一种棕榈酰抗坏血酸酯脂质体的制作方法

本发明涉及一种用于注射给药治疗肿瘤药物的组合物脂质体制剂，尤其涉及一种棕榈酰抗坏血酸酯脂质体的制备方法。

背景技术：

棕榈酰抗坏血酸酯(L-palmitoyl ascorbate，PA，化学结构式见图14)是抗坏血酸的一种脂溶性衍生物，由于棕榈酸基的植入，使其既有亲水的抗坏血酸基，又有亲油的棕榈酰酯，从而成为了一种优良的抗氧化剂。与抗坏血酸相比，其稳定性更强，具备更好的理化性质。脂溶性增强后，棕榈酰抗坏血酸进入细胞的能力增强，药效增强。因此其与抗坏血酸比较，经静脉、动脉、肌肉、皮下、腹腔等给药，特别是瘤内注射、介入给药等给药方式可以更加显著的增强抗瘤作用及安全性。而与抗坏血酸相似的是，棕榈酰抗坏血酸可以选择性的在肿瘤细胞内发挥药效，对正常细胞毒性小，因此毒副作用较小。此外，疏水性的特性使得棕榈酰抗坏血酸更易于被脂质体包载，制备出缓释效果较好的脂质体。

抗肿瘤药物在发挥抗肿瘤细胞作用的同时，亦可损伤正常细胞药物。治疗的一个关键问题是如何把药物定向输送到癌症细胞而又不损伤正常细胞。脂质体是靶向给药系统的一种新剂型，这种系统是目前药剂学最新、最有前途的给药系统。它可以将药物选择性地运送到靶点部位，发挥治疗作用，同时又不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而达到提高疗效、减少毒副作用的目的。

目前，关于棕榈酰抗坏血酸酯脂质体的报道较少。美国东北大学的Vladimir P.Torchilin教授等报道了一种维生素C棕榈酰酯脂质体制剂，其棕榈酰抗坏血酸酯与磷脂胆固醇的比例为52.9∶100，磷脂与胆固醇比例为2∶1。本发明旨在研制一种棕榈酰抗坏血酸酯的脂质体，以提高靶向性，降低毒副作用，提高疗效。同时，本发明所采用的制备方法适合产业化推广。

技术实现要素：

本发明的要解决的技术问题是提供一种具有良好的包封率、载药量和稳定性；并且粒径分布集中，大小分布均匀的棕榈酰抗坏血酸酯脂质体。

为解决本发明的技术问题，采用如下技术方案：

本发明的一种棕榈酰抗坏血酸酯脂质体，包括如下各组分：棕榈酰抗坏血酸酯∶磷脂类物质∶胆固醇类似物。

并且各组分之间的重量份比如下：

棕榈酰抗坏血酸酯∶磷脂类物质∶胆固醇类似物＝0.06～60∶203.3～290∶96.7～9.67。

优选的棕榈酰抗坏血酸酯∶磷脂类物质∶胆固醇类似物＝6～60∶203.3～273∶96.7～9.67。

更优选的棕榈酰抗坏血酸酯∶磷脂类物质∶胆固醇类似物＝6～24∶203.3～273∶96.7～27。

组合物中各组分还可以选自如下重量份：

抗坏血酸棕榈酸酯的重量份是：0.06～3；0.06～6；0.06～15；0.06～24；0.06～60；3～6；3～15；3～24；3～60；6～15；6～24；6～60；15～24；15～60；24～60；24；

磷脂类物质的重量份是：203.3～225；203.3～250；203.3～273；203.3～290；225～250；225～273； 225～290；250～275；250～290；275～290；

胆固醇类似物的重量份是96.7～75；96.7～50；96.7～27；96.7～9.67；75～50；75～27；75～9.67；50～27；50～9.67；27～9.67；

优选的磷脂类物质选自磷脂酰胆碱类、磷脂酰甘油类、磷脂酰肌醇类、磷脂酰乙醇胺类、神经鞘磷脂类中至少一种。

优选的磷脂类物质选自单链或双链磷脂；

优选的双链磷脂选自二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)、二月桂酸磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉蔻酸磷脂酰甘油、二月桂酸磷脂酰甘油、二软脂酸磷脂酰甘油、二硬脂酸磷脂酰甘油、二亚油酸磷脂酰肌醇、二肉蔻酸磷脂酸、二月桂酸磷脂酸、二软脂酸磷脂酸、二硬脂酸磷脂酸、二油酸磷脂酰丝氨酸、

