经热处理的乳杆菌的用途及用以抑制口腔病原菌粘附的组合物的制作方法

本发明涉及一种乳杆菌菌株的用途，特别涉及一种乳杆菌菌株用以制备抑制口腔病原菌黏附的药物的用途，本发明另外涉及用以抑制口腔病原菌黏附的组合物。
背景技术：
：口腔中存在大量且复杂的微生物丛(microbiolflora)，其多以生物膜的形式黏附于口腔的硬组织或软组织上，该微生物丛可能随着个体成长、牙齿生长等口腔环境的变化而发生改变，也可能会因个体或家庭的饮食生活习惯而有所不同。口中菌相(oralflora)在口腔疾病中扮演重要的角色：举例而言，变异链球菌(streptococcusmutans)可以代谢多种糖类以产生酸性物质，因而酸蚀牙齿表面的牙釉质(enamel)而造成龋齿(dentalcaries)；牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)、中间普氏菌(prevotellaintermedia)等厌氧菌于牙龈周围所形成的生物膜则可能会导致牙龈发炎，并造成牙周病(periodontaldisease)的衍生；而口臭则是由于牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、以及具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)等细菌于代谢过程中产生的挥发性硫化物的恶臭所造成，因此若是能够借由益生菌调整口中菌相分布，可以有效降低口腔疾病发生的可能性。技术实现要素：本发明提供一种经热处理的乳杆菌的用途，是用以制备抑制口腔病原菌黏附的药物。本发明另外提供一种用以抑制口腔病原菌黏附的组合物，是借由经热处理的乳杆菌抑制口腔病原菌的黏附。本发明的经热处理的乳杆菌的用途，是用以制备抑制口腔病原菌黏附的药物，该乳杆菌为一副干酪乳杆菌gmnl-143、一瑞士乳杆菌gmnl-164或一鼠李糖乳杆菌gmnl-464，该副干酪乳杆菌gmnl-143寄存于中国台湾食品工业发展研究所，其寄存编号为bcrc910626，及寄存于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期为2014年6月29日，分类命名为副干酪乳杆菌gmnl-143lactobacillusparacaseigmnl-143，其寄存编号为cctccno.:m2014301，该瑞士乳杆菌gmnl-164寄存于中国台湾食品工业发展研究所，其寄存编号为bcrc910695，及寄存于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期为2016年3月6日，分类命名为lactobacillushelveticusgmnl-164，其寄存编号为cctccno.:m2015609，该鼠李糖乳杆菌gmnl-464寄存于中国台湾中国台湾食品工业发展研究所，其寄存编号为bcrc910696，及寄存于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期为2016年3月6日，分类命名为lactobacillusrhamnosusgmnl-464，其寄存编号为cctccno.:m2015610，且该乳杆菌经90～121℃热处理15～30分钟，该经热处理的乳杆菌可以防止口腔病原菌黏附于口腔之中，以调整口中菌相分布，进而达到维护口腔健康的目的。本发明的经热处理的乳杆菌的用途，该乳杆菌以每次3×108～1×1010颗细胞的剂量经口投予一所需个体，借由该剂量有效防止口腔病原菌黏附于口腔之中，以调整口中菌相分布，进而达到维护口腔健康的目的。