本发明涉及一种含有牛樟芝肽的抗肿瘤组合物及其制备方法及应用。
背景技术：
：樟芝(antrodiacamphorate)又称为樟生薄孔菌、牛樟菇、牛樟芝，属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属珍稀药用真菌。野生牛樟芝子实体具有强烈的牛樟味，味苦，子实体表面呈橘红色或黄色，外观有皮板状、板层状、钟状、马蹄状、塔状或钟乳石状，无柄，紧贴于木材表面生长。牛樟芝是一种台湾独有的药食两用真菌。天然野生牛樟芝只寄生在台湾山区的老龄牛樟树上，由于数量稀少，生长速度非常缓慢，因此异常珍贵。加之早期过度砍伐牛樟树，使得天然野生牛樟芝已难得一见，台湾已立法不得任意砍伐，也因此取得野生牛樟芝更为困难。牛樟芝所含成分十分复杂，除含有蛋白质、碳水化合物、核苷酸、氨基酸和不饱和脂肪酸、维生素、微量元素等营养成分之外，还含有多种生理活性成分，如三萜类物质、杂多糖、麦角固醇、几丁质、木质素等，其中三萜类物质、樟芝多糖、腺苷为其主要活性成分。依台湾民间用药的习性，野生牛樟芝以治疗肝脏相关疾病为主，近年来，随着一些生理活性物质的发现，牛樟芝的保健和药用功效也逐渐被人熟知，包括抗癌、抗肿瘤、免疫功能、抗炎症、抗氧化、抗自由基、保护血管、保护肝脏、抗病毒性肝炎、降血糖、降血脂、以及控制脂质代谢。其中，在抗癌方面，牛樟芝已被发现对乳腺癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌、口腔癌等多种肿瘤有抑制作用。山药作为一种药食两用的植物，是重要的保健食品原料。山药中除了富含蛋白质、氨基酸、微量元素等营养成分，还含有多糖、尿囊素、淀粉酶、皂甙等多种生物活性成分。研究表明，山药具有免疫调节、抗衰老、抗氧化、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗突变、调节脾胃功能等方面的生物活性作用。当前，癌症是全世界患者面临的一个治疗难题，一般通过手术、放疗和化疗进行治疗。但这些治疗方法通常也会带来严重的风险或副作用。寻求安全、有效的癌症治疗方法是当前的重要研究方向，其中应用真菌和植物的有效成分进行抗肿瘤治疗越来越受到人们的关注和认可。研究表明牛樟芝在抗肿瘤方面具有显著效果，但由于产量少，价格昂贵，如何合理、高效利用牛樟芝的功能价值和营养成分的工艺或技术也成为了当前研究的热点。目前，关于牛樟芝的研究和专利主要集中在直接乙醇或水提取，或经复杂的分离纯化工艺获得多糖和三萜类化合物方面，进而忽略和舍弃了牛樟芝所含有的丰富的蛋白质，造成了浪费。真菌类蛋白质具有良好的生理功能和营养特性，但尚未见在萃取或提取牛樟芝化学成分时，利用或回收牛樟芝蛋白。而且也未见报道采用牛樟芝和山药的组合物产品在抗肿瘤方面的应用。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种含有牛樟芝肽的抗肿瘤组合物及其制备方法、应用。所述抗肿瘤组合物中的牛樟芝肽，是以牛樟芝菌丝体分别经生物酶解技术和乙醇提取制备牛樟芝肽和牛樟芝乙醇提取物，同时获取牛樟芝生物活性成分和营养成分，如多糖、三萜类化合物、蛋白质等，合理、高效的利用昂贵的牛樟芝，降低生产成本；牛樟芝肽、牛樟芝乙醇提取物与山药提取物组合，具有良好的抗肿瘤功效。为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：一种含有牛樟芝肽的抗肿瘤组合物，包括重量份如下的各组分：20～75份的牛樟芝肽，5～15份的牛樟芝乙醇提取物，20～40份的山药提取物。在上述方案中优选的是，包括重量份如下的各组分：65份的牛樟芝肽，13份的牛樟芝乙醇提取物，22份的山药提取物。