优选的单链磷脂选自单棕榈酸磷脂酰胆碱(MPPC)、单月桂酸磷脂酰胆碱(MLPC)、单肉豆蔻酸磷脂酰胆碱(MMPC)、单硬脂酰磷脂酰胆碱(MSPC)、单肉蔻酸磷脂酰甘油、单月桂酸磷脂酰甘油、单软脂酸磷脂酰甘油、单硬脂酸磷脂酰甘油、单肉蔻酸磷脂酸、单月桂酸磷脂酸、单软脂酸磷脂酸、单硬脂酸磷脂酸、单油酸磷脂酰丝氨酸、单亚油酸磷脂酰肌醇、

优选的磷脂类物质还选自大豆磷脂、卵磷脂、心磷脂、脑磷脂中至少一种。

所述的脑磷脂可以是天然或合成的脑磷脂。

更优选的磷脂类物质选自二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱、二棕榈酸磷脂酰胆碱、大豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、心磷脂中至少一种。

最优选的磷脂类物质选自二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱、二棕榈酸磷脂酰胆碱、大豆磷脂中至少一种。

优选的胆固醇类似物选自胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯、谷甾醇中至少一种。

最优选的胆固醇类似物选自胆固醇。

在本发明的一个优选实施方案中，各组分之间的质量份比例(或重量份比例)可以选自如下范围任意组合：

优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱∶胆固醇＝0.06～0.21∶6～24∶203.3～273∶96.7～27。

优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱∶胆固醇＝0.12∶6～24∶203.3～273∶96.7～27。

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱∶胆固醇＝0.12∶15～24∶203.3～273∶96.7～27。

组合物中各组分还可以选自如下重量份：

抗坏血酸棕榈酸酯的重量份是：6～15，6～24，15～24；

二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱的重量份是：203.3～225；203.3～250；203.3～273；225～250；225～273；250～275；

胆固醇的重量份是96.7～75；96.7～50；96.7～27；75～50；75～27；50～27；

上述优选实施方案中，最优选的各组分之间的质量份比例(或重量份比例)选自：

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱∶胆固醇＝0.12∶24∶203.3∶96.7。

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱∶胆固醇＝0.12∶24∶250∶50。

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱∶胆固醇＝0.12∶24∶273∶27。

在本发明的一个优选实施方案中，各组分之间的质量份比例(或重量份比例)可以选自如下范围任意组合：

优选的抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶谷甾醇＝0.06～0.21∶6～24∶203.3～273∶96.7～27。

更优选抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶谷甾醇＝0.12∶6～24∶203.3～273∶96.7～27。

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶谷甾醇＝0.12∶15～24∶203.3～273∶96.7～27。

组合物中各组分还可以选自如下重量份：

抗坏血酸棕榈酸酯的重量份是：6～15，6～24，15～24；

大豆磷脂的重量份是：203.3～225；203.3～250；203.3～273；225～250；225～273；250～275；

谷甾醇的重量份是96.7～75；96.7～50；96.7～27；75～50；75～27；50～27；

上述优选实施方案中，最优选的各组分之间的质量份比例(或重量份比例)选自：

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶谷甾醇＝0.12∶24∶203.3∶96.7。

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶谷甾醇＝0.12∶24∶250∶50。

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶谷甾醇＝0.12∶24∶273∶27。

在本发明的一个优选实施方案中，各组分之间的质量份比例(或重量份比例)可以选自如下范围任意组合：

优选的抗坏血酸棕榈酸酯∶二棕榈酸磷脂酰胆碱∶胆固醇半琥珀酸酯＝0.06～0.12∶6～24∶203.3～273∶96.7～27。

更优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二棕榈酸磷脂酰胆碱∶胆固醇半琥珀酸酯＝0.12∶6～24∶203.3～273∶96.7～27。

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二棕榈酸磷脂酰胆碱∶胆固醇半琥珀酸酯＝0.12∶15～24∶203.3～273∶96.7～27。

组合物中各组分还可以选自如下重量份：

抗坏血酸棕榈酸酯的重量份是：6～15，6～24，15～24；

二棕榈酸磷脂酰胆碱的重量份是：203.3～225；203.3～250；203.3～273；225～250；225～273；250～275；

胆固醇半琥珀酸酯的重量份是96.7～75；96.7～50；96.7～27；75～50；75～27；50～27；

上述优选实施方案中，最优选的各组分之间的质量份比例(或重量份比例)选自：

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二棕榈酸磷脂酰胆碱∶胆固醇半琥珀酸酯＝0.12∶24∶203.3∶96.7。

