石墨烯量子点在制备抑制细胞多药耐药基因的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，更具体地讲，涉及石墨烯量子点在制备抑制细胞多药耐药基因的药物中的应用。

背景技术：

细胞的多药耐药性(multidrugresistance,mdr)大多数与abc转运蛋白超家族有关，具有mdr症状的细胞中大部分可以发现abc转运蛋白超家族的过度表达。在abc转运蛋白超家族中与细胞耐药相关的最主要的成员有多药耐药蛋白(p-gp,mdr1)，多药耐药相关蛋白(multidrugresistanceassociatedproteins,mrps)和乳腺癌耐药蛋白(breastcancerresistanceprotein,bcrp)(mammaliandrugeffluxtransportersoftheatpbindingcassette(abc)familyinmultidrugresistance:areviewofthepastdecade.cancerletters,2016,37(2016):153-164)。因此，逆转细胞多药耐药性的有效方式之一就是抑制这些abc转运蛋白的基因，使细胞重新对化疗药物产生敏感性。

abc转运蛋白的抑制剂按照其发展大致可以分为三类：第一类抑制剂大部分也是abc蛋白质的底物，如维拉帕米，环孢霉素，以及它们的混合使用也大大提高了药物本身对细胞的敏感性。鉴于第一代mdr1抑制剂毒性较大的缺陷，r型维拉帕米、psc-833和vx-710等第二类抑制剂在设计上尽量避免了药物本身对细胞的毒性反应，在降低p-gp表达的同时，也尽量避免了对钙离子通道的阻滞和对免疫反应的抑制。但是当抗癌药物与这类抑制剂联合使用时却导致了它们在药代动力学上的相互作用，影响了药效。第三类abc转运蛋白家族抑制剂包括xr5976，oc144-093等，与abc转运蛋白具有高度亲和性且具有很低的药物代谢动力学相互作用。尽管体外试验证明这些药物增强了许多药物的化疗效果，但是临床效果却并未呈现出明显好转。因此，发现高效、低毒和作用靶点广泛的抑制剂仍是该领域的挑战之一。

石墨烯量子点(gqds)由于其特殊的物理化学性质，尺寸小，毒性度，具有很好的生物相容性等优良特性，已在生物医学研究领域中显示出巨大的应用潜能。目前研究普遍认为，gqds进入细胞，产生活性氧物种，从而导致细胞死亡；或作为药物载体，递送药物分子进入细胞。其中后者特别有希望用于改善耐药恶性肿瘤的治疗。此外，研究也发现石墨烯量子点也可以在体外与特定结构的dna分子作用。

基于上述研究现状，本发明在细胞水平研究石墨烯量子点的作用，发现gqds对p-gp、mrp1和bcrp基因都具有很好的抑制作用，而且可以对多靶点同时发生作用。由于gqds具有毒性低、良好的生物相容性等特性，所以有望成为高效、低毒和作用靶点广泛的abc转运蛋白的抑制剂。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供石墨烯量子点在制备抑制细胞多药耐药基因的药物中的应用。

本发明第二个目的在于提供石墨烯量子点在制备抑制多药耐药蛋白的药物中的应用。

为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：石墨烯量子点在制备抑制细胞多药耐药基因的药物中的应用。

作为一个优选方案，所述多药耐药基因是指多药耐药基因1(multidrugresistance1,mdr1)，多药耐药相关蛋白基因1(multidrugresistanceassociatedproteins,mrp1)和乳腺癌耐药蛋白基因(breastcancerresistanceprotein,bcrp)。

为实现以上第二个目的，本发明公开以下技术方案：石墨烯量子点在制备抑制多药耐药蛋白的药物中的应用。

作为一个优选方案，所述多药耐药蛋白是指p-糖蛋白(p-gp)，多药耐药相关蛋白(mrps)和乳腺癌耐药蛋白(bcrp)。

利用石墨烯量子点抑制细胞多药耐药基因表达的方法包括以下步骤：

(1)以hummers法合成的氧化石墨烯水溶液为起始物，利用photo-fenton反应，即以h2o2为氧化剂，在紫外光辐射下制备而成，将产物在超纯水中透析，去除未反应h2o2和反应产生的小分子，浓缩得到石墨烯量子点，用超纯水稀释至适当浓度的石墨烯量子点水溶液；