在上述任一方案中优选的是，所述牛樟芝肽的制备方法为：将牛樟芝干燥后粉碎过60～80目筛，取牛樟芝粗粉，按料液比1:8～20加水，搅拌均匀后在60～90℃，100～200w下进行超声破碎0.5～1h，然后冷却至35～60℃，加入纤维素酶和果胶酶酶解0.5～3h，溶液ph5～8，然后加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解1～3h，酶解温度45～65℃，ph6～8，然后沸水浴灭酶15～30min，溶液在3000～4000r/min下离心15～30min后获得上清液和牛樟芝残渣，上清液经微滤膜除杂后，经真空浓缩至密度为1.01～1.05kg/cm3后，喷雾干燥得到牛樟芝肽，喷雾干燥进风温度为170～210℃，出风温度为80～100℃；其中所述纤维素酶和所述果胶酶的加酶量均为牛樟芝粗粉重量的0.3～1.5％，所述碱性蛋白酶和所述中性蛋白酶的加酶量分别为牛樟芝粗粉重量的0.3～3％和0.1～2％。本发明中牛樟芝粗粉先经超声破碎后，再加入纤维素酶和果胶酶，最后加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解制备牛樟芝肽的顺序不能相互调换。在上述任一方案中优选的是，所述牛樟芝为牛樟芝菌丝体。在上述任一方案中优选的是，所述牛樟芝乙醇提取物的制备方法为：以所述牛樟芝粗粉重量计，向所述牛樟芝残渣中加入料液比(w/v)为1:6～8的80％乙醇回流1.5～3h后，过滤、收集滤液；过滤得到的滤渣重复乙醇提取步骤，共提取3次；合并三次乙醇提取所得滤液，挥干乙醇，在-0.1mpa，55～70℃下真空干燥2～4h后得到牛樟芝乙醇提取物。在上述任一方案中优选的是，取干燥的过60～80目筛的山药粗粉，按料液比1:8～15加水，在85～100℃下回流2～3h后过滤，所得滤渣重复水提取步骤，共提取3次；合并所得的全部滤液，在4000～4500r/min离心8～15min后，弃去沉淀，然后将上清液在60～80℃的热水浴中浓缩至滤液体积的1/5～1/4，然后向浓缩液中加入4～6倍体积的无水乙醇，沉淀18～24h后再次在4000～4500r/min下离心15～30min，收集沉淀；向所述沉淀中加入料液比1:8～15的水搅拌充分，过夜，在4000～4500r/min下离心10～20min后弃去沉淀；将上清液缓慢搅拌，并继续加入4～6倍体积的无水乙醇，静置过夜后，在4000～4500r/min离心8～15min，收集沉淀在-0.1mpa，55～80℃下真空干燥2～4h得到山药提取物。本发明还提供所述的抗肿瘤组合物的制备方法，包括以下各步骤：a、制备牛樟芝肽：将牛樟芝干燥后粉碎过60～80目筛，取牛樟芝粗粉，按料液比1:8～20加水，搅拌均匀后在60～90℃，100～200w下进行超声破碎0.5～1h，然后冷却至35～60℃，加入纤维素酶和果胶酶酶解0.5～3h，溶液ph5～8，然后加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解1～3h，酶解温度45～65℃，ph6～8，然后沸水浴灭酶15～30min，溶液在3000～4000r/min下离心15～30min后获得上清液和牛樟芝残渣，上清液经微滤膜除杂后，经真空浓缩至密度为1.01～1.05kg/cm3后，喷雾干燥得到牛樟芝肽，喷雾干燥进风温度为170～210℃，出风温度为80～100℃；其中所述纤维素酶和所述果胶酶的加酶量均为牛樟芝粗粉重量的0.3～1.5％，所述碱性蛋白酶和所述中性蛋白酶的加酶量分别为牛樟芝粗粉重量的0.3～3％和0.1～2％；b、制备牛樟芝乙醇提取物：以所述牛樟芝粗粉重量计，向所述牛樟芝残渣中加入料液比(w/v)为1:6～8的80％乙醇回流1.5～3h后，过滤、收集滤液；过滤得到的滤渣重复乙醇提取步骤，共提取3次；合并三次乙醇提取所得滤液，挥干乙醇，在-0.1mpa，55～70℃下真空干燥2～4h后得到牛樟芝乙醇提取物；c、制备山药提取物：取干燥的过60～80目筛的山药粗粉，按料液比1:8～15加水，在85～100℃下回流2～3h后过滤，所得滤渣重复水提取步骤，共提取3次；合并所得的全部滤液，在4000～4500r/min离心8～15min后，弃去沉淀，然后将上清液在60～80℃的热水浴中浓缩至滤液体积的1/5～1/4，然后向浓缩液中加入4～6倍体积的无水乙醇，沉淀18～24h后再次在4000～4500r/min下离心15～30min，收集沉淀；向所述沉淀中加入料液比1:8～15的水搅拌充分，过夜，在4000～4500r/min下离心10～20min后弃去沉淀；将上清液缓慢搅拌，并继续加入4～6倍体积的无水乙醇，静置过夜后，在4000～4500r/min离心8～15min，收集沉淀在-0.1mpa，55～80℃下真空干燥2～4h得到山药提取物；d、称取所述牛樟芝肽、所述牛樟芝乙醇提取物和所述山药提取物混合均匀即为抗肿瘤组合物。