本发明的用以抑制口腔病原菌黏附的组合物，包括：经热处理的一乳杆菌，该乳杆菌选自由一副干酪乳杆菌gmnl-143、一瑞士乳杆菌gmnl-164及一鼠李糖乳杆菌gmnl-464所组成的群组，该副干酪乳杆菌gmnl-143寄存于中国台湾食品工业发展研究所，其寄存编号为bcrc910626，及寄存于中国典型培养物保藏中心，其寄存编号为cctccno.:m2014301，该瑞士乳杆菌gmnl-164寄存于中国台湾食品工业发展研究所，其寄存编号为bcrc910695，及寄存于中国典型培养物保藏中心，其寄存编号为cctccno.:m2015609，该鼠李糖乳杆菌gmnl-464寄存于中国台湾食品工业发展研究所，其寄存编号为bcrc910696，及寄存于中国典型培养物保藏中心，其寄存编号为cctccno.:m2015610，且该乳杆菌经90～121℃热处理15～30分钟；及一医药学上可接受的赋型剂，以借由该副干酪乳杆菌gmnl-143、该瑞士乳杆菌gmnl-164、该鼠李糖乳杆菌gmnl-464有效防止口腔病原菌黏附于口腔之中，以调整口中菌相分布，进而达到维护口腔健康的目的。本发明的用以抑制口腔病原菌黏附的组合物，其中，该组合物包括：该副干酪乳杆菌gmnl-143、该瑞士乳杆菌gmnl-164及该鼠李糖乳杆菌gmnl-464，且该副干酪乳杆菌gmnl-143、该瑞士乳杆菌gmnl-164及该鼠李糖乳杆菌gmnl-464的菌量比为1：1：1，借由该副干酪乳杆菌gmnl-143、该瑞士乳杆菌gmnl-164、该鼠李糖乳杆菌gmnl-464的协同作用，有效防止口腔病原菌黏附于口腔之中，以调整口中菌相分布，进而达到维护口腔健康的目的。本发明的经热处理的乳杆菌的用途，该经热处理的乳杆菌可以防止口腔病原菌黏附于口腔之中，以调整口中菌相分布，进而达到维护口腔健康的目的。本发明的用以抑制口腔病原菌黏附的组合物，借由该副干酪乳杆菌gmnl-143、该瑞士乳杆菌gmnl-164、该鼠李糖乳杆菌gmnl-464有效防止口腔病原菌黏附于口腔之中，以调整口中菌相分布，进而达到维护口腔健康的目的。附图说明图1a：试验(a)第a0组的抑制变异链球菌黏附能力的结果。图1b：试验(a)第a1组的抑制变异链球菌黏附能力的结果。图1c：试验(a)第a2组的抑制变异链球菌黏附能力的结果。图2a：试验(b)第b0组的抑制变异链球菌黏附能力的结果。图2b：试验(b)第b1组的抑制变异链球菌黏附能力的结果。图2c：试验(b)第b2组的抑制变异链球菌黏附能力的结果。图3：试验(c)各组的抑制牙龈卟啉单胞菌黏附能力的结果。图4：试验(d)各组的抑制中间普氏菌黏附能力的结果。图5：试验(e)各组的抑制具核梭杆菌黏附能力的结果。图6a：试验(f)以第f0组漱口水漱口前后口腔中变异链球菌含量变化。图6b：试验(f)以第f0组漱口水漱口前后口腔中牙龈卟啉单胞菌含量变化。图6c：试验(f)以第f0组漱口水漱口前后口腔中具核梭杆菌含量变化。图6d：试验(f)以第f0组漱口水漱口前后口腔中总菌量变化。图7a：试验(f)以第f1组漱口水漱口前后口腔中变异链球菌含量变化。图7b：试验(f)以第f1组漱口水漱口前后口腔中牙龈卟啉单胞菌含量变化。图7c：试验(f)以第f1组漱口水漱口前后口腔中具核梭杆菌含量变化。图7d：试验(f)以第f1组漱口水漱口前后口腔中总菌量变化。图8a：试验(f)以第f2组漱口水漱口前后口腔中变异链球菌含量变化。图8b：试验(f)以第f2组漱口水漱口前后口腔中牙龈卟啉单胞菌含量变化。图8c：试验(f)以第f2组漱口水漱口前后口腔中具核梭杆菌含量变化。图8d：试验(f)以第f2组漱口水漱口前后口腔中总菌量变化。图9a：试验(f)以第f3组漱口水漱口前后口腔中变异链球菌含量变化。图9b：试验(f)以第f3组漱口水漱口前后口腔中牙龈卟啉单胞菌含量变化。图9c：试验(f)以第f3组漱口水漱口前后口腔中具核梭杆菌含量变化。图9d：试验(f)以第f3组漱口水漱口前后口腔中总菌量变化。具体实施方式为使本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本发明的较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下：本发明所述的乳杆菌选自由一副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)gmnl-143、一瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)gmnl-164及一鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)gmnl-464所组成的群组。