本发明涉及兔尾草属植物的加工改良，其中通过在对所采收的兔尾草属植物进行一视需要的提取处理之前，先于35℃至45℃的温度下对该兔尾草属植物进行一烘干处理，从而提升该兔尾草属植物或其提取物的活性成分含量、药材化学成分组成一致性及/或治疗效益。本发明也涉及由前述加工改良方法所获得的兔尾草属植物或其提取物
背景技术：
：：兔尾草(urariacrinita(l.)desv.exdc.)、大叶兔尾草(urarialagopodioides(l.)desv.exdc.)、羽叶兔尾草(urariapicta(jacq.)desv.exdc.)、圆叶兔尾草(urarianeglectaprain)等兔尾草属植物(urariaspp.)是常见用于开脾健胃、止咳润喉、去除疳积、治疗腹泻、治疗小儿发育不良、解毒、消肿及治疗跌打损伤的中药材。文献指出，兔尾草属植物(urariaspp.)也具有良好的抗发炎、镇痛、抗菌、抗氧化、清除一氧化氮自由基、驱虫、杀虫等功效。目前已于例如印度、泰国、印度尼西亚、中国南部、以及台湾地区等地区发现野生的兔尾草属植物，其中，在台湾更已通过人工栽培的方式种植兔尾草属植物，以满足中药材市场的大量需求。已知，提升中药材质量的一致性乃提高临床疗效一致性的重要手段之一。先前的研究指出，中药材活性成分含量的变异会影响药材的质量与疗效，且普遍认为药材中活性成分含量的变化是来自于许多农业上的因素，包括种植及采收。然而，这些研究忽视了采收后的加工方法对于药材质量的影响。中药材的质量除与品种、生长年限、生长环境、产地、气候、采收季节等有关之外，产地初加工(primaryprocessing)也是影响中药材质量的重要因素，其中，不同烘干方法对于药材质量的影响，在产地初加工的环节中长期被忽略。中药材铺采收时，含水量较高，若不及时加工处理，很容易霉烂质变，严重影响药材的质量、临床疗效以及药农的经济效益。以药材的干燥加工为例，传统依赖太阳晒干或阴干的干燥方法，效率低下，且未及时干燥或者干燥条件不一致等原因造成阴干与晒干的干燥方法存在较大偏差，因而影响药材质量。为防止药材霉变与腐败，部分农民采用硫磺熏蒸的方式进行加工，易造成二氧化硫残留量超标，危害人体健康。目前，兔尾草属植物在采收后皆由农民直接在产地进行加工处理，由于并没有良好的炮制加工规范，各地农民在采收后所采取的加工方法及条件不一，此导致异质产生(heterogeneousness)，严重影响药材中的生物活性与活性成分含量，造成兔尾草属植物中药材的质量不稳定，不利于相关疾病的治疗与控制，此可参见例如：productionofsalvianolicacidbinrootsofsalviamiltiorrhiza(danshen)duringthepost-harvestdryingprocess.molecules,2012.17(3):p.2388-407的文献。因此，在使用兔尾草属植物中药材于疾病治疗的应用层面上，如何标准化兔尾草属植物中药材于采收后的加工方法，以提高兔尾草属植物的活性成分含量与治疗效益，确保药材的安全性及有效性，乃本领域亟待解决的一大课题。本发明即针对上述需求所为的研究成果，提供一种可以有效提升兔尾草属植物或其提取物的活性成分含量、药材化学成分组成一致性及/或治疗效益的方法，尤其是提升其中的胺基酸、黄酮类、三萜类、甜菜碱及水杨酸的含量。此外，本发明所提供的兔尾草属植物或其提取物具有优异的雌激素刺激活性、nrf2刺激活性及/或cox-2抑制活性，因此可用于治疗或预防与雌激素活性、nrf2活性及/或cox-2活性相关的疾病。技术实现要素：本发明的一目的，在于提供一种提升兔尾草属植物(urariaspp.)或其部分或前述的提取物的活性成分含量、药材化学成分组成一致性及/或治疗效益的方法，其包括于对所采收的兔尾草属植物进行一视需要的提取处理之前，先对该兔尾草属植物进行一烘干处理，其中该烘干处理是于35℃至45℃的温度下进行。其中该兔尾草属植物是选自以下的至少一者：兔尾草、大叶兔尾草、羽叶兔尾草、圆叶兔尾草、勐腊兔尾草、喜树兔尾草、南岭兔尾草、半枝莲兔尾草、蝙蝠草、白花兔尾草、野翻豆、越南兔尾草、算珠豆、长穗兔尾草、柱状兔尾草、福建狸尾草、高斯兔尾草、克氏兔尾草、掸邦兔尾草、狸尾草、拉高珀斯兔尾草、长苞狸尾豆、皮氏兔尾草、玻蓝兔尾草、普鲁内立福立亚兔尾草、泰国圆叶狸尾豆、钩柄狸尾豆、及中华兔尾草。其中该兔尾草属植物的部分为根部、茎部、叶部及/或花部。其中该烘干处理是于约40℃的温度下进行。其中该活性成分是选自以下的至少一者：胺基酸、黄酮类、三萜类、甜菜碱及水杨酸。其中该胺基酸为异白胺酸、苏胺酸、精胺酸、天门冬胺酸、天门冬酰胺酸、酪胺酸、色胺酸及苯丙胺酸中至少一者，该黄酮类为芹菜素苷及红血藤苷a中至少一者。其中该方法是用于提升兔尾草属植物或其部分或前述的提取物于以下的一或多者的效益：开脾健胃、止咳润喉、去除疳积、治疗腹泻、治疗小儿发育不良、解毒、消肿、治疗跌打损伤、抗发炎、镇痛、抗菌、抗氧化、驱虫及杀虫。本发明的另一目的，在于提供一种以上述方法所获得的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物。本发明的又一目的，在于提供一种使用上述所获得的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物于制造一药剂的用途，其中该药剂是用于刺激雌激素活性、刺激核因子e2相关因子2(nuclearerythroid2-relatedfactor2，nrf2)活性及/或抑制环氧化酶-2(cycloxygenase-2，cox-2)活性。其中该药剂是用于治疗或预防以下的一或多者：骨质疏松症、帕金森氏症、阿兹海默症、亨汀顿氏舞蹈症、肥胖症、中风、心脏肥大、心肌细胞凋亡、心肌纤维化、心脏衰竭、肝脏损伤、肝脏纤维化、肾脏损伤、糖尿病、癌症及肿瘤。本发明的详细技术内容及部分具体实施方式，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域的普通技术人员据以明了本发明的特征。附图说明图1显示经不同方法加工后的兔尾草药材的1h-nmr图谱。