脆弱拟杆菌在制备增强吞噬细胞噬菌作用的组合物中的应用的制作方法

本发明涉及脆弱拟杆菌的应用技术领域，特别是涉及脆弱拟杆菌在制备增强吞噬细胞对致病菌吞噬作用的组合物中的应用。

背景技术：

吞噬细胞(phagocytes)从形态上可分为大吞噬细胞和小吞噬细胞两类，大吞噬细胞包括单核细胞和巨噬细胞，而小吞噬细胞则由中性粒细胞和嗜酸性粒细胞组成。吞噬细胞是人体先天性免疫的组成部分，在外来抗原、调解早期病原控制和协调下游的免疫应答中发挥着重要的作用。当机体发生感染时，巨噬细胞可以聚集并吞噬病原体，然后通过细胞内消化的方式直接杀死和破坏病原菌。同时巨噬细胞还可以作为抗原呈递细胞与t淋巴细胞相互作用，从而调节特异性免疫反应。

肠道菌群，作为人体的一道天然的“保护伞”与宿主健康状况息息相关。目前研究表明肠道菌群包括硬壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门四大类。正常状况下，这些肠道微生物与宿主是互利共生的，可以说是人类“微生物器官”，起到保护细胞上皮免受伤害、提供人体所需营养物质、调节脂肪储存、参与免疫调节等作用。其中，拟杆菌约占人和动物肠道菌群总数的1/4，对于维持宿主的健康状态不可或缺。而脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis,bf)作为拟杆菌的模式种，它常见于哺乳动物的下消化道，是一种革兰氏染色阴性、杆状、两端钝圆而浓染，有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌。

由于脆弱拟杆菌最先是在致病部位分离得到，故它最初被认为是有害菌。而目前脆弱拟杆菌被认为是一种条件致病菌，当机体的某一部位受损或预先有病理改变时，脆弱拟杆菌容易成为致病菌。

目前，脆弱拟杆菌所参与的免疫调节机制正被众多研究机构探索中，其研究结果主要集中针对于树突状细胞和自适应免疫系统方面。吞噬细胞的主要作用是清除体内的免疫复合物和病原体等抗原性异物，而脆弱拟杆菌对吞噬细胞的相关效应还尚未见报道。因此，研究脆弱拟杆菌对吞噬细胞的吞噬功能的影响，并寻找一种提高吞噬细胞的吞噬功能的方法和组合物，将具有重大的临床意义。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的在于提供一种脆弱拟杆菌的新应用。

实现上述发明目的的具体技术方案如下：

脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)在制备增强吞噬细胞对致病菌的吞噬作用的药物或食品中的应用。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)为保藏编号为cgmccno.10685的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)zy-312。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)包括脆弱拟杆菌活菌、脆弱拟杆菌灭活菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。

在其中一些实施例中，所述致病菌为艰难梭菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、变形杆菌以及耶尔森氏菌中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述药物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、气雾剂或管饲制剂。所述药物包括人用药或动物用药，可用于人或动物。

在其中一些实施例中，所述食品包括奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌或发酵谷类食品。所述食品还可以是动物食品，比如饲料等。

在其中一些实施例中，所述食品为婴儿食品或宠物食品。

本发明的另一目的在于提供一种增强吞噬细胞对致病菌的吞噬作用的药物组合物。

具体技术方案如下：

一种增强吞噬细胞对致病菌的吞噬作用的药物组合物，所述药物组合物含有保藏编号为cgmccno.10685的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)zy-312。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)包括脆弱拟杆菌活菌、脆弱拟杆菌灭活菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。

在其中一些实施例中，所述致病菌为艰难梭菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、变形杆菌以及耶尔森氏菌中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述药物组合物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、气雾剂或管饲制剂。

本发明的另一目的在于提供一种增强吞噬细胞对致病菌的吞噬作用的食品。

具体技术方案如下：

一种增强吞噬细胞对致病菌的吞噬作用的食品，含有保藏编号为cgmccno.10685的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)zy-312。

在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)包括脆弱拟杆菌活菌、脆弱拟杆菌灭活菌、脆弱拟杆菌裂解物和/或脆弱拟杆菌培养上清液。

在其中一些实施例中，所述致病菌为艰难梭菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、变形杆菌以及耶尔森氏菌中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述食品包括奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌、发酵谷类食品。所述食品还可以是动物食品，比如饲料等。

在其中一些实施例中，所述食品为婴儿食品或宠物食品。

本发明的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)zy-312，已于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmccno.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的发明人经过长期经验积累以及大量创造性实验研究发掘了脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)新的用途，开拓了脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)的一个新的应用领域。本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)(尤其是保藏编号为cgmccno.10685的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)zy-312)对巨噬细胞吞噬不同致病菌均具有很好的增强效果，从而预示了脆弱拟杆菌具有很好的食用和药用前景。脆弱拟杆菌作为一种肠道菌，其活菌、灭活菌、裂解物或培养上清液均可用于制备增强吞噬细胞对致病菌吞噬作用的食品或药物组合物，进而为临床提供一种适合人体服食的保健以及防治良品。

附图说明

图1为实施例1的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)zy-312的菌落特征图；

图2为实施例1的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)zy-312进行革兰氏染色后的显微镜观察图；