(2)将步骤(1)制备的石墨烯量子点水溶液与细胞培养基按优化比例混合均匀，培育贴壁后的细胞一定时间；

(3)提取步骤(2)细胞的总rna，并检测多药耐药基因表达量；

(4)考察石墨烯量子点逆转步骤(2)细胞的多药耐药性。

步骤(1)中，1kw功率下紫外光辐射氧化石墨烯水溶液50min，制备得到初始石墨烯量子点水溶液，透析是指使用3500da的透析袋，100倍体积的超纯水透析初始石墨烯量子点水溶液，适当浓度指石墨烯量子点水溶液终浓度范围为300-800μg/ml。

步骤(2)中，优化比例是指将石墨烯量子点加入到细胞培养基中与细胞共培育，优化石墨烯量子点的浓度，最终优化浓度为25-150μg/ml，含石墨烯量子的培养基培育贴壁后的细胞一定时间，时间为24h。

步骤(3)中，提取细胞的总rna是用常规rna提取试剂盒，检测多药耐药基因表达量的检查方法为一步法rt-pcr和凝胶电泳。

步骤(4)中，考察石墨烯量子点逆转细胞多药耐药性是指选取多柔比星作为p-糖蛋白底物，多柔比星的浓度为5μm，与细胞作用时间为30min。

本发明的优点在于：石墨烯量子点对细胞毒性小，具有优良的生物相容性等特性。石墨烯量子点可以抑制细胞多药耐药基因，能有效逆转mcf-7/adr的耐药性。抑制基因所需的石墨烯量子点量浓度较低。石墨烯量子点的制备步骤简单，贮存方便。

附图说明

图1为gqds抑制mcf-7/adr细胞mdr1基因表达；

图2为gqds抑制7721细胞mdr1基因表达；

图3为gqds抑制caco-2细胞mrp1基因表达；

图4为gqds抑制caco-2细胞bcrp基因表达；

图5为gqds逆转mcf-7/adr细胞多药耐药性。a)尼康荧光显微镜mcf-7/adr细胞明场图像，b)在510nm的光激发下，mcf-7/adr细胞荧光图像，c)在405nm激发下，mcf-7/adr细胞荧光图像，d)b图和c图的重叠图，标尺：50μm。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.利用石墨烯量子点抑制耐阿霉素人乳腺癌细胞mcf-7/adr中mdr1基因表达的方法

第一步：制备石墨烯量子点水溶液

所述的石墨烯量子点水溶液是以hummers法合成的氧化石墨烯水溶液为起始物，利用photo-fenton反应，即以h2o2为氧化剂，在紫外光照射下制备而成，将产物在超纯水中透析2天，除去未反应h2o2和反应产生的小分子，得到纯净的石墨烯量子点水溶液。具体制备方法可以参照文献(photo-fentonreactionofgrapheneoxide:anewstrategytopreparegraphenequantumdotsfordnacleavage.acsnano,2012,6(8),6592-6599)。

第二步：将石墨烯量子点溶液与细胞完全培养基混合均匀

将石墨烯量子点水溶液与rpmi-1640细胞完全培养基混合，其中培养基中血清是新生牛血清。石墨烯量子点的最终浓度为50μg/ml。

第三步：细胞与含石墨烯量子点的培养基共培育

用上述含有石墨烯量子点的完全培养基与耐阿霉素人乳腺癌细胞mcf-7/adr的共培育24h。

第四步：提取细胞总rna，设计引物，利用rt-pcr检测mdr1基因表达。

1.提取细胞总rna

1)每10cm²培养面积的细胞加入1-2ml南京诺唯赞生物技术公司rna提取试剂，用移液器将细胞吹打下来转移到离心管中，冰上静置5分钟。

2)向裂解液中加入1/5体积的氯仿；盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15秒，成乳浊液，4℃静置5分钟。