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二棕榈酸磷脂酰胆碱∶胆固醇半琥珀酸酯＝0.12∶24∶250∶50。

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶二棕榈酸磷脂酰胆碱∶胆固醇半琥珀酸酯＝0.12∶24∶273∶27。

在本发明的一个优选实施方案中，各组分之间的质量份比例(或重量份比例)可以选自如下范围任意组合：

优选的抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶胆固醇＝0.06～0.21∶6～24∶203.3～273∶96.7～27。

更优选抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶胆固醇＝0.12∶6～24∶203.3～273∶96.7～27。

最优选抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶胆固醇＝0.12∶15～24∶203.3～273∶96.7～27。

组合物中各组分还可以选自如下重量份：

抗坏血酸棕榈酸酯的重量份是：6～15，6～24，15～24；

大豆磷脂的重量份是：203.3～225；203.3～250；203.3～273；225～250；225～273；250～275；

胆固醇的重量份是96.7～75；96.7～50；96.7～27；75～50；75～27；50～27；

上述优选实施方案中，最优选的各组分之间的质量份比例(或重量份比例)选自：

最优选的抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶胆固醇＝0.12∶24∶203.3∶96.7。

最优选的抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶胆固醇＝0.12∶24∶250∶50。

最优选的抗坏血酸棕榈酸酯∶大豆磷脂∶胆固醇＝0.12∶24∶273∶27。

本发明制备的棕榈酰抗坏血酸酯物脂质体，粒径为80-200nm，包封率为70％以上，棕榈酰抗坏血酸酯的载药量为0.1％～40％。

优选的处方为：粒径：100～200nm，包封率：＞85％，棕榈酰抗坏血酸酯的载药量：1％～20％。

本发明第二方面提供了一种上述棕榈酰抗坏血酸酯脂质体的制备方法，该方法包括如下步骤：

A、将处方量的棕榈酰抗坏血酸酯、磷脂类物质、胆固醇类似物溶解于有机溶剂中；

B、蒸发除去有机溶剂，在瓶壁内制得均匀的脂质薄膜；

C、干燥；

D、加入蒸馏水，使用超声将脂质薄膜洗下；

E、低温下探头超声，即得。

步骤A中，优选的有机溶剂可为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇、乙醚、四氢呋喃。更优选的溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮；最优选的有机溶剂选自三氯甲烷。

步骤B中，蒸发除去有机溶剂优选采用旋转减压的方式；优选的旋转减压蒸发时的温度选自30℃～80℃；优选的温度选自50℃～75℃；更优选的温度选自65℃～75℃；最优选的温度是70℃；

步骤C中，干燥的方式：优选采用真空干燥；干燥的温度设定为30℃～90℃；温度选自40℃～90℃；优选的温度选自50℃～85℃；更优选的温度选自70℃～80℃；最优选的温度是75℃；

步骤E中，探头超声强度及时长设定为30％～90％，10s～50s，超声1～7s停1s，循环次数为1～8次。

本发明第三方面提供了棕榈酰抗坏血酸酯脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤选自黑色素瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、口腔表皮癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、脑瘤、食管癌。

