FSTL1在肝脏等组织抗纤维化的稳态调节中的保护作用与应用的制作方法

本发明fstl1蛋白或其调节化合物在制备用于治疗肝脏、肺、肾脏等组织器官中抗纤维化稳态调节及抗右心室扩张的药物中的用途。本发明还涉及一种非人转基因动物模型及其构建方法和应用，尤其是涉及一种由不同剂量他莫昔酚在动物不同生长阶段诱导的可控的卵泡抑素样蛋白1(fstl1)基因条件性敲除转基因小鼠动物模型、构建方法及其在组织纤维化病变中的应用。

背景技术：

卵泡抑素样蛋白1(fstl1)是一种分泌性的糖蛋白，最初从小鼠成骨细胞系mc3t3克隆得到，该蛋白在除血液细胞外的多种细胞中表达，特别是在间充质系细胞中表达水平较高(knight,c.,etal.,jdentres,2001.80(10):p.1895-902；geng,y.,etal.,procnatlacadsciusa,2011.108(17):p.7058-63；sylva,m.,etal.,plosone,2011.6(8):p.e22616；tanaka,m.,etal.,intimmunol,1998.10(9):p.1305-14.；wilson,d.c.,etal.,arthritisrheum,2010.62(8):p.2510-6.；chaly,y.,etal.,arthritisrheum,2012.64(4):p.1082-8.)。虽然fstl1的生物学功能尚不完全清楚，但从现有的研究来看，其作用涉及心血管疾病、机体免疫调节、呼吸系统及骨骼肌发育等多个方面(oshima,y.,etal.,circulation,2008.117(24):p.3099-108.；liu,s.,etal.,amjphysiolendocrinolmetab,2010.299(3):p.e351-63；ouchi,n.,etal.,jbiolchem,2008.283(47):p.32802-11.；trojan,l.,etal.,anticancerres,2005.25(1a):p.183-91.；sundaram,g.m.,etal.,nature,2013.495(7439):p.103-6.)。fstl1全身性敲除会导致新生小鼠死亡，且呼吸系统及骨骼等多种组织器官会发育异常(chaly,y.,etal.,annrheumdis,2014.)。然而，体内的复杂环境限制了这种非特异性小鼠敲除模型的应用， 因此，我们建立了一种在血管内皮细胞特异性可诱导敲除fstl1的小鼠模型，用于研究血管内皮细胞来源的fstl1的生物学作用及其在相关疾病研究中的应用。

纤维化是指组织器官的病理性增生、硬化及疤痕修复过程，主要特征包括肌成纤维细胞分化增殖、及以胶原为主的胞外基质积累。组织纤维化是由于多种刺激因素引起的持续慢性炎症的结果，这些因素包括持续感染、自身免疫反应、过敏反应、药物、辐射等理化因素以及组织损伤等(wynn,t.a.,jpathol,2008.214(2):p.199-210.)。肝纤维化在临床较为常见，包括病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝等。有研究表明，抑制fstl1可以减少博莱霉素引起的肺纤维化(dong,y.,etal.,jexpmed,2015.212(2):p.235-52.)。另外，在冠状动脉结扎的心肌梗塞小鼠模型中，通过给梗死心肌提供fstl1可以减少受损区域附近的心脏纤维化(wei,k.,etal.,nature,2015.525(7570):p.479-85.)。然而，尚未有研究表明fstl1与肝脏纤维化有关系。目前，在生物医学实验中，建立肝纤维化模型的试验方法主要有胆管结扎，硫代乙酰胺、四氯化碳化学诱导等，但这些动物模型往往不能真实反应肝组织纤维化的病理过程。

另一方面，右心扩张性功能障碍常常是由肺动脉高压引起的一种进行性疾病，患者因血管阻力增加，导致右心室负荷加重所致。目前认为血管壁细胞过度生长以及炎症反应等因素导致的血管结构病变是其中一个主要原因(schermuly,r.t.,etal.,natrevcardiol,2011.8(8):p.443-55.)。已有研究表明，过表达fstl1可以保护小鼠心脏免于缺血-再灌注的损伤(walsh,k.,circj,2009.73(1):p.13-8.)。fstl1也曾报道过参与肺部血管的发育(navessap.,etal.,amjrespircritcaremed,2015.191:a5960)。然而，尚未有研究表明fstl1与血管重塑异常从而导致右心扩张病变相关。目前，在生物医学实验中，建立肺动脉高压的实验方法主要有慢性低氧法，野百合碱注射，分流手术等，而利用基因敲除技术建立的肺动脉高压模型尚未得到广泛应用。