图2显示对经不同方法加工后的兔尾草药材的代谢物进行主成分分析(pca)的结果的落点图。图3显示分别以40℃、55℃或70℃进行烘干的兔尾草药材的1h-nmr图谱。图4显示以主成分分析(pca)对于以不同温度(40℃、55℃、70℃)进行烘干的兔尾草药材的代谢物进行分析的结果的落点图。图5显示以主成分分析(pca)对兔尾草药材的不同加工样本进行化学成分一致性比较的结果的落点图。图6显示经不同条件处理的第一批次与第二批次兔尾草药材的雌激素活性(％)直方图。图7显示经不同条件处理的第一批次与第二批次兔尾草药材的nrf2刺激活性(％)直方图。图8显示经不同条件处理的第一批次与第二批次兔尾草药材的cox-2抑制活性(％)直方图。图9显示经不同条件处理的第一批次与第二批次兔尾草药材的dpph自由基清除率(％)直方图。图10显示经不同条件处理的第一批次与第二批次兔尾草药材的teac值(微克/毫升)直方图。具体实施方式以下将描述根据本发明的部分具体实施例；但是，在不背离本发明精神下，本发明尚可以多种不同形式的形态来实践，不应将本发明的保护范围解释为限于说明书所陈述的。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓“治疗”是指减轻一个体的疾病或症状，也可以指减少引起该疾病或病原本身的原因，而不限于使该疾病或病原完全消除；所谓“预防”是指抑制或防止一疾病或症状的发生。已知兔尾草属植物(urariaspp.)含有胺基酸、黄酮类、三萜类、甜菜碱及水杨酸等主要活性成分，可用于开脾健胃、止咳润喉、去除疳积、治疗腹泻、治疗小儿发育不良、解毒、消肿及治疗跌打损伤，且具抗发炎、镇痛、抗菌、抗氧化、驱虫、杀虫等功效。然而，目前在兔尾草属植物产地所采用的采收后加工方式不一，此造成兔尾草属植物药材的质量不稳定，不利于疾病的治疗与控制。有鉴于此，若能找出提高兔尾草属植物的活性成分含量的标准化方法，甚至提高药材化学成分组成的一致性，将可有效提升兔尾草属植物在疾病治疗的应用，提高兔尾草属植物的治疗效益。本发明人研究后发现，对于所采收的兔尾草属植物，若以35℃至45℃进行烘干处理相较于在22℃至25℃的阴干处理、在22℃至28℃的晒干处理、在55℃或70℃的烘干处理可明显提升兔尾草属植物的胺基酸、黄酮类、三萜类、甜菜碱及水杨酸等活性成分的含量，且可提升兔尾草属植物的药材化学成分组成的一致性。本发明人并发现，根据本发明方法所提供的兔尾草属植物，除具有提升的dpph自由基清除能力以及teac总抗氧化能力以外，另外具有雌激素刺激活性、核因子e2相关因子2(nuclearerythroid2-relatedfactor2，nrf2)刺激活性以及环氧化酶-2(cycloxygenase-2，cox-2)抑制活性。因此，本发明提供一种提升兔尾草属植物(urariaspp.)或其部分或前述的提取物的活性成分含量、药材化学成分组成一致性及/或治疗效益的方法，其包括于对所采收的兔尾草属植物进行一视需要的提取处理之前，先对该所采收的兔尾草属植物进行一烘干处理，其中该烘干处理是于35℃至45℃的温度下进行。通过上述于35℃至45℃的烘干处理，可提高以下活性成分的至少一者在该兔尾草属植物或其部分或前述的提取物中的含量：胺基酸、黄酮类、三萜类、甜菜碱及水杨酸。其中，该胺基酸为异白胺酸(isoleucine，ile)、苏胺酸(threonine，thr)、精胺酸(arginine，arg)、天门冬胺酸(aspatate，asp)、天门冬酰胺酸(asparagine，asn)、酪胺酸(tyrosine，tyr)、色胺酸(tryptophan，trp)及苯丙胺酸(phenylalanine，phe)中的至少一者，该黄酮类为芹菜素苷(apigeninglycosides)及红血藤苷a(spatholosinesidea)中的至少一者。由于本发明方法可提高胺基酸、黄酮类、三萜类、甜菜碱及水杨酸等活性成分在所采收的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物的含量，因此可提升该兔尾草属植物或其部分或前述的提取物于以下的一或多者的效益，但不以此为限：开脾健胃、止咳润喉、去除疳积、治疗腹泻、治疗小儿发育不良、解毒、消肿、治疗跌打损伤、抗发炎、镇痛、抗菌、抗氧化、驱虫及杀虫。本发明方法可适用于任何合宜的兔尾草属植物，包括例如：兔尾草(urariacrinita(l.)desv.exdc.)、大叶兔尾草(urarialagopodioides(l.)desv.exdc.)、羽叶兔尾草(urariapicta(jacq.)desv.exdc.)、圆叶兔尾草(urarianeglectaprain)、勐腊兔尾草(urariaacaulisschindl.)、喜树兔尾草(urariaacuminatakurz)、南岭兔尾草(urariabalansaeschindl.)、半枝莲兔尾草(urariabarbatalace)、蝙蝠草(urariacampanulata(benth.)gagnep.)、白花兔尾草(urariacandidabacker)、野翻豆(urariaclarkeigagnep.)、越南兔尾草(urariacochinchinensisschindl.)、算珠豆(urariacordifoliawall.)、长穗兔尾草(urariacrinita(l.)dc.)、柱状兔尾草(urariacylindraceabenth.)、福建狸尾草(urariafujianensisy.c.yang&p.h.huang)、高斯兔尾草(urariagossweileribakerf.)、克氏兔尾草(urariakurziischindl.)、掸邦兔尾草(urarialaceicraib)、狸尾草(urarialagopodoides(l.)dc.)、拉高珀斯兔尾草(urarialagopusdc.)、长苞狸尾豆(urarialongibracteatay.c.yang&p.h.huang)、皮氏兔尾草(urariapierreischindl.)