详而言之，该副干酪乳杆菌gmnl-143分离自人类肠道，其于37℃的温度下培养48小时后的菌落的形态为圆形、紧缩、完整边缘、1.0mm×1.0mm、乳白色、平滑表面、中间突起、革兰氏染色的结果为革兰氏阳性菌、形态为杆菌、不形成孢子、不具移动性，生理特性如下：存活温度为25～45℃、存活ph值为ph4.0～10.0，属于兼性厌氧(facultativeanaerobic)的乳杆菌。另外，进行16srdna的分子鉴定，其16srdna部分序列如seqidno：1所示，经与ncbi数据库进行比对，确认为副干酪乳杆菌；且其糖可利用性结果如表1所示。表1副干酪乳杆菌gmnl-143的糖可利用性测试结果而且，该瑞士乳杆菌gmnl-164分离自人类肠道，其于37℃的温度下培养48小时后的菌落的形态为圆形、波浪边缘、1.2mm×1.2mm、灰白色、缓和表面、平坦突起、革兰氏染色的结果为革兰氏阳性菌、形态为杆菌、不形成孢子、不具移动性，生理特性如下：存活温度为25～45℃、存活ph值为ph4.0～10.0，属于兼性厌氧的乳杆菌。另外，进行16srdna的分子鉴定，其16srdna部分序列如seqidno：2所示，经与ncbi数据库进行比对，确认为瑞士乳杆菌；且其糖可利用性结果如表2所示。表2瑞士乳杆菌gmnl-164的糖可利用性测试结果该鼠李糖乳杆菌gmnl-464分离自人类肠道，其于37℃的温度下培养48小时后的菌落的形态为圆形、反光、完整边缘、1.5mm×1.5mm、乳白色、平滑表面、中间突起、革兰氏染色的结果为革兰氏阳性菌、形态为杆菌、不形成孢子、不具移动性，生理特性如下：存活温度为25～45℃、存活ph值为ph4.0～10.0，属于兼性厌氧的乳杆菌。另外，进行16srdna的分子鉴定，其16srdna部分序列如seqidno：3所示，经与ncbi数据库进行比对，确认为鼠李糖乳杆菌；且其糖可利用性结果如表3所示。表3鼠李糖乳杆菌gmnl-464的糖可利用性测试结果该副干酪乳杆菌gmnl-143寄存于中国台湾食品工业发展研究所，其寄存编号为bcrc910626，及寄存于中国典型培养物保藏中心，其寄存编号为cctccno.:m2014301，该瑞士乳杆菌gmnl-164寄存于中国台湾食品工业发展研究所，其寄存编号为bcrc910695，及寄存于中国典型培养物保藏中心，其寄存编号为cctccno.:m2015609，该鼠李糖乳杆菌gmnl-464寄存于中国台湾食品工业发展研究所，其寄存编号为bcrc910696，及寄存于中国典型培养物保藏中心，其寄存编号为cctccno.:m2015610。此外，该乳杆菌可以先经过热处理程序，使其失去生理活性后，再应用于抑制口腔病原菌的黏附；举例而言，于本实施例中，该热处理程序于90～121℃的温度下进行15～30分钟。并且，该乳杆菌可以分别混合一医药学上可接受的赋型剂，以共同形成可以应用于抑制口腔病原菌黏附的组合物，或者以1：1：1的比例(菌量比)优先混合该副干酪乳杆菌gmnl-143、该瑞士乳杆菌gmnl-164及该鼠李糖乳杆菌gmnl-464，以形成一复合乳杆菌，再使该复合乳杆菌与该医药学上可接受的赋型剂共同形成该应用于抑制口腔病原菌黏附的组合物。值得注意的是，该乳杆菌也可以添加于漱口水、牙膏、口含锭、口香糖、牙粉等基质中，以提升该漱口水、该牙膏、该口含锭、该口香糖、该牙粉的抑制口腔病原菌黏附的能力；详而言之，添加于该漱口水之中时，该乳杆菌的每次用量为1×109颗细胞，每次使用时间为30秒；添加于该牙膏之中时，该乳杆菌的每次用量为7×108～1×109颗细胞，每次使用时间为1分钟；添加于该口含锭之中时，该乳杆菌的每次用量为3×108颗细胞，每次使用时间为10～20分钟；添加于该口香糖之中时，该乳杆菌的每次用量为2×109颗细胞，每次使用时间为10～30分钟；添加于该牙粉之中时，该乳杆菌的每次用量为1×1010颗细胞，每次使用时间为1分钟；但是，上述用量及使用时间本领域技术人员可以依据需求自行调整，在此不加以限制。