本发明利用基因敲除技术建立小鼠肝、肺、肾脏等多组织纤维化模型，对于研究相应组织纤维化的病理机制、以及制备用于治疗组织纤维化相关疾病的药物筛选的临床前动物模型有重要的科学意义及应用价值。同时，该发明中所建立的小鼠模型，特别是用肺组织中αsma阳性(标记新生血管周细胞)血管作为病变表型的判断，对于研究肺动脉高压及右心扩张的发病机制、以及应用于研制筛选相关治疗药物有重要的科学价值与应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提出了fstl1蛋白或其调节化合物在制备促进肝脏、肺、肾脏等组织抗组织纤维化的稳态调节中的保护作用的药物中的用途。

本发明的目的之二在于提出了fstl1蛋白或其调节化合物在制备促进右心室扩张保护作用的药物中的用途。

在本发明的一些实施例中，所述fstl1蛋白包括fstl1蛋白包括其衍生物、其类似物或多肽。

在本发明的实施例中，所述fstl1调节化合物是fstl1表达诱导剂。

在本发明的实施例中，所述fstl1表达诱导剂包括激活fstl1基因表达的酶、激素、生长因子、细胞因子或抗体。

在本发明的一些实施例中，所述药物用于组织纤维化病变相关的疾病。

在本发明的具体实施例中，所述组织纤维化病变相关的疾病包括：由各种物理性、化学性、炎症等免疫因素、以及其他病理性应急导致的组织纤维化，包括肺、肝、肾与心脏等组织纤维化。

在本发明的一些实施例中，所述药物用于治疗右心室扩张病变相关的疾病。

在本发明的具体实施例中，所述右心室扩张病变相关的疾病包括：肺动脉高压及其他肺源性高血压、右心室或左心室心肌症、右心室缺血或梗死、肺动脉瓣或三尖瓣病变等。

本发明的目的之三在于提供了一种建立肝脏、肺、肾脏组织纤维化病变模型或右心室扩张模型的新方法，并且通过调控fstl1基因水平来控制组织纤维化病变的程度，具体可通过调节：不同时间点诱导基因敲除、以及不同处理方式诱导fstl1基因敲除的效率等方法来实现。