、玻蓝兔尾草(urariapoilaneiphon)、普鲁内立福立亚兔尾草(urariaprunellifoliabaker)、泰国圆叶狸尾豆(urariarotundatacraib)、钩柄狸尾豆(urariarufescens(dc.)schindl.)及中华兔尾草(urariasinensis(hemsl.)franch)。较佳地，使用本发明方法于兔尾草(urariacrinita(l.)desv.exdc.)、大叶兔尾草(urarialagopodioides(l.)desv.exdc.)、羽叶兔尾草(urariapicta(jacq.)desv.exdc.)及圆叶兔尾草(urarianeglectaprain)。根据本发明方法，兔尾草属植物的使用部位并无特殊限制，可为兔尾草属植物全株植物或兔尾草属植物不同部位，例如兔尾草属植物的根部、茎部、叶部及/或花部。于本发明的部分具体实施例中，使用兔尾草属植物的根部以制备兔尾草属植物中药材。于本发明方法中，所使用的烘干温度较佳为约40℃。此外，可在烘干处理之后，对该兔尾草属植物进行一提取处理，以提供一兔尾草属植物提取物。因此，本发明又提供一种以本发明上述方法所获得的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物。其中，该提取物较佳为使用极性溶剂(例如醇类、水或者醇类和水的混合液)对兔尾草属植物或其部分进行提取所得的。举例而言，该极性溶剂可为c1-c6醇类(例如，甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、丁醇、异丁醇、丁二醇、戊醇、异戊醇、己醇、环己醇等)、水或前述的组合。更佳的，该极性溶剂选自c1-c4醇类、水及前述的组合。于本发明部分具体实施例中，以乙醇作为提取溶剂。如前述，根据本发明的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物含有胺基酸、黄酮类、三萜类、甜菜碱及水杨酸等活性成分，其中该胺基酸为异白胺酸(isoleucine，ile)、苏胺酸(threonine，thr)、精胺酸(arginine，arg)、天门冬胺酸(aspatate，asp)、天门冬酰胺酸(asparagine，asn)、酪胺酸(tyrosine，tyr)、色胺酸(tryptophan，trp)及苯丙胺酸(phenylalanine，phe)中的至少一者，该黄酮类为芹菜素苷(apigeninglycosides)及红血藤苷a(spatholosinesidea)中的至少一者。此外，根据本发明方法所提供的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物具有多种生物活性，包括雌激素刺激活性、nrf2刺激活性及cox-2抑制活性。已知提高雌激素活性可达到治疗或预防骨质疏松症、帕金森氏症、阿兹海默症、心血管疾病、肥胖症、中风等功效。因此，具有雌激素刺激活性的兔尾草属植物或其提取物也可用于治疗或预防如前述与雌激素活性密切相关或因雌激素低下所引发的疾病。此可参见例如：estrogenreceptorsandhumandisease.jclininvest.2006mar；116(3):561-70的文献。已知提高nrf2/are(nuclearerythroid2-relatedfactor2/antioxidantresponsiveelement)的信息传导路径的活性可达到治疗或预防帕金森氏症、阿兹海默症、亨汀顿氏舞蹈症、中风、心血管疾病(中风、心脏肥大、心肌细胞凋亡、心肌纤维化、心脏衰竭)、肝脏损伤、肝脏纤维化、肾脏损伤、糖尿病等功效。因此，具有nrf2刺激活性的兔尾草属植物或其提取物也可用于治疗或预防如前述与nrf2/are的信息传导路径活性密切相关或因nrf2/are的信息传导路径活性低下所引发的疾病。此可参见例如：naturalproduct-derivedpharmacologicalmodulatorsofnrf2/arepathwayforchronicdiseases.natprodrep.2014jan；31(1):109-39的文献以及targetingthenrf2pathwayagainstcardiovasculardisease.expertopinthertargets.2009jul；13(7):785-94的文献。研究指出，cox-2在大多数正常的身体组织、细胞中并不会表现，但在各种癌症病患的体内都能够检测到cox-2的活性。因此，cox-2的活化与癌症及肿瘤的发展密切相关，若能抑制cox-2活性，即可达到抗癌、抗肿瘤的效果。此可参见例如chemopreventioningastrointestinalphysiologyanddisease.anti-inflammatoryapproachesforcolorectalcancerchemoprevention.amjphysiolgastrointestliverphysiol.2015jul15；309(2):g59-70.doi:10.1152/ajpgi.00101.2014.epub2015may28的文献。因此，具有cox-2抑制活性的兔尾草属植物或其提取物也可用于抗癌及抗肿瘤。因此，本发明也提供一种使用上述方法所获得的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物于制造一药剂的用途，其中该药剂是用于刺激雌激素活性、刺激nrf2活性及/或抑制cox-2活性。此外，该药剂也可用于治疗或预防以下的一或多者，但不以此为限：骨质疏松症、帕金森氏症、阿兹海默症、亨汀顿氏舞蹈症、肥胖症、中风、心脏肥大、心肌细胞凋亡、心肌纤维化、心脏衰竭、肝脏损伤、肝脏纤维化、肾脏损伤、糖尿病、癌症及肿瘤。使用本发明的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物所制造的药剂可以呈任何合宜的形式，并无特殊的限制。