在上述方案中优选的是，所述步骤a中微滤膜为陶瓷膜，孔径为100～200nm，工作压力为0.3～2mpa，温度为50～60℃。本发明还提供所述的牛樟芝肽用于抗肿瘤食品、保健食品和功能食品的制备。本发明还提供所述含有牛樟芝肽的牛樟芝肽的组合物用于抗肿瘤食品、保健食品和功能食品的制备。本发明的有益效果：本发明提供的一种含有牛樟芝肽的抗肿瘤组合物及其制备方法，以牛樟芝菌丝体经生物酶解技术制备牛樟芝肽，酶解残渣经乙醇提取后获得牛樟芝乙醇提取物，不仅充分获取了牛樟芝有效的生物活性成分和营养成分，且与山药提取物组合，具有良好的抗肿瘤功效。经实验证明，本发明中的65份牛樟芝肽、13份牛樟芝乙醇提取物与22份山药提取物的组合物在抑制癌症细胞增殖方面具有良好效果，具体表现为：给药剂量为50mg/kg体重、100mg/kg体重及200mg/kg体重的肿瘤抑制率分别达36.65％、48.87％、62.90％，高于其他组合物组，与对照组相比，差异极显著(p<0.01)；在相同给药剂量下，该组合物的肿瘤抑制率高于牛樟芝组。本发明所述的一种含有牛樟芝肽的抗肿瘤组合物，其特征在于，牛樟芝肽、牛樟芝乙醇提取物与山药提取物三者组合具有抑制癌症细胞增殖方面的用途，其制备的产品可用于预防和治疗癌症。具体实施方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1：制备牛樟芝肽的具体操作步骤如下：(1)将牛樟芝菌丝体干燥后粉碎过80目筛，得到牛樟芝粗粉。(2)取牛樟芝粗粉，按料液比1:10加水，搅拌均匀后进行超声破碎，冷却至50℃左右，加入0.5％的纤维素酶和0.5％的果胶酶酶解2h，调节溶液ph至7，待温度升至55℃，加入1.5％的碱性蛋白酶和1％中性蛋白酶，酶解3h后，沸水浴灭酶30min，在4000r/min下离心15min后获得上清液和牛樟芝残渣，上清液经微滤膜除杂后，经真空浓缩至密度为1.01kg/cm3后，在进风温度为180℃，出风温度为100℃下喷雾干燥得到牛樟芝肽。实施例2制备牛樟芝乙醇提取物的具体操作步骤如下：以牛樟芝粗粉重量计，向实施例1中的牛樟芝酶解残渣中加入料液比(w/v)为1:6的80％乙醇回流1.5h后，过滤，收集滤液；过滤得到的滤渣重复上一次步骤，提取2次；合并三次乙醇提取所得滤液，挥干乙醇，在-0.1mpa，55℃下真空干燥2h后得到牛樟芝乙醇提取物。实施例3制备山药提取物的具体操作步骤如下：取干燥的过60～80目筛的山药粗粉，按料液比1:10加水，在90℃下回流2h后过滤，所得滤渣中再加水重复上述步骤3次。合并所得的全部滤液，在4500r/min离心8min后，弃去沉淀，在80℃热水浴中浓缩至滤液体积的1/5，然后在浓缩液中加入6倍体积的无水乙醇，沉淀24h后再次在4500r/min下离心30min，收集沉淀。向沉淀中加入料液比1:10的水搅拌充分，过夜，离心(4500r/min，10min)后弃去沉淀。将上清液缓慢搅拌，并继续加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜后，在4500r/min离心8min，收集沉淀在-0.1mpa，55℃下真空干燥2h得到山药提取物。实施例4称55份取实施例1制备的牛樟芝肽、10份实施例2制备的牛樟芝乙醇提取物和35份实施例3制备的山药提取物混合均匀即为抗肿瘤组合物。实施例5称75份取实施例1制备的牛樟芝肽、5份实施例2制备的牛樟芝乙醇提取物和20份实施例3制备的山药提取物混合均匀即为抗肿瘤组合物。实施例6称20份取实施例1制备的牛樟芝肽、15份实施例2制备的牛樟芝乙醇提取物和40份实施例3制备的山药提取物混合均匀即为抗肿瘤组合物。实施例7称65份取实施例1制备的牛樟芝肽、13份实施例2制备的牛樟芝乙醇提取物和22份实施例3制备的山药提取物混合均匀即为抗肿瘤组合物。