为证实本发明的乳杆菌确实可以抑制口腔病原菌的黏附，遂使该乳杆菌经90～121℃热处理15～30分钟后，冷却至室温后进行以下试验：(a)副干酪乳杆菌gmnl-143抑制变异链球菌(atcc25175)的黏附请参照表4所示，本试验以变异链球菌(atcc25175)进行测试，混合0.5ml的副干酪乳杆菌gmnl-143及0.5ml的变异链球菌(atcc25175)，静置5分钟后，取500μl的上层溶液，添加至已置入无菌载玻片的24孔盘中，于37℃的温度下培养2小时，再移除该上层溶液，以磷酸盐缓冲生理食盐水(pbs)清洗后，加入0.5ml甲醇作用，最后以吉姆萨染液染色(giemsastain)，观察黏附于载玻片上的变异链球菌的数量。表4本试验各组的测试条件组别测试条件第a0组pbs+变异链球菌(atcc25175)第a1组副干酪乳杆菌gmnl-33+变异链球菌(atcc25175)第a2组副干酪乳杆菌gmnl-143+变异链球菌(atcc25175)请参照图1a所示，仅以pbs处理的状况下，变异链球菌(atcc25175)可以黏附于载玻片上，另外，请参照图1b、1c所示，副干酪乳杆菌gmnl-33、gmnl-143的处理可以减少黏附于载玻片上的变异链球菌(atcc25175)的数量，其中又以本发明的副干酪乳杆菌gmnl-143效果为佳。(b)副干酪乳杆菌gmnl-143抑制变异链球菌(bcrc16002)的黏附续请参照表5所示，另外，以变异链球菌(bcrc16002)进行相同测试，其结果大致相同，副干酪乳杆菌gmnl-33、gmnl-143的处理均可以减少黏附于载玻片上的变异链球菌(bcrc16002)的数量，并且，又以本发明的副干酪乳杆菌gmnl-143效果为佳(图2a～2c)。表5本试验各组的测试条件组别测试条件第b0组pbs+变异链球菌(bcrc16002)第b1组副干酪乳杆菌gmnl-33+变异链球菌(bcrc16002)第b2组副干酪乳杆菌gmnl-143+变异链球菌(bcrc16002)(c)瑞士乳杆菌gmnl-164抑制牙龈卟啉单胞菌(atcc33277)的黏附本试验以人类正常口腔齿龈细胞株(smulow-clickmangingivalcells，简称sg细胞)进行测试，请参照表6所示，混合等量的瑞士乳杆菌gmnl-164及牙龈卟啉单胞菌(atcc33277)，取100μl的上层溶液，添加至贴附有sg细胞(3×105颗细胞/孔)的24孔盘中，于37℃的温度下培养2小时，再移除该上层溶液，收集各孔中的sg细胞，并抽取黏附于sg细胞上的细菌dna，最终以具有如seqidnos：4及5的引子对进行实时聚合酶链式反应，计算各组的2-δct，结果如图3所示。表6本试验各组的测试条件组别测试条件第c0组pbs+牙龈卟啉单胞菌(atcc33277)第c1组副干酪乳杆菌gmnl-33+牙龈卟啉单胞菌(atcc33277)第c2组瑞士乳杆菌gmnl-164+牙龈卟啉单胞菌(atcc33277)请参照图3所示，副干酪乳杆菌gmnl-33及瑞士乳杆菌gmnl-164均具有抑制牙龈卟啉单胞菌黏附于sg细胞的能力，其中尤以本发明的瑞士乳杆菌gmnl-164为佳。(d)瑞士乳杆菌gmnl-164抑制中间普氏菌(atcc25611)的黏附本试验同以前述sg细胞进行测试，请参照表7所示，混合等量的瑞士乳杆菌gmnl-164及中间普氏菌(atcc25611)，取100μl的上层溶液，添加至贴附有sg细胞(3×105颗细胞/孔)的24孔盘中，于37℃的温度下培养2小时，再移除该上层溶液，收集各孔中的sg细胞，并抽取黏附于sg细胞上的细菌dna，最终以具有如seqidnos：6及7的引子对进行实时聚合酶链式反应，计算各组的2-δct，结果如图4所示。表7本试验各组的测试条件组别测试条件第d0组pbs+中间普氏菌(atcc25611)第d1组副干酪乳杆菌gmnl-33+中间普氏菌(atcc25611)第d2组瑞士乳杆菌gmnl-164+中间普氏菌(atcc25611)请参照图4所示，副干酪乳杆菌gmnl-33及瑞士乳杆菌gmnl-164均具有抑制中间普氏菌黏附于sg细胞的能力，其中尤以本发明的瑞士乳杆菌gmnl-164为佳。