3)在4℃以12,000rpm转速离心样品15分钟。

4)吸取上层水相至新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温或4℃静置10分钟。

5)在4℃以12,000rpm转速离心样品10分钟。

6)弃去上清，加入1ml焦碳酸二乙酯水溶液(depc)配制的75％乙醇充分洗涤样品，让沉淀悬浮起来，静置3-5分钟。

7)在4℃以12,000rpm转速离心样品5分钟，弃去上清。

8)在超静台中室温敞口干燥沉淀2-5分钟；加入适量的depc水溶解沉淀，待完全溶解后，放在-80℃冰箱保存。

2.设计引物如下：其中gapdh为内参

gapdh-f:5’-catcaagaaggtggtgaagc-3’(seqidno.1)

gapdh-r:5’-tcttcctcttgtgctcttgc-3’(seqidno.2)

mdr1-f:5’-cccatcattgcaatagcagg-3’(seqidno.3)

mdr1-r:5’-gttcaaacttctgctcctga-3’(seqidno.4)。

3.rt-pcr：pcr条件和各操作步骤均可按常规方法操作。pcr中所用试剂和原料均可在市场购买或按现有方法制得。本实施例中pcr仪为bio-rad(t100tmthermalcycler,u.s.a.)。具体pcr条件：rt-pcr反应液共25μl，包含：逆转录酶1.2μl，内参基因引物各1μl(10μm)，目标基因引物各1μl(10μm)，rna1μl(1ng/μl)，反应预混液12μl，ddh2o补足到25μl。rt-pcr反应条件：(1)50℃30min；(2)94℃3min；(3)94℃30s；(4)57℃30s；(5)72℃30s；(6)步骤3-5循环30次；(7)72℃7min；(8)4℃10min。

4.结果分析：pcr产物用琼脂糖凝胶电泳分析，琼脂糖凝胶浓度1.5％。实验结果如附图1所示，从图中可以看出，以未加入gqds共培育的实验组为对照，当gqds浓度为50μg/ml时，mdr1基因表达明显减少。

实施例2.利用石墨烯量子点抑制人肝癌细胞7721中mdr1基因表达

步骤与实施例1完全相同，只是细胞为人肝癌细胞7721。

结果如附图2所示。从图中可以看出，以未加入gqds共培育的实验组细胞为对照，当gqds浓度为100μg/ml时，人肝癌细胞7721中mdr1基因表达明显减少，表明gqds可以抑制mdr1基因在人肝癌细胞7721中的表达。

实施例3.利用石墨烯量子点抑制人克隆结肠腺癌细胞caco-2细胞中mrp1基因表达

第一步：将石墨烯量子点溶液与caco-2细胞完全培养基混合均匀

细胞培养基为deme培养基，培养基中血清为新生牛血清。石墨烯量子点的浓度为100μg/ml。

第二步：细胞与含石墨烯量子点的培养基共培育

人克隆结肠腺癌细胞caco-2与含100μg/mlgqds的完全培养基共培育24h。

第三步：提取细胞总rna，设计引物，利用rt-pcr检测mrp1基因表达

1)使用南京诺唯赞生物技术公司rna提取试剂提取caco-2细胞总rna

2)设计引物如下：其中gapdh为内参

gapdh-f:5’-catcaagaaggtggtgaagc-3’(seqidno.5)

gapdh-r:5’-tcttcctcttgtgctcttgc-3’(seqidno.6)

mrp1-f:5’-ctacctcctgtggctgaatctg-3’(seqidno.7)

mrp1-r:5’-catcagcttgatccgattgtct-3’(seqidno.8)。

3)rt-pcr：本实施例中pcr仪为bio-rad(t100tmthermalcycler,u.s.a.)。rt-pcr条件：rt-pcr反应液共25μl，包含：逆转录酶1.2μl，内参基因引物各1μl(10μm)，目标基因引物各1μl(10μm)，rna1μl(1ng/μl)，反应预混液12μl，ddh2o补足到25μl。rt-pcr反应条件：(1)50℃30min；(2)94℃3min；(3)94℃30s；(4)58℃30s；(5)72℃30s；(6)步骤3-5循环30次；(7)72℃7min；(8)4℃10min。