在本发明的实施例中，所述动物为哺乳动物。

在本发明的一些实施例中，所述哺乳动物为啮齿类动物。

在本发明的具体实施例中，所述啮齿类动物为小鼠。

在本发明的实施例中，所述基因敲除诱导剂包括四环素、干扰素、激素。

在本发明的一些实施例中，所述激素为他莫昔酚。

在本发明的一些实施例中，所述时间点为出生1-8天。

在本发明的具体实施例中，中所述时间点为出生1-4天，所述他莫昔酚的剂量为50-100μg/天。

在本发明的一个具体实施例中，所述时间点为出生1-4天，所述他莫昔酚的剂量为50-70μg/天。

在本发明的另一个具体实施例中，所述时间点为出生5-8天，所述他莫昔酚的剂量为90-100μg/天。

在本发明的又一个具体实施例中，所述时间点为出生2周到成年，所述他莫昔酚的剂量为500-1000μg/天。

在本发明的实施例中，所述启动子包括所述启动子包括受体酷氨酸激酶tek或泛素c(ubc)或血管内皮细胞-钙黏蛋白(ve-cadherin)。

在本发明的实施例中，所述非人转基因动物及其后代用作组织器官中组织纤维化的模型。

在本发明的一些实施例中，所述组织器官为肝脏、肺、肾脏或心脏。

本发明的目的之四在于提供了一种筛选治疗组织纤维化病变的药物的方法，其包括将药物给予如前面所述的非人转基因动物及其后代，并监测对病理学或行为的影响。

在本发明的一些实施例中，所述组织器官为肝脏、肺、肾脏或心脏。

本发明的目的之五在于提供了一种构建与组织纤维化密切相关的血管内皮细胞fstl1基因敲除小鼠模型的方法，其中，该方法的具体制备步骤为：利用cre-loxp系统，获得fstl1条件性敲除模型fstl1^flox/flox小鼠；同时利用fstl1^+/-小鼠与tek-cre小鼠(血管内皮细胞表达cre重组酶tek-cre的转基因小鼠)交配得到fstl1^+/-，tek-cre的小鼠，再用所述fstl1^+/-，tek-cre小鼠与fstl1^flox/flox小鼠(背景：129s4xc57bl/6j，由中国南京模式动物研究所制备)交配得到fstl1^flox/-，tek-cre血管内皮细胞敲除fstl1的小鼠模型，即fstl1^-/ecko。内皮细胞特异性敲除fstl1小鼠导致多组织纤维化利用上述血管内皮细胞特异性敲除fstl1的小鼠模型，在 不同的时间点采取小鼠肝脏、肺、肾脏组织，通过检测纤维化的指标评估组织纤维化病变。

本发明的目的之六在于提供了一种构建与组织纤维化密切相关的全身性或血管内皮细胞诱导性敲除fstl1基因的小鼠模型的方法，其中，该方法的具体制备步骤为:将fstl1^+/-小鼠与表达ubc-cre/ert2或ve-cadherin-cre/ert2的转基因小鼠交配得到fstl1^+/-；cre/ert2小鼠，再用所述fstl1^+/-；cre/ert2小鼠与fstl1^flox/flox小鼠交配分别得到基因型为fstl1^flox/-；ubc-cre/ert2或fstl1^flox/-；ve-cadherin-cre/ert2、以及fstl1^flox/+；ubc-cre/ert2或fstl1^flox/+；ve-cadherin-cre/ert2的小鼠模型。利用可诱导fstl1基因敲除的小鼠模型，通过他莫西芬不同的处理时间，建立不同纤维化程度的小鼠模型。关于小鼠多组织纤维化的分析方法和指标同上。

在可诱导fstl1基因敲除的小鼠模型中，可通过他莫西芬不同剂量诱导fstl1基因的敲除效率，并建立fstl1敲除效率与小鼠多组织纤维化程度的相关性，具体分析方法和指标同上。

利用可控的fstl1敲除小鼠模型在抗组织纤维化药物筛选中的应用小鼠血管内皮敲除fstl1后，出生后21天组织出现纤维化；同时在可诱导fstl1基因敲除的小鼠模型，通过他莫西芬不同的处理时间、不同处理剂量导致不同程度的小鼠相应组织纤维化病变。说明fstl1蛋白能用于制备预防或治疗组织纤维化的药物。本发明针对fstl1在组织纤维化中的作用，为制备治疗组织纤维化的药物提供了基础，以利于组织纤维化的研究和评估抗肝纤维化药物的效果。

利用血管内皮细胞特异性敲除fstl1小鼠模型开展右心扩张病变的机制研究。利用fstl1血管内皮细胞特异性敲除的小鼠模型(fstl1^-/ecko)，在不同的时间点，采取小鼠心脏组织检测右心扩张病变的程度。取下小鼠心脏在4％的多聚甲醛pfa中固定过夜后，对组织进行石蜡包埋、切 片和病理分析，分析发现出生后21天的敲除组小鼠右心室严重扩张，具体指标包括形态学分析、h&e染色、右心室面积的定量分析等。本发明内容便于开展fstl1在右心扩张病变中的机制研究。

内皮细胞特异性敲除fstl1小鼠模型在肺动脉高压及右心扩张性病变药物筛选中的应用。小鼠血管内皮敲除fstl1后，出生后3周左右出现右心室扩张。本发明针对fstl1在血管重塑造中的作用，说明fstl1蛋白及相关试剂可用于制备预防或治疗某些血管病变导致的心扩张病变的药物。

该动物模型(fstl1^-/ecko)也可用于筛选肺动脉高压及右心扩张病变的新药，并对相关药物进行药效评估。

发明的有益效果

本发明的有益效果首次建立了血管内皮细胞特异性以及全身诱导敲除卵泡抑素样蛋白1小鼠模型，并将该动物模型应用在揭示该蛋白生物学功能的探索中。利用可控的fstl1敲除效率建立的小鼠肝纤维化模型，可应用研究fstl1在肝脏纤维化的发病机制。fstl1可应用于研制治疗肝脏纤维化疾病的药物，诸如fstl1蛋白或类似物可延缓或终止肝纤维化病变程度。利用fstl1基因敲除的小鼠肝纤维化模型，可应用于治疗肝纤维化新药的药效评估。