举例言之，但不以此为限，该药物可以口服或非口服(例如皮下、静脉内、肌肉、腹腔或鼻腔)的投药方式施用至有需要的个体上。根据使用形式及用途而定，可选用合宜的载剂以提供该药剂。以适于口服投药的剂型为例，本发明所提供的药剂可含有任何不会不利影响本发明的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物的所欲效益的医药上可接受的载剂，例如：溶剂(水、食盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其类似物及前述的组合物)、油性溶剂、稀释剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、结合剂、增黏剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂、吸湿剂、固体载剂(例如淀粉、皂土(bentonite))等。可利用任何合宜的方法，以适于口服投药的剂型提供该药剂，例如：锭剂(例如糖衣锭)、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、乳剂及酊剂等。至于适于皮下、静脉内、肌肉或腹腔注射的注射剂型或点滴剂型，则可于本发明所提供的药剂中含有一或多种例如等张溶液、盐类缓冲液(如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)、增溶剂、乳化剂、5％糖溶液以及其他载剂等成分，以静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂或干粉悬液注射剂等剂型提供该药剂。或者，将该药剂制备成一注射前固体，以可溶于其他溶液或悬浮液中的剂型或可乳化的剂型提供该注射前固体，并于投予至该有需要的个体之前，将该注射前固体溶于其他溶液或悬浮液中或将其乳化，提供所欲的注射剂。此外，适于经鼻腔或经皮肤投予的外用剂型，则例如乳液、乳霜、凝胶(例如水凝胶)、膏状物(例如分散膏、软膏)、喷雾剂或溶液(例如洗液、悬浮液)。视需要地，可于本发明所提供的药剂中另外含有合宜用量的添加剂，例如可提高该药剂于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该药剂的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。此外，该药剂可根据需要另外含一或多种其他活性成分，或者与含该一或多种其他活性成分的药物并用，以进一步加强该药剂的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分不会对本发明的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物的所欲效益有不利的影响即可。使用本发明兔尾草属植物或其部分或前述的提取物所制造的药剂的用量，可根据所施用对象的年纪及施用目的而加以调整，也可根据需要调整使用频率。该药剂也可含有其它成分，端视根据药剂之最终形式与使用目的而定。原则上，只要所添加的其它成分的种类及含量，不会对本发明的兔尾草属植物或其部分或前述的提取物的所欲功效有不利的影响即可。现以下列实施例进一步例示说明本发明。其中该实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围应根据权利要求所示。实施例制备实施例a.兔尾草属植物的采收与加工以下实施例所使用的兔尾草属植物，采集自台湾南投名间乡同一地区的农田所种植的兔尾草(urariacrinita(l.)desv.exdc.)，共采收两个批次，第一批次于十月采收，第二批次于十一月采收，该两个批次的兔尾草标本(lms-1001)皆存放于中国医药大学的中国药学暨中药资源学系。上述第一批次的兔尾草采收后，取其根部并快速以水清洗，接着分成三组，再分别以如下条件进行干燥处理，以提供兔尾草药材：(1)晒干组：于户外(户外室温约为22℃-28℃)曝晒进行，历时5-7天；(2)阴干组：于阴暗处(户外室温约为22℃-25℃)，进行风干，历时12-14天；以及(3)烘干组：于烘箱中，以40℃进行烘干，历时2天。同样地，上述第二批次兔尾草于采收后，取其根部并快速以水清洗，接着分成三组，但分别以如下条件进行干燥处理，以提供兔尾草药材：(1)40℃烘干组：于烘箱中，以40℃进行烘干，历时2天；(2)55℃烘干组：于烘箱中，以55℃进行烘干，历时2天；以及(3)70℃烘干组：于烘箱中，以70℃进行烘干，历时2天。b.兔尾草属植物药材及其提取b-1.将取自制备实施例a.所提供的各组兔尾草药材磨碎，获得兔尾草药材粉末以供后续实验分析。b-2.针对上述b-1各组的药材粉末分别进行如下处理。取100克的药材粉末，浸泡于500毫升的50％乙醇中，历时7天；重复前述的乙醇提取步骤，共三次；合并三次提取所得的提取液，并进行减压浓缩以去除乙醇，获得兔尾草提取液，并以50％的乙醇配制成浓度为1毫克/毫升的实验剂量，以供后续实验分析。c.1h-核磁共振光谱(1h-nuclearmagneticresonancespectroscopy，1h-nmr)分析c-1.准备待测样本取上述b-1.所提供的各组兔尾草药材粉末，各组取50毫克至微量离心管(eppendorf)中，并分别进行以下待测样本准备步骤：(i)于微量离心管中加入0.75毫升的氘代甲醇(ch3oh-d4)以及0.75毫升的磷酸盐缓冲溶液(含90mm的磷酸二氢钾(kh2po4)磷酸盐缓冲溶液，以1mnaod将ph调整至6.0，其中，以0.01％的磷酸三钠盐(trisodiumphosphate，tsp)作为内标，以d2o作为溶剂)；(ii)于室温下，将微量离心管进行涡旋(vortex)，历时1分钟；(iii)于298k(即，25℃)下，以超音波震荡仪进行震荡，历时30分钟；(iv)于298k(即，25℃)下，以进行10分钟离心(转速为13,200rpm)；(v)将600微升的上清液移入5mm的nmr管(tube)中待测(前述可参见例如nmr-basedmetabolomicanalysisofplants.natprotoc.2010.5(3):p.536-49的文献，并视需要进行修改)。