有益技术效果

本发明的棕榈酰抗坏血酸酯脂质体具有良好的包封率、载药量和稳定性。

本发明的棕榈酰抗坏血酸酯脂质体毒性降低，安全性高。提高了临床用药的安全性及有效性，具有重要的实际应用前景。

本发明的棕榈酰抗坏血酸酯脂质体的制备方法具有工艺简便、制备成本低、工艺重现性好、实验处方和工艺可放大到生产应用等特点，因而对产业化的应用具有指导意义。

附图说明

图1.棕榈酰抗坏血酸酯在MCF-7细胞中的体外药效实验。

图2.棕榈酰抗坏血酸酯在HepG-II细胞中的体外药效实验。

图3.棕榈酰抗坏血酸酯在A549细胞中的体外药效实验。

图4.棕榈酰抗坏血酸酯在SGC-7901细胞中的体外药效实验。

图5.棕榈酰抗坏血酸酯在BxPC-3细胞中的体外药效实验。

图6.棕榈酰抗坏血酸酯在Hela细胞中的体外药效实验。

图7.棕榈酰抗坏血酸酯在U251细胞中的体外药效实验。

图8.棕榈酰抗坏血酸酯在PC-3细胞中的体外药效实验。

图9.棕榈酰抗坏血酸酯在LOVO细胞中的体外药效实验。

图10.棕榈酰抗坏血酸酯在HELF细胞中的体外药效实验。

图11.PA在U87细胞中的体外药效实验。

图12.PA在HCT-116细胞中的体外药效实验。

图13.静注30mg/kg给药后抗坏血酸棕榈酸酯溶液组与脂质体组在大鼠体内的血药浓度-时间曲线。

图14.棕榈酰抗坏血酸酯的化学结构式

具体实施方式

实施例1：一种棕榈酰抗坏血酸酯脂质体配方及其制备如下：

实验方法：所述的棕榈酰抗坏血酸酯脂质体制备工艺为：将棕榈酰抗坏血酸酯、二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱、胆固醇溶解于三氯甲烷中，涡旋至完全溶解后加入500mL茄形烧瓶中，70℃旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁内制得均匀的脂质薄膜，置于真空干燥箱中75℃下干燥过夜后，加入蒸馏水，超声将脂质薄膜洗下后，冰水浴下探头超声2个循环(30％，20s，超声1s停1s)，即得。

脂质体评价方法：

脂质体的粒径的测定：采用激光粒度测定仪测定。

包封率以及载药量的测定：0.3mL的脂质体过葡聚糖凝胶柱，用生理盐水为洗脱液，分开游离的药物和脂质体后，收集脂质体组分，用甲醇破乳定容后用HPLC进行测定，计算得脂质体浓度C₁。另取0.3mL脂质体用甲醇定容到与上柱后脂质体组分相同体积，然后进样并计算得脂质体破乳后总浓度C₀。根据以下公式计算包封率(Encapsulation Efficiency， EE％)以及载药量(Drug Loading Efficiency，DLE％)：

$EE\%=\frac{C_1}{C_0}\×100\%$

实验结果：

表1.实施例1的实验结果

棕榈酰抗坏血酸酯：PA，二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱：DMPC，胆固醇：CHOL

制剂评价标准：粒径：100～200nm，包封率：＞85％，载药量：1％～20％为合格制剂

实施例2：一种棕榈酰抗坏血酸酯脂质体配方及其制备如下：

实验方法：所述的棕榈酰抗坏血酸酯脂质体制备工艺为：将棕榈酰抗坏血酸酯、大豆磷脂、谷甾醇溶解于三氯甲烷中，涡旋至完全溶解后加入500mL茄形烧瓶中，60℃旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁内制得均匀的脂质薄膜，置于真空干燥箱中35℃下干燥过夜后，加入蒸馏水，超声将脂质薄膜洗下后，冰水浴下探头超声4个循环(80％，50s，超声1s停1s)，即得。

实验结果：

表2.实施例2的实验结果

棕榈酰抗坏血酸酯：PA

制剂评价标准：粒径：100～200nm，包封率：＞85％，载药量：1％～20％为合格制剂

实施例3：一种棕榈酰抗坏血酸酯脂质体配方及其制备如下：

实验方法：所述的棕榈酰抗坏血酸酯脂质体制备工艺为：将棕榈酰抗坏血酸酯、二棕榈酸磷脂酰胆碱、胆固醇半琥珀酸酯溶解于三氯甲烷中，涡旋至完全溶解后加入500mL茄形烧瓶中，70℃旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁内制得均匀的脂质薄膜，置于真空干燥箱中75℃下干燥过夜后，加入蒸馏水，超声将脂质薄膜洗下后，冰水浴下探头超声6个循环(30％，60s，超声1s停1s)，即得。

实验结果：

表3.实施例3的实验结果

棕榈酰抗坏血酸酯：PA，二棕榈酸磷脂酰胆碱：DMPC，胆固醇半琥珀酸酯：CHOL

制剂评价标准：粒径：100～200nm，包封率：＞85％，载药量：1％～20％为合格制剂

实施例4：一种棕榈酰抗坏血酸酯脂质体配方及其制备如下：

实验方法：所述的棕榈酰抗坏血酸酯脂质体制备工艺为：将棕榈酰抗坏血酸酯、大豆磷脂、胆固醇溶解于三氯甲烷中，涡旋至完全溶解后加入500mL茄形烧瓶中，70℃旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁内制得均匀的脂质薄膜，置于真空干燥箱中65℃下干燥过夜后，加入蒸馏水，超声将脂质薄膜洗下后，冰水浴下探头超声2个循环(50％，60s，超声1s停1s)，即得。

