cd3od)δ：167.5(s,c-1')，163.8(s,c-5')，138.7(s,c-3)，133.1(d,c-3',7')，121.8(s,c-2')，120.8(t,c-4)，118.3(s,c-1)，116.2(d,c-4',6')，102.9(d,c-1”)，78.4(d,c-5”)，77.9(d,c-3”)，74.7(d,c-2”)，71.4(d,c-4”)，68.1(d,c-2)，64.1 (t,c-5)，62.7(t,c-6”)。以上nmr数据根据dept谱以及¹h-¹hcosy、hmqc和hmbc等二维谱数据解析结果予以归属。经过与2s-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的碳谱数据和cd谱进行对比，确定该化合物c-2的绝对构型为r。据此推断该化合物结构为：

实施例4.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate片剂的制备

取2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate10克，加入适量95％乙醇，形成浸膏，然后加入环糊精或多孔淀粉，混匀，形成软材，造粒机造粒，真空干燥，整粒，然后加入润滑剂、矫味剂混合压片，片重250mg～500mg,每片含2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate5～10mg。

实施例5.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate胶囊剂的制备

取2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate10克，加入淀粉、羧甲基纤维素钠，混匀，灌装胶囊，即得。每粒胶囊重含2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate5～10mg。

实施例6.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate对佐剂关节炎大鼠血清中peg2与no水平的影响

1.仪器与材料

ex1800型酶联免疫分析仪(biotek)；uv-2450型分光光度计(日本岛津)。卡介苗，上海生物制品研究所；羊毛脂、石蜡油、no试剂盒、前列腺素e2(pge2)试剂盒，购于南京建成试剂公司；雷公藤多苷片，上海复旦复华药业产品，批号141001。wistar大鼠，spf级，雌性，体质量120～150g，由山东绿叶制药实验动物中心提供。

2.建模与给药

将大鼠随机分为4组(每组8只)，分别为对照组、阳性对照雷公藤多苷片组、模型组及2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate组。对照组大鼠右后足跖皮内注射生理盐水，其他各组右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(每10mg卡介苗溶解于1ml石蜡油中，混匀后高压灭菌)0.1ml，记录大鼠左后足踝关节的周长。各给药组于造模后第9天开始ig给药，氰苷组与雷公藤多苷均按10mg/kg给药，模型组和对照组给予等量生理盐水，各组连续给药13d。

3.指标检测

末次给药(造模后第21天)lh后心脏采血、取血清，-20℃保存，按照试剂盒说明书分别测量血清中no和pge2的量。检测结果见表1。

表1.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate对佐剂关节炎大鼠血清中peg2与no水平的影响(n＝8)

4.结论：2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate可显著抑制佐剂关节炎大鼠血清中peg2与no的水平，且其活性与同等剂量的雷公藤多苷水平接近，可以用来制备治疗抗类风湿关节炎的药物。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。