c-2.分析步骤与条件：将上述c-1所提供的装有待测样样品的各组nmr管置于bruker600mhz核磁共振仪(brukeravance600av)中，搭配低温探头(cryoprobe5mmcptxi(1h))，于298k(即，25℃)下采集光谱。为获得高质量的核磁共振光谱，实验进行时皆采取手动锁场(manuallocking)以及手动匀场(manualshimming)，并利用tsp的半高宽(fwhm)大小来决定磁场均匀度。于实验过程中收集样本的压制水峰单脉冲(standardone-pulsesequencewithwatersaturation，zggppr)序列，其中，将线宽因子(lb)设定为0.3hz，且各样本的tsp半高宽皆必须≦1.8hz为通过标准，以确保图谱质量。实验条件：扫描次数(ns)＝128、空扫次数(ds)＝0、采样点数(td)＝32kdatapoints、谱宽(spectralwidth)＝20ppm、弛豫时间(rd)＝2.0秒、采样时间(acquisitiontime)＝1.36秒、90度脉冲(90°pulselength)约10.5μs，依各样本调整。为指认兔尾草药材的代谢物，进行了2d-nmr图谱采集，包括cosy(1h-1hcorrelationspectroscopy)、tocsy(1h-1htotalcorrelationspectroscopy)、jres(j-resolvedspectroscopy)、hsqc(1h-13cheteronuclearsingle-quantumcoherence)以及hmbc(heteronuclearmultiplebondcorrelation)，上述步骤与条件可参见例如：combinednmrandlc-dad-msanalysisrevealscomprehensivemetabonomicvariationsforthreephenotypiccultivarsofsalviamiltiorrhizabunge.jproteomeres.2010.9(3):p.1565-78的文献以及combinednmrandlc-msanalysisrevealsthemetabonomicchangesinsalviamiltiorrhizabungeinducedbywaterdepletion.jproteomeres.2010.9(3):p.1460-75的文献。c-3.数据处理与多元统计分析：将1hnmr的自由感应衰减(freeinductiondecay，fid)原始数据乘以线宽因子(lb)为0.3hz的窗函数，零填充(werezero-fille)为65536points，再进行复立叶转换(fouriertransform)。接着，进行手动相位校正(manuallyphasecorrection)及手动基线校正(manuallybaselinecorrection)，利用mestrenova(version8.0.2，mestrelabresearchs.l.)以tsp(δ＝0.00ppm)作为内标校正化学位移，并对校正后的图谱进行积分(binning)及归一化(normalization)。每段积分区间大小为0.005ppm，积分范围为δ0.04–10.0ppm，共得1992个积分区间。其后，除去甲醇(δ3.300–3.400)及水峰信号(δ4.500–5.000)，并对峰面积进行总面积规一化方法(totalareanormalization)，以消除样本之间含水量及取样量所造成的浓度差异。将积分后的数据矩阵导入多变量分析软件(simca-pversion13.0，瑞典，于默奥(umea)，umetrics公司)进行分析，并采用pareto(par)标度化方法进行多变量统计分析，以进行主成分分析(pca)。其中，拟合(fitting)模型的质量好坏则利用r2值(r2value)及q2值(q2value)作为判断依据，r2值表示在某方向上的可解释变量占总变量的比例(totalamountvariationexplainedbythemodel)，q2值则表示模型的预测能力(predictabilityofthemodelundercrossvalidation)。上述数据处理与多元统计分析的方法可参见例如：gallicacidamelioratedimpairedglucoseandlipidhomeostasisinhighfatdiet-inducednafldmice.plosone.2014.9(2):p.e96969以及gutmicrobiotacompositionmodifiesfecalmetabolicprofilesinmice.jproteomeres.2013.12(6):p.2987-99的文献。c-4.代谢物结构鉴定：通过文献比对、代谢物数据库比对、标准品比对以及2dnmr波谱确认(包括jres、cosy、hsqc、tocsy、及hmbc)，指认所测样品中的代谢物。分析所得数据是以平均值±标准误差(mean±se)表示(如表2、表3)。至于代谢组数据的部分，则采用单因子变异数分析(onewayanalysisofvariance，anova)，并以bonferroni分析技术进行事后比较检定(posthoctest)，以p<0.05作为具有统计学意义的界限。d.质粒(plasmid)构建与细胞转染d-1.质粒构建pere-luc质粒：将合成的四重复雌激素反应组件(estrogenresponseelements，ere:5’-ggtcacagtgaccta-3’，序列编号：seqidno:1)克隆(clone)到pgl4质粒(promega公司，madison,wiusa)中的萤火虫荧光素酶(fireflyluciferasegene)报道基因的上游，获得pere-luc质粒。per-α质粒：克隆er-α基因全长cdna，到pcdna质粒(promega公司，madison,wiusa)中的cmv启动子的下游，获得per-α质粒。