实施例8组合物体内抗肿瘤实验选择体重20g左右的昆明小白鼠，随机分为对照组、组合物组1、组合物组2、组合物组3、组合物组4、牛樟芝组和山药提取物组：其中对照组每天灌胃给予50mg/kg体重的生理盐水，组合物组4分别灌胃给药高剂量200mg/kg体重、中剂量100mg/kg体重、低剂量50mg/kg体重的组合物，其余三个组合物组和牛樟芝组(由牛樟芝肽和牛樟芝乙醇提取物按与实施例7的组合物相同的比例进行复配)和山药提取物组均分别灌胃给药50mg/kg体重(其中组合物组1、组合物组2、组合物组3和组合物组4中的组合物分别为按实施例4、实施例5、实施例6和实施例7制备的组合物)。每组小鼠雌雄各半(每组6只)，分笼饲养。腹水型荷瘤小白鼠，在无菌条件下抽集腹水，显微镜下检查瘤细胞数，用灭菌生理盐水进行稀释，制成es腹水癌瘤细胞生理盐水悬液。在每只小白鼠左后肢皮下接种瘤细胞生理盐水悬液0.1ml(含瘤细胞约108个)。动物接种瘤细胞悬液24小时后，开始第一次经灌胃给药，每天一次，连续10天，停药后次日，小鼠称重后脱臼处死动物，剥出皮下肿瘤，比较各组肿瘤生长情况，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率根据以下公式进行计算：抗肿瘤实验结果由表1可见，组合物对es腹水癌有明显的抑制作用，给药剂量为50mg/kg体重、100mg/kg体重及200mg/kg体重的肿瘤抑制率分别达36.65％、48.87％、62.90％，高于其他组合物组，与对照组相比，差异极显著(p<0.01)；在相同给药剂量下，组合物肿瘤抑制率高于牛樟芝组。表1组合物对es腹水癌的抑制作用组别给药途径剂量(mg/kg·d)瘤重(g)抑制率％对照组——02.21±0.23——组合物组4ig2000.82±0.2562.90组合物组4ig1001.13±0.7948.87组合物组4ig501.40±0.3136.65组合物组1ig501.39±0.5237.10组合物组2ig501.57±0.3028.96组合物组3ig501.68±0.9423.98牛樟芝组ig501.43±0.5534.39山药提取物组ig501.73±0.7221.72实施例9：1、制备牛樟芝肽的具体操作步骤如下：(1)将牛樟芝菌丝体干燥后粉碎过60目筛，得到牛樟芝粗粉。(2)取牛樟芝粗粉，按料液比1:8加水，搅拌均匀后在60℃，100w下进行超声破碎0.5h进行超声破碎，然后冷却至35℃左右，加入0.3％的纤维素酶和0.3％的果胶酶酶解0.5h，调节溶液ph至5，待温度升至45℃，加入0.3％的碱性蛋白酶和0.1％中性蛋白酶，酶解1h后，沸水浴灭酶15min，在3000r/min下离心30min后获得上清液和牛樟芝残渣，上清液经微滤膜除杂后，经真空浓缩至密度为1.01kg/cm3后，在进风温度为170℃，出风温度为80℃下喷雾干燥得到牛樟芝肽。2、制备牛樟芝乙醇提取物的具体操作步骤如下：以牛樟芝粗粉重量计，向步骤1中的牛樟芝酶解残渣中加入料液比(w/v)为1:8的80％乙醇回流3h后，过滤，收集滤液；过滤得到的滤渣重复上一次步骤，提取2次；合并三次乙醇提取所得滤液，挥干乙醇，在-0.1mpa，70℃下真空干燥4h后得到牛樟芝乙醇提取物。3、制备山药提取物的具体操作步骤如下：取干燥的过60～80目筛的山药粗粉，按料液比1:8加水，在85℃下回流2h后过滤，所得滤渣中再加水重复上述步骤3次。合并所得的全部滤液，在4500r/min离心8min后，弃去沉淀，在60℃热水浴中浓缩至滤液体积的1/5，然后在浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，沉淀18h后再次在4500r/min下离心15min，收集沉淀。向沉淀中加入料液比1:8的水搅拌充分，过夜，离心(4000r/min，20min)后弃去沉淀。将上清液缓慢搅拌，并继续加入6倍体积的无水乙醇，静置过夜后，在4000r/min离心8min，收集沉淀在-0.1mpa，80℃下真空干燥4h得到山药提取物。4、称55份取步骤1制备的牛樟芝肽、10份步骤2制备的牛樟芝乙醇提取物和35份步骤3制备的山药提取物混合均匀即为抗肿瘤组合物。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12