实验结果：

表4.实施例4的实验结果

棕榈酰抗坏血酸酯：PA，胆固醇：CHOL

制剂评价标准：粒径：100～200nm，包封率：＞85％，载药量：1％～20％为合格制剂

现有文献脂质体制备并与本专利脂质体比较

实验1

参考美国东北大学的Vladimir P.Torchilin教授等人报道的棕榈酰抗坏血酸酯脂质体制剂文献，按该文献中报道的处方配比制备脂质体，并测定其包封率、粒径。

该文献中，磷脂200mg，胆固醇100mg，棕榈酰抗坏血酸酯150mg按本专利涉及的制备方法进行制备。

实验结果：制备过程中，在加入蒸馏水，超声洗脂质薄膜时，有明显颗粒析出，无法继续制备。

药理实验

实验例1：棕榈酰抗坏血酸酯的体外药效实验

MTT法测定肿瘤细胞活性

取对数生长期的细胞株经0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，以3×10³个/mL的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，置于37℃、5％CO₂培养箱中无菌培养箱中培养24h，待细胞充分贴壁后，去除原有的培养液，每孔加入用培养液配置的不同浓度棕榈酰抗坏血酸酯100μL。对照组加入含0.1％DMSO的培养液，37℃培养48h。培养结束后吸弃药液，每孔加入PBS 100μL洗去残留的药液，每孔加入含10％5mg/mL MTT工作液培养液100μL，37℃继续培养4h。吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min以充分溶解结晶物，在酶标仪570nm下测定OD值，按下列公式计算给予药物后肿瘤细胞的存活率，并采用SPSS数据处理软件计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

根据各浓度药物的抑制率，应用SPSS统计分析软件计算半数抑制浓度IC50。

上述细胞株选自：人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株HepG-II、人肺癌细胞株A549、人胃癌细胞株SGC-7901、人原位胰腺腺癌细胞株BxPC-3、人宫颈癌细胞株Hela、人胶质瘤细胞株U251、人前列腺癌细胞株PC-3、人结肠癌细胞株LOVO、人肺成纤维细胞株HELF、人脑胶质瘤细胞U-87、人结肠癌细胞HCT-116。

PA对人乳腺癌细胞株MCF-7的作用结果见图1。

PA对人肝癌细胞株HepG-II的作用结果见图2。

PA对人肺癌细胞株A549的作用结果见图3。

PA对人胃癌细胞株SGC-7901的作用结果见图4。

PA对人原位胰腺腺癌细胞株BxPC-3的作用结果见图5。

PA对人宫颈癌细胞株Hela的作用结果见图6。

PA对人胶质瘤细胞株U251的作用结果见图7。

PA对人前列腺癌细胞株PC-3的作用结果见图8。

PA对人结肠癌细胞株LOVO的作用结果见图9。

PA对人肺成纤维细胞株HELF的作用结果见图10。

PA对人脑胶质瘤细胞U-87的作用结果见图11。

PA对人结肠癌细胞HCT-116的作用结果见图12。

表1.棕榈酰抗坏血酸酯在不同细胞株中的IC₅₀值

药动学实验

实验例1：棕榈酰抗坏血酸酯脂质体与棕榈酰抗坏血酸酯溶液的药动学性质比较

取大鼠6只，按体重随机分成两组，每组三只大鼠，按30mg/kg剂量静注给予6mg/mL棕榈酰抗坏血酸酯溶液(大鼠编号为No.1、No.2、No.3)、棕榈酰抗坏血酸酯脂质体(大鼠编号为No.4、No.5、No.6)，分别于给药前约0.25h和给药后0.083h、0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、24h取血，约200μL至肝素化试管中，于8000rpm离心5min，分离出血浆，于-80℃保存供测试。

表2.大鼠静注给予30mg/kg棕榈酰抗坏血酸酯溶液后的血药浓度(μg/L)

表3.大鼠静注给予30mg/kg棕榈酰抗坏血酸酯溶液后大鼠体内的药代动力学参数

表4.大鼠静注给予30mg/kg棕榈酰抗坏血酸酯脂质体后的血药浓度(μg/L)

表5大鼠静注给予30mg/kg棕榈酰抗坏血酸酯脂质体后大鼠体内的药代动力学参数

实验结果：见图13和表2-5。药动参数表明，静注给予大鼠同样剂量的抗坏血酸棕榈酸酯溶液和脂质体后，脂质体组的半衰期为溶液组的4倍，表明脂质体减缓了药物释放，延长了药物的作用时间，增强了药效。