附图说明

图1是示出利用westernblot方法检测血管内皮特异性敲除fstl1小鼠模型的肝组织中fstl1蛋白的表达水平(出生后第14天)的图。

图2是示出利用实时定量rt-pcr的方法对血管内皮特异性敲除fstl1小鼠模型的肝脏组织中的fstl1mrna进行分析(出生后第14天)的图。

图3是示出利用westernblot方法检测小鼠出生后诱导敲除fstl1的肝脏组织中fstl1蛋白的表达水平(出生后第19天)的图。

图4是示出血管内皮特异性敲除fstl1小鼠的肝脏发生纤维化病变。 利用天狼星红染色检测小鼠肝脏胶原的含量(出生后第21天)的图。

图5是示出血管内皮特异性敲除fstl1小鼠的肝脏发生纤维化病变。检测小鼠肝脏羟脯氨酸的含量(出生后第21天)的图。

图6是示出fstl1蛋白对血管内皮特异性敲除fstl1小鼠形成肝脏纤维化病变的保护作用的图。

图7是示出利用westernblot方法检测血管内皮特异性敲除fstl1小鼠模型中肺组织中fstl1蛋白的表达水平(出生后第21天)的图。

图8是示出利用实时定量rt-pcr的方法检测对血管内皮特异性敲除fstl1小鼠模型中肺组织中的fstl1mrna水平(出生后第14天)的图。

图9是示出血管内皮特异性敲除fstl1基因导致突变体小鼠肺组织中血管重塑造异常的图。利用免疫荧光染色方法检测肺组织中血管(pecam-1，绿色；αsma，红色)，结果表明血管内皮细胞敲除fstl1导致αsma阳性血管明显增加(出生后第21天)。

图10是示出血管内皮特异性敲除fstl1基因导致突变体小鼠肾组织中血管重塑造异常的图。

图11是示出血管内皮特异性敲除fstl1小鼠右心扩张病变的形态学分析(出生后第21天的心脏)，发现血管内皮细胞敲除fstl1的小鼠其心脏体积明显变大的图。

图12是示出利用h&e染色观察小鼠出生后21天心脏的特征变化，fstl1敲除小鼠其右心室明显扩张的图。

图13是示出定量分析显示在血管内皮细胞敲除fstl1的小鼠，右心室与心脏总面积比明显增加(出生后第21天的心脏)的图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。

本发明所用的术语“fstl1调节化合物”是指与fstl1蛋白或基因相互作用而由此调节(例如，增强或抑制)所述fstl1蛋白活性的化合 物。例如，调节fstl1转录水平或蛋白水平表达的化合物。

本发明所用的术语“表达诱导剂”是指作用于启动子的条件性基因表达的化合物，本发明中是指激活fstl1基因表达的酶、激素、生长因子、细胞因子或抗体。

如本文中所使用，的术语“抗体”，是指结合特定表位的任何免疫球蛋白或完整分子以及其片段。所述抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、以及完整抗体的片段和/或部分，只要这些片段或部分保留亲本抗体的抗原结合能力。例如，本发明中，“抗fstl1抗体”是指能特异性地结合fstl1蛋白，或其功能变体或功能片段的单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和其具有免疫活性的片段或部分。本发明中，诸如“fstl1抗体”、“抗fstl1抗体”以及“针对fstl1的抗体”这样的术语均可以互换使用。

本发明所用的术语“多肽”是指包含通过肽键或变形肽键彼此连接的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。“多肽”包括短链(通常指称作肽、寡肽和寡聚体)和长链(通常称作蛋白质)。多肽可以包含20个基因编码氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通过自然过程(例如加工和其它的翻译后修饰)和通过化学修饰技术修饰的多肽。这些修饰在基础文献里和更加详细的专题论文中以及大量的研究文献中进行了很好的描述，且是本领域技术人员公知的。应当理解的是相同类型的修饰在给定多肽的几个位点上可以以相同或不同的程度存在。另外，给定的多肽可以包含多种类型的修饰。修饰可以发生在多肽中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端。修饰包括，例如乙酰化、酰化、adp-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成gpi锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解过程、磷酸化、异戊二烯化、消旋化、糖基化、脂质 连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和adp-核糖基化、硒基化(selenoylation)、硫酸化、转移rna介导的蛋白质的氨基酸添加(例如精氨酰化)和泛素化。例如，在本发明中，“fstl1多肽”特指能够特异性激活fstl1的多肽，或者能够诱导fstl1表达的多肽。