4)结果分析：pcr产物用琼脂糖凝胶电泳分析，琼脂糖凝胶浓度1.5％。实验结果如附图3所示，从图中可以看出，以未加入gqds共培育的实验组为对照，当gqds为100μg/ml的增加，mrp1基因表达明显减少，表明gqds可以抑制mrp1基因在人克隆结肠腺癌细胞caco-2中的表达。

实施例4.利用石墨烯量子点抑制人克隆结肠腺癌细胞caco-2中bcrp基因表达。

步骤与实施例3完全相同，只是pcr中引物不同。

bcrp-f:5’-tggctgtcatggcttcagta-3’(seqidno.9)

bcrp-r:5’-gccacgtgattcttccacaa-3’(seqidno.10)。

结果分析：pcr产物用琼脂糖凝胶电泳分析，琼脂糖凝胶浓度1.5％。结果如附图4所示，从图中可以看出，以未加入gqds共培育的实验组为对照，当gqds浓度为100μg/ml时，人结肠腺癌细胞caco-2中bcrp基因表达明显减少，表明gqds可以抑制bcrp基因在人克隆结肠腺癌细胞caco-2中的表达。

实施例5.石墨烯量子点逆转mcf-7/adr细胞的多药耐药性

第一步：细胞培养：mcf-7/adr细胞经胰酶消化，接种于24孔板内(数量约为7.5×10⁴，密度约为1.5×10⁵ml^-1)，24h后细胞贴壁，去掉培养基，用pbs缓冲液洗涤细胞两次，每孔分别加入含0，100μg/mlgqds的完全培养基，37℃培养箱中共培育24h后吸出培养基，dox组和gqds/dox组加入5μmdox的无血清培养基继续共培育30min。

第二步：细胞固定：弃去细胞培养板中的含有dox的无血清培养基，用500μlpbs缓冲液洗涤细胞两次，吸去细胞培养板中pbs缓冲液，最后细胞培养板中加入350μl4％多聚甲醛溶液，室温避光固定细胞15min。

第三步：染核：弃去多聚甲醛溶液，500μlpbs缓冲液洗涤两次，吸去pbs，加入350μl浓度为2μgml^-1的dapi染色液，室温避光染色5min。

第四步：制片：弃去dapi染色液，500μlpbs缓冲液洗涤两次。用超纯水冲洗无细胞的一面，将水用吸水纸吸干，将盖玻片有细胞的一面用抗荧光淬灭封片液固定于载玻片上，排除气泡，压紧粘结面，用吸水纸吸干多余的封片液。置于4℃冰箱保存。

第五步：拍照：将制得爬片用尼康荧光显微镜，在紫光下激发观察细胞内dapi蓝色荧光，在绿光下激发观察细胞内dox红色荧光，拍照保存图片，处理荧光图片数据。

mcf-7/adr细胞实验结果如图5所示，100μg/mlgqds与细胞共培育后，能够增加dox在mcf-7/adr细胞核内积累，逆转了mcf-7/adr细胞的多药耐药性。

综上所述，利用石墨烯量子点能有效的抑制多药耐药基因的表达，并能够逆转耐药细胞多药耐药性，增加mcf-7/adr细胞对dox的敏感性，增强dox对耐药细胞的抗癌活性。gqds具有毒性低、很好的生物相容性，有望成为高效、低毒和作用靶点多药耐药基因的抑制剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。