本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及间充质干细胞联合维生素E在制备用于肾脏组织细胞修复药物中的应用。
背景技术：
急性肾衰竭是临床的常见重大疾病，是指由各种原因引起的肾脏功能在短期内急剧降低，肾小球过滤迅速下降至正常的50％，血尿素氮及血肌酐迅速增高，导致体内代谢紊乱、水、电解质、酸碱平衡失调的临床综合征，临床死亡率达50％-80％。
急性肾衰竭的治疗原则主要包括：①一般治疗，卧床休息、充分补充营养和热量；②维持水、电解质及酸碱平衡，恢复有效循环血容量，预防多脏器的损伤及并发症的出现；③控制感染选用感染抗生素；④透析治疗包括血液透析、血液滤过或腹膜透析，及早清除毒素对机体各系统的损害，有利于损伤细胞的修复；⑤积极治疗原发病，及早发现导致急性肾衰竭的危险因素，并迅速去除，促进肾小管上皮细胞再生修复。
在过去的数十年，尽管血液净化技术和危重医学有了很大的发展，在急性肾衰竭的发病机制和治疗上也进行了诸多研究，但治疗的手段仍然有限，导致临床上缺乏行之有效的治疗方法。近年来，随着生物疗法的涌现，为急性肾衰竭的治疗提供了新的思路，如何促进坏死后的肾组织上皮细胞再生与休复，降低急性肾衰竭的病死率，是治疗急性肾衰竭疾病的新的研究方向。因此，细胞治疗方法，有可能成为提高急性肾衰竭治愈率的有效方法之一。
干细胞是生物个体生长和发育的先驱，是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两类。胚胎干细胞是一种全能的干细胞，具有分化为成体动物不同类型细胞和各种组织器官的能力，由于存在伦理学、致瘤性及免疫排斥等因素的影响，胚胎干细胞在临床应用中受到限制。成体干细胞是一种或多种组织器官的起源细胞，来源于骨髓、脐带、胎盘和脂肪等组织。
近年来的研究发现，间充质干细胞作为成体干细胞的一种，其仍具有分化潜能，只是失去了发育成完整个体的能力，从而成功避开了使用胚胎干细胞的诸多限制，成为干细胞领域的研究热点。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供间充质干细胞联合维生素E在制备用于肾脏组织细胞修复药物中的应用，所述的间充质干细胞可实现对肾脏受损组织的功能修复，对急、慢性肾衰竭均有一定的治疗作用，特别是在某些特殊环境中或某些生物因子的作用下，其自身活性会进一步增强；维生素E通过抗氧化作用抑制肾脏损害因素，其经济性、实用性使其具有广阔的应用范围，但两者单一使用都很难达到理想的治疗效果。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明将维生素E作为优化剂与间充质干细胞联合使用于肾脏组织细胞修复，从而实现作用效果的进一步优化。
维生素E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素，又称生育酚，是人体最主要的抗氧化剂之一。近些年还发现维生素E可抑制过氧化脂反应，使末稍血管扩张，改善血液循环。现有技术中，维生素E还可以通过抗氧化作用抑制肾脏损害因素，对急、慢性肾衰竭都有一定的治疗效果，其经济性、实用性使其具有广阔的应用范围，但是，单一维生素的使用，难以达到理想的治疗效果。
本发明使用间充质干细胞联合维生素E对肾脏组织细胞进行修复，能够减慢肾脏组织细胞凋亡的速度，提高肾脏组织的再生能力，两者联合使用时，利用维生素E和间充质干细胞的协同效应，其对肾脏组织细胞的修复效果明显优于两者的单独使用，克服了单一使用维生素E和间充质干细胞的缺点。
进一步地，所述肾脏组织细胞修复包括肾小球细胞和肾小管上皮细胞的修复。