本发明所用的术语“治疗”是指逆转、减轻或抑制该术语所应用的疾病的进展，或疾病的一种或多种症状。如本文所使用的，根据患者的状况，该术语也包括预防疾病，包括预防疾病或与其相关的任何症状的发作，以及减轻病症或其在发作前的任何病状的严重性。

如本文中所使用，术语“非人转基因动物”由本领域已知技术获得，本发明的非人转基因的动物可以是任何非人动物，所述非人动物通过对原基因组进行遗传修饰，并受外源启动子控制进行fstl1突变型等位基因的条件性表达。

如本文中所使用，术语“启动子”指代能够结合哺乳动物细胞内的rna聚合酶并且起始可操作地连接于其上的下游(3'方向)编码序列的转录的dna调控区，其包括诱导型启动子，诸如cre-loxp启动子的条件性活性启动子。

如本文中所使用，术语“诱导性基因敲除(iko)”或“基因敲除诱导”指代利用控制cre表达的启动子的活性或所表达的cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxp动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。常见的几种诱导性类型(诱导剂)如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。

以下通过具体实施例对本发明做进一步的详细描述，本领域技术人员 根据本发明做出各种改变，均应属于本发明所附权利要求的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

具体实施例：

实施例1血管内皮细胞特异性fstl1敲除小鼠模型的建立

用fstl1^+/-小鼠(b6背景，南京动物模式研究所提供)与tek-cre小鼠交配得到fstl1^+/-,tek-cre的小鼠，再用此小鼠与fstl1^flox/flox小鼠交配得到fstl1^flox/-,tek-cre，此小鼠作为实验鼠(本发明中又称fstl1^-/ecko)，利用同窝基因敲除杂合(又称fstl1^-/wt)或野生小鼠(又称fstl1^wt/wt)作为对照鼠。

取新鲜小鼠肝脏、肺和肾脏组织，在pbs中清洗干净，液氮中速冻后贮藏在-80℃的冰柜中，可分别用于提取rna、及制备蛋白；其余组织在4％pfa固定过夜，组织包埋、切片按常规组织学方法进行组织学分析。利用westernblot和实时定量rt-pcr的方法来检测fstl1的敲除效率。其中针对肝脏组织，通过westernblot分析发现fstl1敲除小鼠其蛋白水平在肝脏组织中明显下降(图1)；利用实时定量rt-pcr的方法分析发现，fstl1敲除组小鼠的肝组织中fstl1信使rna(mrna)剩余水平与野生型小鼠相比约为34％(图2)。

实施例2建立全身性可诱导fstl1基因敲除的小鼠模型

用fstl1^+/-小鼠与表达ubc-creert2的转基因小鼠交配得到fstl1^+/-；ubc-cre/ert2的小鼠，再用此小鼠与fstl1^flox/flox小鼠交配得到fstl1^flox/-；ubc-cre/ert2(本发明中又被称为fstl1^-/iko)，此基因型小鼠作为实验鼠，同时得到的fstl1^flox/+；ubc-cre/ert2作为对照鼠(control)。

小鼠可在出生后的不同阶段诱导fstl1基因敲除，包括新生鼠(出生 第1-4天，p1-p4)、以及生长发育的不同阶段包括成年鼠，以制备可模拟临床人肝纤维化发生的动物模型。小鼠fstl1基因诱导敲除模型的制备方法如下：

小鼠出生后(出生第1-4天，p1-p4)通过胃注射他莫西芬(每只小鼠60ug)，小鼠在3周内进行采样分析。如图3所示，利用westernblot方法来检测fstl1的敲除效率，结果显示，fstl1蛋白水平在肝脏中明显下降。全身性诱导敲除动物模型(p1-4诱导)的结果与fstl1^-/ecko结果一致。