(e)鼠李糖乳杆菌gmnl-464抑制具核梭杆菌(atcc25586)的黏附本试验仍以前述sg细胞进行测试，请参照表8所示，混合等量的鼠李糖乳杆菌gmnl-464及具核梭杆菌(atcc25586)，取100μl的上层溶液，添加至贴附有sg细胞(3×105颗细胞/孔)的24孔盘中，于37℃的温度下培养2小时，再移除该上层溶液，收集各孔中的sg细胞，并抽取黏附于sg细胞上的细菌dna，最终以具有如seqidnos：8及9的引子对进行实时聚合酶链式反应，计算各组的2-δct，结果如图5所示。表8本试验各组的测试条件组别测试条件第e0组pbs+具核梭杆菌(atcc25586)第e1组副干酪乳杆菌gmnl-33+具核梭杆菌(atcc25586)第e2组鼠李糖乳杆菌gmnl-464+具核梭杆菌(atcc25586)请参照图5所示，副干酪乳杆菌gmnl-33及鼠李糖乳杆菌gmnl-464均具有抑制具核梭杆菌黏附于sg细胞的能力，其中尤以本发明的鼠李糖乳杆菌gmnl-464为佳。(f)副干酪乳杆菌gmnl-143、瑞士乳杆菌gmnl-164、鼠李糖乳杆菌gmnl-464的协同作用本试验混合等菌量的副干酪乳杆菌gmnl-143、瑞士乳杆菌gmnl-164、鼠李糖乳杆菌gmnl-464，以形成该复合乳杆菌，并以无菌水配制为含有低剂量的复合乳杆菌的漱口水(含浓度为5×107cells/ml的复合乳杆菌，第f1组)、中剂量的复合乳杆菌的漱口水(含浓度为5×108cells/ml的复合乳杆菌，第f2组)、高剂量的复合乳杆菌的漱口水(含浓度为5×109cells/ml的复合乳杆菌，第f3组)备用，另外，以未添加该复合乳杆菌的无菌水作为漱口水的对照组(第f0组)。详而言之，本试验以前述第f0～f3组的漱口水漱口前(t0)、及漱口后1小时(t1)、漱口后2.5小时(t2)的时间点，分别以无菌棉花棒采取口中菌相，将棉花棒置入0.5ml的无菌水中震荡3～5秒，于室温下静置1小时，再以13,000rpm的速度离心10分钟，取出棉花棒后再以13,000rpm的速度离心10分钟，移除上清液后，萃取细胞团块(pellet)的dna，最终进行实时聚合酶链式反应，以具有如seqidnos：10及11所示的序列的引子对定量变异链球菌的含量，以具有如seqidnos：4及5所示的序列的引子对定量牙龈卟啉单胞菌的含量，及以具有如seqidnos：8及9所示的序列的引子对定量具核梭杆菌的含量，同时以实时聚合酶链式反应定量口腔中的总菌量作为口中菌相消长的指标图6a～6c分别为以第f0组的漱口水漱口前后的变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌的相对菌量，第6d图则为以第f0组的漱口水漱口前后的口腔中总菌量(以具有如seqidnos：12及13所示的序列的引子对定量口腔内总菌量)，第7a～7d、8a～8d、9a～9d则分别为以第f1、f2、f3组的漱口水漱口前后的试验结果。其结果显示，该复合乳杆菌的添加剂量与抑制变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌的能力呈正相关，且第f3组的漱口水具有明显的抑菌效果。综合上述，本发明的经热处理的乳杆菌的用途，该经热处理的乳杆菌可以防止口腔病原菌黏附于口腔之中，以调整口中菌相分布，进而达到维护口腔健康的目的。并且，本发明的用以抑制口腔病原菌黏附的组合物，是借由该副干酪乳杆菌gmnl-143、该瑞士乳杆菌gmnl-164、该鼠李糖乳杆菌gmnl-464有效防止口腔病原菌黏附于口腔之中，以调整口中菌相分布，进而达到维护口腔健康的目的的。虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行的各种更动与修改仍属本发明所保护的技术范围，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。当前第1页12