上述肾小球细胞是肾脏的过滤细胞，肾小管上皮细胞是指肾小管的外面的一层细胞。肾小球细胞和肾小管上皮细胞均为肾脏组织细胞。
进一步地，使用顺铂建立小鼠肾脏损伤模型，将间充质干细胞联合维生素E作用于小鼠肾脏损伤模型。
顺铂是二价铂同两个氯原子和两个氨分子结合的重金属络合物，类似于双功能烷化剂，可抑制DNA的复制过程，临床上常用于癌症化疗，但其毒性极大，尤其是肾毒性极大。肾脏组织细胞对顺铂最为敏感，高浓度时可以抑制肾脏组织细胞的RNA及蛋白质合成。
本发明中，利用顺铂的肾毒性构造小鼠肾脏损伤模型，并控制剂量以免致死小鼠。
进一步地，本发明所采用的优选技术方案，包括以下步骤：
步骤(1)将小鼠肾小管上皮细胞接种于培养板，随后放入培养皿中用培养液进行培养，然后加入顺铂建立小鼠肾脏损伤模型；
步骤(2)将间充质干细胞接种于悬挂式多孔膜培养皿多孔膜内侧，然后将悬挂式多孔膜培养皿放入肾小管上皮细胞培养皿中的肾小管上皮细胞培养板的上方，并在培养液中加入维生素E；
上述接种于悬挂式多孔膜培养皿多孔膜内侧的间充质干细胞与处在其下方的肾小管上皮细胞所分泌的细胞因子可以自由通过培养皿的多孔膜。
步骤(3)将小鼠肾小管上皮细胞和间充质干细胞进行共培养，2～5天后检测肾小管上皮细胞的增殖和凋亡情况。
优选的，上述步骤(1)所使用的培养板为6孔培养板，所述培养液为2％FBS培养液。
本发明中使用的FBS培养液是无血清培养基的一种，被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊椎动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。大多数的无血清培养基含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质和清蛋白，纤维蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同的功能，如提供细胞贴壁所需的基质，抗生物反应器剪切力，作为脂质和其他生长分化因子的载体等。
优选的，上述步骤(1)中小鼠肾小管上皮细胞接种于培养板的接种密度为1.5x103cells/cm2。
优选的，上述步骤(1)中建立小鼠肾脏损伤模型时，顺铂的使用量为100μM。
优选的，上述步骤(2)中培养液中维生素E的加入量为40μM/天。
优选的，上述步骤(3)中所述培养时间优选为2天、3天或5天。
进一步地，本发明所采用的优选技术方案，包括以下步骤：将小鼠给予腹腔注射顺铂，建立小鼠肾脏损伤模型，随后用尾静脉注射的方式注入间充质干细胞和维生素E，连续注射7～15天。
优选的，所述培养时间优选为7天、14天或21天。
优选的，上述注射用顺铂为使用0.9％生理盐水稀释之后的顺铂，按18mg/kg体重的剂量腹腔注射小鼠，构建小鼠肾脏损伤模型。
优选的，上述每千克小鼠的间充质干细胞应用剂量为3.1×106Cells/天～3.5×106Cells/天。
进一步地，本发明中所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
人脐带间充质干细胞取材于一直作为分娩废弃物的脐带组织，取材方便，易于收集、保存、冷冻，不受伦理道德及法律方面的限制。脐带间充质干细胞含量丰富，一根30cm的脐带可得到107原代细胞，且细胞较为原始，分化能力强，生物性能稳定，多次传代扩增后仍能保持旺盛功能，可以为实验和临床提供充足的细胞来源。
目前为止，脐带间充质干细胞已经在多方面被证明是自体和异体细胞移植、治疗的理想细胞。和胚胎干细胞相比，脐带间充质干细胞在生物学特征和免疫学特性上与其相似，是细胞工程种子细胞的重要来源。
进一步地，每千克小鼠的顺铂应用剂量为18mg。