实施例3血管内皮细胞特异性fstl1敲除小鼠肝脏纤维疾病模型

肝脏纤维化病变过程中，以胶原为主的胞外基质大量积累。出生后三周小鼠取肝组织在4％的多聚甲醛pfa中固定2小时，然后在20％的蔗糖溶液中孵育过夜，然后进行组织包埋切片，利用天狼星红染色，具体方法简述如下：称取天狼星红染料siriusred(购自sigma公司)0.5g，溶解在500ml的苦味酸picricacid(购自上海生工，货号pb0716)中，常温保存待用。利用天狼星红染色分析发现，血管内皮细胞敲除fstl1导致肝组织中胶原含量明显升高(图4，红色代表天狼星红对肝脏中胶原的染色)。另外，羟脯氨酸是胶原的一种主要成分，通过测定羟脯氨酸的含量也可评估组织纤维化的程度。称取新鲜小鼠肝脏10mg，用100ul水匀浆，再利用12m的盐酸hcl在120℃条件下水解3小时，最后取50ul上清放入96孔板，用比色法测定羟脯氨酸的含量。分析发现，血管内皮细胞敲除fstl1小鼠的肝脏组织中羟脯氨酸含量明显升高(图5)。利用天狼星红染色、以及肝组织中羟脯氨酸含量分析发现，血管内皮细胞fstl1敲除小鼠在出生后21天后肝脏出现了纤维化。

另一方面，利用同时表达fstl1与egfp的重组腺病毒在p1与p8处理血管内皮特异性敲除fstl1小鼠，初步结果表明，与对照病毒(adlacz)处理的小鼠相比，fstl1处理可减轻fstl1^-/ecko小鼠肝脏αsma细胞的数量，预示肝脏纤维化病变得到改善(图6)。

实施例4血管内皮细胞特异性fstl1敲除小鼠肺纤维疾病模型

用fstl1^+/-小鼠(b6背景，南京动物模式研究所提供)与tek-cre小鼠交配得到fstl1^+/-,tek-cre的小鼠，再用此小鼠与fstl1^flox/flox小鼠交配得到fstl1^flox/-,tek-cre(fstl1^-/ecko)，此小鼠作为实验鼠，同窝基因敲除杂合(fstl1^-/wt)或野生小鼠(fstl1^wt/wt)作为对照。

取新鲜小鼠的肺在4％pfa固定过夜，组织包埋、切片按常规组织学方法进行。利用westernblot和实时定量rt-pcr的方法来检测fstl1的敲除效率，通过westernblot分析发现fstl1敲除小鼠其肺组织中该蛋白水平明显下降(图7)；利用实时定量rt-pcr的方法分析发现，fstl1敲除组小鼠的肺组织中fstl1信使rna(mrna)水平明显下降(图8)。利用免疫荧光染色方法检测肺组织中血管(pecam-1，绿色；αsma，红色)，结果表明血管内皮细胞敲除fstl1导致肺组织中αsma阳性血管即血管肌肉化程度明显增加(图9)，从而导致由肺血管阻力增加。

实施例5血管内皮细胞特异性fstl1敲除小鼠肾脏纤维疾病模型

与实施例4的实验方法相似，在肾脏组织中，利用免疫荧光染色方法检测肺组织中血管(pecam-1，绿色；αsma，红色)，如图10所示，结果表明血管内皮细胞敲除fstl1导致αsma阳性血管明显增加(出生后第21天)，说明血管内皮特异性敲除fstl1基因导致突变体小鼠肾组织中血管重塑造异常。

实施例6血管内皮细胞特异性fstl1敲除小鼠右心扩张病变

关于心脏的病理学分析如下：出生后三周的小鼠，用0.8％的戊巴比妥钠进行致死性麻醉(10ul/g)，解剖小鼠后发现血管内皮细胞敲除fstl1的小鼠其心脏体积明显大于对照组(图11)；利用pbs进行心脏灌 注，将血冲洗干净后在4％pfa进行固定，心脏组织石蜡包埋、切片按常规组织学方法进行。通过h&e染色分析，发现fstl1敲除小鼠右心室明显扩张(图12)。另外，用于心室定量的小鼠，通过尾静脉注射10％氯化钾，使小鼠猝死，心脏处于收缩期，然后进行组织固定、石蜡包埋、以及切片染色(h&e)，用于定量右心室与左右心室总面积的比值(心房除外)，进一步确定突变体小鼠右心室扩张病变(图13)。

以上，基于本发明的实施方式进行了说明，但本发明不限定于此，本领域的技术人员应该明白，在本发明的主旨的范围内能够以进行变形和变更的方式实施，这样的变形和变更的方式，理应属于本发明的保护范围。