nrf2-luc质粒：将四个重复抗氧化反应组件(antioxidantresponseelement，are:5’-ggtcacagtgacc-3’，序列编号：seqidno:2)克隆到pgl4质粒中，获得nrf2-luc质粒。d-2.细胞转染将pere-luc质粒以及per-α质粒同时稳定转染至人胚肾细胞(humanembryonickidney293cell，hek-293cell，购买自美国模式菌种收集中心(americantypeculturecollection(atcc)，美国马纳萨斯(manassas,va,usa))中，建立稳定转染的per-α-luchek-293细胞株。另外，将nrf2-luc质粒稳定转染至hek-293细胞中，建立稳定转染的pnrf2-luchek-293细胞株。d-3.细胞培养于37℃、5％co2的条件下，将per-α-luchek-293细胞株以及pnrf2-luchek-293细胞株分别培养于含10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)及100微克/毫升kanamycin之dmem培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium，购自美国lifetechnologies公司，型号：gibco11965)中。其中，per-α-luchek-293细胞株于接种前，先以pbs清洗，加入含5％经活性炭/葡聚醣处理的胎牛血清(charcoaldextran-treatedfbs，cdfbs)的无酚红dmem培养基(dmemwithoutphenolred，购自美国lifetechnologies公司，型号：gibco21063)中，使细胞饥饿(starvation)，历时2天。接着，将per-α-luchek-293细胞株接种于96孔盘中，每孔接种40000个细胞。pnrf2-luchek-293细胞株则以含10％fbs的dmem培养基接种于96孔盘中，每孔接种20000个细胞。实施例1：不同加工方法对兔尾草药材活性成分的影响1-1.代谢物分析为了解不同加工方法对所采收的兔尾草药材的影响，首先对晒干组、阴干组、烘干组的兔尾草药材进行1h-nmr代谢物分析，结果示于图1及表1。其中，(a)为晒干组，温度为22-28℃；(b)为阴干组，温度为22-25℃；(c)为烘干组，温度为40℃；「各阿拉伯数字」所代表的代谢物名称示于表1。如表1所示，于兔尾草药材中共指认出33种代谢物，可分为初级以及次级代谢物，且其结构包括胺基酸、有机酸、醣类、核酸、胺类、三萜类(triterpenoids)、黄酮类(flavonoids)、酚酸(phenolicacids)等。如图1所示，无论是相较于阴干组或晒干组，烘干组的兔尾草药材的胺基酸、脂质及三萜类的信号皆明显上调1至3ppm，且黄酮类、酚酸类及芳香族胺基酸的信号明显上调6至9ppm，而醣类信号则明显下调3至6ppm。前述结果显示，40℃烘干进行干燥处理所提供的兔尾草药材的胺基酸、脂质、三萜类、黄酮类及酸类的含量均较高。表1注1：加拿大chenomx公司，chenomxnmrsoftwaresuite，版本7.6。注2：stimulationofosteogenicactivityinhumanosteoblastcellsbyedibleurariacrinita.jagricfoodchem.2014.62(24):p.5581-8。1-2.代谢组分析以主成分分析(pca)对晒干组、阴干组、烘干组的兔尾草药材代谢组进行数据多变量统计分析，结果示于图2。图2包括「晒干组」、「阴干组」、以及「烘干组」，其中x轴可明显区分出烘干组与其他组别，显示经由烘干处理之兔尾草药材的化学成分组成与其他组别具有显著差异。由图2可知，烘干组、晒干组及阴干组的兔尾草药材的第一主成分(pc1)可明显地区分，且第一主成分(pc1)及第二主成分(pc2)累加的解释率(r2x)为0.759，预测率(q2)为0.675，表示模型良好。其中，烘干组的兔尾草药材的成分与晒干组及阴干组两组的兔尾草药材的成分明显差异分群，而阴干组与晒干组的兔尾草药材的成分则无明显分群。前述结果显示，烘干组的兔尾草药材与阴干组及晒干组两组的兔尾草药材药材之间的代谢物组成具明显差异。1-3.代谢物半定量筛选由实施例1-2的结果可知，烘干组的兔尾草药材的代谢物组成与晒干组及阴干组两组具明显差异，因此对代谢物锋面的积分值进行半定量，以了解烘干组的兔尾草药材与晒干组及阴干组两组兔尾草药材之间的差异性代谢物，结果示于表2。表2注a：结果系以平均值±标准误差(mean±se)表示，并以独立样本t检定(independent-samplet-test)以及单因子变异数分析(one-wayanova)进行统计分析，以bonferroni分析技术进行事后比较检定(posthoctest)，且以p<0.05作为具有统计学意义的界限。注b：烘干组与阴干组，p<0.05。注c：烘干组与晒干组，p<0.05。注d：阴干组与晒干组，p<0.05。由表2可知，相较于晒干组、阴干组两组，烘干组的兔尾草药材的胺基酸(异白胺酸、缬胺酸、苏胺酸、丙胺酸、精胺酸、天门冬胺酸、酪胺酸、色胺酸、苯丙胺酸)、有机酸(水杨酸、甲酸)、甜菜碱、三萜类及黄酮类(芹菜素苷、红血藤苷a)的量明显较高，而醣类(葡萄糖、蔗糖)及胆碱的量则明显较低。上述结果显示，相较于晒干处理或阴干处理，烘干处理可明显提升兔尾草药材中胺基酸(异白胺酸、缬胺酸、苏胺酸、丙胺酸、精胺酸、天门冬胺酸、酪胺酸、色胺酸、苯丙胺酸)、有机酸(水杨酸、甲酸)、甜菜碱、三萜类、及黄酮类(芹菜素苷、红血藤苷a)等活性成分的含量。实施例2：不同烘干温度对兔尾草药材活性成分的影响2-1.代谢物分析分别对40℃烘干组、55℃烘干组、70℃烘干组兔尾草药材进行1h-nmr代谢物分析，结果示于图3。其中，信号越强表示含量越高。如图3所示，相较于55℃烘干组或70℃烘干组，40℃烘干组兔尾草药材的胺基酸、三萜类及黄酮类的含量明显上升，而醣类含量则明显下降。