本发明中，每千克小鼠的顺铂应用剂量为18mg，该计量可以严重损伤小鼠的肾脏组织细胞，但不会致死小鼠。
进一步地，每千克小鼠的维生素E应用剂量为40μM/天。
进一步地，每千克小鼠的间充质干细胞应用剂量为3.1×106Cells/天～3.5×106Cells/天。
更进一步地，每千克小鼠的间充质干细胞应用剂量为3.3×106Cells/天。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了间充质干细胞联合维生素E在制备用于肾脏组织细胞修复药物中的应用，现有技术中间充质干细胞可实现对肾脏受损组织的功能修复，对急、慢性肾衰竭均有一定的治疗作用，特别是在某些特殊环境中或某些生物因子的作用下，其自身活性会进一步增强。同时，现有技术中也记载了维生素E通过抗氧化作用抑制肾脏损害因素，但两者单一使用虽然可以达到一定的修复效果，但效果都不十分理想。本发明将维生素E作为优化剂与间充质干细胞联合使用于肾脏组织细胞修复，能够减慢肾脏组织细胞凋亡的速度，提高肾脏组织的再生能力，两者联合使用时，利用维生素E和间充质干细胞的协同效应，其对肾脏组织细胞的修复效果明显优于两者的单独使用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1脐带间充质干细胞的制得
(1)将脐带放入酒精浸泡消毒，随后用PBS缓冲液进行冲洗，将冲洗后的脐带分离脐静脉及脐动脉，然后将脐带剪成长度约5mm的组织块；
(2)在剪好的脐带组织块中加入细胞分离液，在37℃、5％CO2和95％空气的条件下分离消化12h；
(3)将分离消化后的脐带块以1500rpm离心10min，弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM/F12液体培养基悬浮细胞，分离得到脐带间充质干细胞,细胞含量为5×104cells/ml。
实施例2脐带间充质干细胞培养扩增过程
(1)原代培养：将所分离的脐带间充质干细胞以5×104cells/ml的密度接种在37℃、5％的CO2、95％的空气气相下培养48h后换液，先用PBS溶液轻轻冲洗3次，以去除大部分的未贴壁细胞，换上基础培养液，37℃、5％的CO2、95％的空气条件下继续培养。
本发明中所述基础培养液是指含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液。
(2)传代培养是指将待脐带间充质干细胞生长至占培养皿底面的80％时传代，先吸去旧培养液，PBS缓冲液冲洗2次，用细胞分离液消化至大部分细胞胞质回缩，将要从培养皿底壁脱落时，加入基础培养液终止消化，用吸管轻轻吹打制成单细胞悬液，以1:3的比例将细胞接种在另一培养皿中继续培养。
(3)冻存是指当传代培养后的脐带间充质干细胞生长至占培养皿底面的80％时，消化并收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清液，以5×106cells/ml的比例加入预冷冻存液，充分混匀后置预冷的冻存管中。按4℃30min,-20℃30min,-80℃过夜的程序进行冻存。最后置于液氮罐中保存。长期冻存后应间隔一定时间复苏细胞，观察细胞生长情况。
(4)复苏是指从液氮罐中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中快速晃动，直至冻存液完全溶解，要在1-2min内完成复温。然后吸出细胞悬液接种在培养皿中，加入基础培养液，于37℃、5％CO2、95％的空气气相下培养，第二天换液。
实施例3体外细胞培养实验
步骤(1)：进行细胞分组
将小鼠肾脏组织细胞细胞分为以下5组：
1)小鼠肾脏组织细胞正常对照组
2)小鼠肾脏组织细胞顺铂损伤组