2-2.代谢组分析以主成分分析(pca)对40℃烘干组、55℃烘干组、70℃烘干组兔尾草药材的代谢物进行分析，结果示于图4。由图4可知，40℃烘干组的兔尾草药材的成分与55℃烘干组及70℃烘干组两组兔尾草药材的成分明显差异分群，而55℃烘干组与70℃烘干组兔尾草药材的成分则无明显分群。前述结果显示，40℃烘干组兔尾草药材与55℃烘干组及70℃烘干组两组兔尾草药材药材之间的代谢物组成具明显差异。2-3.代谢物半定量筛选由实施例2-2的结果可知，40℃烘干组的兔尾草药材的代谢物组成与非40℃烘干组(包含55℃烘干组与70℃烘干组)具明显差异，因此对代谢物锋面的积分值进行半定量，以了解40℃烘干组与非40℃烘干组(包含55℃烘干组与70℃烘干组)之间的差异性代谢物，结果示于表3。表3注a：结果是以平均值±标准误差(mean±se)表示，并以独立样本t检定(independent-samplet-test)以及单因子变异数分析(one-wayanova)进行统计分析，以bonferroni分析技术进行事后比较检定(posthoctest)，且以p<0.05作为具有统计学意义的界限。注b：55℃烘干组与70℃烘干组，p<0.05。注c：40℃烘干组与70℃烘干组，p<0.05。注d：40℃烘干组与55℃烘干组，p<0.05。由表3可知，相较于非40℃烘干组(包含55℃烘干组与70℃烘干组)，40℃烘干组兔尾草药材的胺基酸(异白胺酸、苏胺酸、精胺酸、天门冬胺酸、天门冬酰胺酸、酪胺酸、色胺酸、苯丙胺酸)、水杨酸、甜菜碱、三萜类及黄酮类(芹菜素苷、红血藤苷a)的量显著较高，而蔗糖及胆碱的量则显著较低。上述结果显示，于兔尾草药材采收后以35℃至45℃的温度(例如40℃)进行干燥加工，可明显提升兔尾草药材中胺基酸(异白胺酸、苏胺酸、精胺酸、脯胺酸、天门冬胺酸、天门冬酰胺酸、酪胺酸、色胺酸、苯丙胺酸)、水杨酸、甜菜碱、三萜类及黄酮类(芹菜素苷、红血藤苷a)等活性成分的含量。实施例3：不同批次的兔尾草药材的比较合并第一批次的晒干组、阴干组、烘干组兔尾草药以及第二批次的40℃烘干组、55℃烘干组、70℃烘干组兔尾草药材的1h-nmr数据，并进行主成分分析(pca)，以直观的体现不同因素对兔尾草药材代谢物组成的影响，结果示于图5。其中，x轴(pc1轴，主成分1)系分析不同加工因素(包括pc1轴上所示之「40℃(表示于40℃进行烘干处理)」以及「非-40℃(非40℃烘干处理的其他方法)」)对兔尾草药材之化学成分组成一致性的影响；y轴(pc2轴，主成分2)系分析不同批次(包括pc2轴上所示之「第一批次」及「第二批次」)对兔尾草药材之化学成分组成一致性的影响，其中包括位于上半图之「晒干组(第一批次)」、「阴干组(第一批次)」、「烘干组(第一批次)」的结果、以及位于下半图之「40℃烘干组(第二批次)」、「55℃烘干组(第二批次)」、「70℃烘干组(第二批次)」的结果。由图5可知，40℃烘干组与非40℃烘干组(包含55℃烘干组、70℃烘干组、阴干组、晒干组)兔尾草药材代谢物于pc1轴上明显区分，且40℃烘干组的化学成分组成一致性较高。不同批次之间兔尾草药材代谢物也于pc2轴上明显区分。前述结果显示，该两个批次的烘干处理组之间的同构型(homogeneity)明显高于其他组别，35℃至45℃(例如40℃)的烘干处理的影响较不同批次采收所造成的影响更为显著，且能够使兔尾草药材的化学成分组成趋近一致，进而提高兔尾草药材于临床疗效的一致性。实施例4：不同加工方法对兔尾草药材的生物活性的影响本研究利用细胞筛选平台，分析兔尾草药材的生物活性，结果显示兔尾草药材具有雌激素刺激活性、cox-2抑制活性、nrf2刺激活性、dpph自由基清除能力以及teac总抗氧化能力。接着，进一步分析不同加工处理条件对前述该等活性的影响。4-1.雌激素刺激活性测定将per-α-luchek-293细胞株接种于96孔盘中，并分别于不同的孔中加入制备实施例b-2.所提供的各组兔尾草提取液(浓度为1毫克/毫升)及阳性对照药物17β-雌二醇(17β-estradiol(简称「e2」)，100微微莫耳浓度(100nm))，进行培养，历时24小时。其后，移除培养基，再分别于不同的孔中加入50微升细胞裂解液(组成：1％的tritonx-100、2毫莫耳浓度的dtt(dithiothreitol)、2毫莫耳浓度的cdta(trans-1,2-diaminocyclohexane-n,n,n′,n′-tetraaceticacidmonohydrate)、10％的glycerol及25毫莫耳浓度的tris-hcl(ph7.8))，进行震荡，历时10分钟。接着，分别于不同的孔中加入100微升荧光素酶活性分析缓冲液(luciferaseassaybuffer，组成：20毫莫耳浓度的tris-hcl(ph7.8)、10毫莫耳浓度的nahco3、2.5毫莫耳浓度的mgso4、0.1毫莫耳浓度的edta、10毫莫耳浓度的dtt、60微莫耳浓度的coenzyme-alithium、225微莫耳浓度的荧光素钾(potassiumluciferin)、250微莫耳浓度的atp)，混合均匀后，使用分光亮度计测定560nm波长的吸光值，纪录吸光值(a)。最后，以下式1计算出雌激素活性(estrogenicactivity，％)，并将统计后的结果示于图6。式1：雌激素活性(％)＝(a样品-a控制/ae2-a控制)x100。式1中，a样品为样品于560nm波长下的吸光值；a控制为控制组于560nm波长下的吸光值；ae2为阳性对照组于560nm波长下的吸光值。由图6可知，相较于晒干组或阴干组，烘干组的雌激素刺激活性皆明显较高；相较于55℃烘干组或70℃烘干组，40℃烘干组的雌激素刺激活性皆明显较高。另一方面，第一批次的烘干组与第二批次的40℃烘干组的雌激素刺激活性并无明显差异。前述结果显示，于兔尾草药材采收后以35℃至45℃的温度(例如40℃)进行干燥加工，可有效提升兔尾草药材或其提取物的雌激素刺激活性。4-2.nrf2刺激活性测定将pnrf2-luchek-293细胞株接种于96孔盘中，并分别于不同的孔中加入制备实施例b-2.所提供的各组兔尾草提取液(浓度为1毫克/毫升)及阳性对照药物穿心莲内酯(andrographolide，20微莫耳浓度)，进行培养，历时16小时。其后，移除培养基，再分别于不同的孔中加入50微升细胞裂解液，进行震荡，历时10分钟。接着，分别于不同的孔中加入100微升荧光素酶活性分析缓冲液，混合均匀后，使用分光亮度计测定560nm波长的吸光值，纪录吸光值(a)。最后，以下式2计算nrf2活性(％)，并将统计后的结果示于图7。式2：nrf2刺激活性(％)＝(a样品-a控制/aandrographolide-a控制)x100。式2中，a样品为样品于560nm波长下的吸光值；a控制为控制组于560nm波长下的吸光值；aandrographolide为阳性对照组于560nm波长下的吸光值。由图7可知，相较于晒干组，烘干组的nrf2刺激活性明显较高；相较于55℃烘干组，40℃烘干组的nrf2刺激活性明显较高。另一方面，第一批次的烘干组与第二批次的40℃烘干组的nrf2刺激活性并无明显差异。前述结果显示，于兔尾草药材采收后以35℃至45℃的温度(例如40℃)进行干燥加工，可有效提升兔尾草药材或其提取物的nrf2刺激活性。4-3.cox-2抑制活性测定使用cox抑制剂筛选检测分析套组(coxinhibitorscreeningassaykit，型号560131，购自cayman公司)，测定制备实施例b-2.所提供的各组兔尾草提取液的cox-2抑制活性，结果示于图8。由图8可知，相较于阴干组，烘干组的cox-2抑制活性明显较高；相较于55℃烘干组或70℃烘干组，40℃烘干组的cox-2抑制活性皆明显较高。另一方面，第一批次的烘干组与第二批次的40℃烘干组的cox-2抑制活性并无明显差异。前述结果显示，于兔尾草药材采收后以35℃至45℃的温度(例如40℃)进行干燥加工，可有效提升兔尾草药材或其提取物的cox-2抑制活性。4-4.dpph自由基清除能力测定取制备实施例b-2.所提供的各组兔尾草提取液(浓度为1毫克/毫升)，每组分别取0.1毫升，分别与0.1毫升的dpph自由基甲醇溶液(浓度为：0.2毫莫耳的dpph/升)进行混合，并于室温下避光静置30分钟。接着，使用分光亮度计测定517nm波长的吸光值，纪录吸光值(a)，吸光值愈低表示样品清除dpph自由基的能力愈强。最后，以下式3计算自由基清除率(scavengingeffect，％)，并将统计后的结果示于图9。式3：清除率(％)＝[1-(a样品-a空白)/(a控制-a空白)]x100。式3中，a样品为样品于517nm波长下的吸光值；a空白为空白组于517nm波长下的吸光值；a控制为控制组于517nm波长下的吸光值。由图9可知，相较于晒干组，烘干组的dpph自由基清除率明显较高；相较于55℃烘干组或70℃烘干组，40℃烘干组的dpph自由基清除率皆明显较高。另一方面，第一批次的烘干组与第二批次的40℃烘干组的dpph自由基清除率并无明显差异。前述结果显示，于兔尾草药材采收后以35℃至45℃的温度(例如40℃)进行干燥加工，可有效提升兔尾草药材或其提取物的dpph清除能力。4-5.teac(troloxequivalentantioxidantcapacity)总抗氧化能力测定已知abts(2，2’-azino-bis-〔3-ethylbenthiazolinesulfonicacid〕)经过氧化氢与过氧化酶反应会产生abts·+阳离子自由基，而呈现稳定的蓝绿色，于734nm波长下有吸收波蜂。若所加入的测试样品去有清除abts·+阳离子自由基的能力，则该蓝绿色会变浅且吸光值会降低，可用以评估总抗氧化能力，并使用trolox溶液作为正标准品做出标准曲线当对照，因此称此实验为teac总抗氧化能力测定。其中，teac值越高表示清除自由基的能力越强，抗氧化能力也越强。分别取制备实施例b-2.所提供的各组兔尾草提取液(浓度为1毫克/毫升)或trolox溶液，与0.125毫升的abts(1000微莫耳浓度)、0.125毫升的h2o2(500微莫耳浓度)及0.125毫升的过氧化酶(peroxidase)溶液(44单位/毫升)混合均匀后，放置于暗处一小时，待abts·+自由基阳离子生成。接着，使用分光亮度计测定734nm波长的吸光值，历时10分钟，纪录吸光值(a)，并换算成teac值(微克/毫升)，结果示于图10。前述实验方法可参见例如：evaluationofantioxidantactivityandinhibitoryeffectonnitricoxideproductionofsomecommonvegetables.jagricfoodchem.2006.54(5):p.1680-6、antioxidantactivityandbioactivecompoundsofteaseed(camelliaoleiferaabel.)oil.jagricfoodchem.2006.54(3):p.779-84、以及antioxidantactivityapplyinganimprovedabtsradicalcationdecolorizationassay.freeradicbiolmed.1999.26(9-10):p.1231-7的文献。由图10可知，相较于晒干组，烘干组的teac值明显较高；相较于55℃烘干组或70℃烘干组，40℃烘干组的teac值皆明显较高。另一方面，第一批次的烘干组与第二批次的40℃烘干组的teac值并无明显差异。前述结果显示，于兔尾草药材在采收后以35℃至45℃的温度(例如40℃)进行干燥加工，可有效提升兔尾草药材或其提取物的teac总抗氧化能力。由以上实验结果可知，以35℃至45℃的烘干处理进行兔尾草属植物的采收后的干燥加工，不仅可以有效提升兔尾草属植物或其提取物的活性成分含量，且可提升药材化学组成一致性而有利于该药材在疾病治疗的应用，更可有效提升兔尾草属植物的雌激素刺激活性、cox-2抑制活性、nrf2刺激活性、dpph自由基清除能力及teac总抗氧化能力，有效提升兔尾草属植物或其提取物的治疗效益。当前第1页12当前第1页12