3)小鼠肾脏组织细胞顺铂损伤+间充质干细胞共培养组
4)小鼠肾脏组织细胞顺铂损伤+维生素E共培养组
5)小鼠肾脏组织细胞顺铂损伤+间充质干细胞+维生素E共培养组
步骤(2)：将小鼠肾小管上皮细胞接种于6孔培养板，接种密度为1.5x103cells/cm2。随后放入培养皿中用2％FBS培养液进行培养，然后加入顺铂100μM建立小鼠肾脏损伤模型；
步骤(3)：将间充质干细胞接种于悬挂式多孔膜培养皿多孔膜内侧，然后将悬挂式多孔膜培养皿放入肾小管上皮细胞培养皿中的肾小管上皮细胞培养板的上方，并在培养液中加入维生素E40μM/天。上述接种于悬挂式多孔膜培养皿多孔膜内侧的间充质干细胞与处在其下方的肾小管上皮细胞所分泌的细胞因子可以自由通过培养皿的多孔膜。
步骤(4)：将小鼠肾小管上皮细胞和间充质干细胞进行共培养，3天后检测肾小管上皮细胞的增殖和凋亡情况。
实施例4体内动物实验7天
步骤(1)：选用6-8周龄清洁级裸小鼠30只，根据尾静脉注射物质的不同，随机分成5组，每组6只：
组l：正常对照组；
组2：生理盐水治疗组；
组3：间充质干细胞+维生素E共培养组细胞治疗组；
组4：间充质干细胞细胞治疗组；
组5：维生素E细胞治疗组。
步骤(2)：将分组后的小鼠给予腹腔注射顺铂100μM，建立小鼠肾脏损伤模型。
步骤(3)：随后用尾静脉注射的方式向各组小鼠分别注入间充质干细胞和维生素E，连续注射7天，并处死各组动物。而后测定各项治疗指标，从而评估实验动物的肾脏的功能状态。其中：
组l：正常对照组，该组不进行顺铂的注射，以进行正常小鼠肾脏组织细胞的对照；
组2：生理盐水治疗组，该组进行顺铂的注射，用以作为不经间充质干细胞和/或维生素E治疗的小鼠肾脏组织细胞的对照；
组3：间充质干细胞+维生素E共培养组细胞治疗组，该组进行顺铂的注射，尾静脉注射过程中，每千克小鼠的间充质干细胞应用剂量为3.3×106Cells/天，每千克小鼠的维生素E应用剂量为40μM/天。
组4：间充质干细胞细胞治疗组，该组进行顺铂的注射，尾静脉注射过程中，每千克小鼠的间充质干细胞应用剂量为3.3×106Cells/天；
组5：维生素E细胞治疗组，该组进行顺铂的注射，尾静脉注射过程中，每千克小鼠的维生素E应用剂量为40μM/天。
实施例5体内动物实验15天
步骤(1)：选用6-8周龄清洁级裸小鼠30只，根据尾静脉注射物质的不同，随机分成5组，每组6只：
组l：正常对照组；
组2：生理盐水治疗组；
组3：间充质干细胞+维生素E共培养组细胞治疗组；
组4：间充质干细胞细胞治疗组；
组5：维生素E细胞治疗组。
步骤(2)：将分组后的小鼠给予腹腔注射顺铂100μM，建立小鼠肾脏损伤模型。
步骤(3)：随后用尾静脉注射的方式向各组小鼠分别注入间充质干细胞和维生素E，连续注射15天，并处死各组动物。而后测定各项治疗指标，从而评估实验动物的肾脏的功能状态。其中：
组l：正常对照组，该组不进行顺铂的注射，以进行正常小鼠肾脏组织细胞的对照；
组2：生理盐水治疗组，该组进行顺铂的注射，用以作为不经间充质干细胞和/或维生素E治疗的小鼠肾脏组织细胞的对照；
组3：间充质干细胞+维生素E共培养组细胞治疗组，该组进行顺铂的注射，尾静脉注射过程中，每千克小鼠的间充质干细胞应用剂量为3.3×106Cells/天，每千克小鼠的维生素E应用剂量为40μM/天。
组4：间充质干细胞细胞治疗组，该组进行顺铂的注射，尾静脉注射过程中，每千克小鼠的间充质干细胞应用剂量为3.3×106Cells/天；
组5：维生素E细胞治疗组，该组进行顺铂的注射，尾静脉注射过程中，每千克小鼠的维生素E应用剂量为40μM/天。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。