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

以下实施例中所用的脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)zy-312，于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmccno.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例1脆弱拟杆菌的分离及样品的制备

(1)脆弱拟杆菌的增菌培养及活菌液的制备

将菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。

菌落特征：脆弱拟杆菌zy-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm之间，参见图1。

显微镜下形态：脆弱拟杆菌zy-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。

选取单个菌落接种于改良的胰蛋白胨肉汤中进行增菌培养，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，去上清，沉淀物用生理盐水洗涤后用生理盐水稀释，用麦氏比浊管做菌数测定，稀释至10⁶cfu/ml，10⁸cfu/ml，10¹⁰cfu/ml，分别标记为样品a、样品b和样品c，保存备用。

(2)脆弱拟杆菌菌体上清液的制备

选取单个菌落接种于改良的胰蛋白胨肉汤中进行增菌培养，用麦氏比浊管做菌数测定，稀释至10⁶cfu/ml，10⁸cfu/ml，10¹⁰cfu/ml，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，收集上清液，并将样品分别标记为样品d、样品e和样品f，保存备用。

(3)脆弱拟杆菌灭活菌液的制备

采用高温或紫外照射的方法制备脆弱拟杆菌灭活菌液。具体步骤：分别取(1)制备的10⁶cfu/ml，10⁸cfu/ml，10¹⁰cfu/ml的脆弱拟杆菌活菌液5ml置于烧杯中，并将盛有活菌液的烧杯置于100℃的恒温水浴锅中20～30min或置于紫外线环境30～60min，便可制备脆弱拟杆菌灭活菌液，并将样品分别标记为样品g、样品h和样品i。

(4)脆弱拟杆菌裂解物溶液的制备

通过超声破碎的方法制备脆弱拟杆菌裂解物溶液。具体步骤：分别采用(1)制备的10⁶cfu/ml，10⁸cfu/ml，10¹⁰cfu/ml的脆弱拟杆菌活菌液5ml，经超声仪裂解30分钟，on10秒,off10秒，该体系裂解菌体效率>99％，裂解后经10000rpm，10min，4℃离心，0.22μm滤头过滤后备用，即得脆弱拟杆菌裂解物溶液，并分别标记为样品j、样品k和样品l。

表1样品的制备方法

实施例2不同样品对吞噬细胞吞噬荧光微球的影响

采用实施例1制备的脆弱拟杆菌活菌液、灭活菌液、裂解物溶液、上清液分别进行实验。

1、骨髓衍生巨噬细胞(bmdm)获取

根据文献(如：trouplin,v.,boucherit,n.,gorvel,l.,conti,f.,mottola,g.,ghigo,e.bonemarrow-derivedmacrophageproduction.j.vis.exp.(81),e50966,doi:10.3791/50966(2013).)记载的方法制备bmdm细胞。

2、荧光微球原液的预处理

为了获得游离分散的荧光微球，我们需要在正式实验之前将荧光微球原液(2014年12月购于molecularprobes，型号为f8823，1μm，10ml，yellow-green(505/515))进行预处理。预处理方案如下：

(1)吸取0.5ml荧光微球原液，加入双蒸水洗涤，10000g，8min，室温，弃上清；

(2)用10ml3％bsa(25mmna2hpo4)重悬将微球沉淀悬起，避光水浴超声孵育15min，将微球分散，bsa的主要作用是结合在微球表面，避免微球再次聚集，维持分散独立的状态；

(3)离心，5000g，20分钟，将未结合的bsa去除；

(4)用含5％fbs的培养基(dmem)洗涤微球3次，离心条件同第(3)步；

(5)最后加入10ml的10％fbs的培养基(dmem)重悬，得荧光微球保存液；

(6)荧光微球液的工作液配制：按15个孔配制，112.5ul荧光微球保存液+4.5ml细胞培养液(dmem)，用15ml无菌离心管配制，管外壁用锡纸包裹避光。充分混匀后，经水浴超声30分钟，使荧光微球分散成单个独立游离的状态，便于bmdm吞噬。

3、脆弱拟杆菌调理bmdm吞噬荧光微球实验

(1)实验分组

采用实施例1制备的脆弱拟杆菌活菌液、灭活菌液、裂解物溶液、上清液分别进行实验。本实验分为五组。实验组1为菌液组，实验组2为灭活菌液组，实验组3为裂解液组，实验组4为上清液组，对照组为medium(含5％fbs的dmem培养基)组，分别用上述5组样品感染12小时。每个组需在感染实验结束后于37℃下吞噬荧光微球1小时，检测吞噬率(包括黏附及真正吞噬入细胞的微球总数)。

(2)bmdm重铺板

具体实验步骤如下：

1)经m-csf刺激分化6～7天后，获得高纯度的bmdm，从孵箱中取出细胞，取一次性细胞刮，将细胞刮下，刮下细胞时注意无菌操作，并且用力均匀，适当旋转刮头把孔周的细胞都刮下，避免留空，刮下后置于显微镜下观察，能刮取>95％贴壁的bmdm；

2)用50ml无菌离心管收集刮取下的bmdm的细胞悬液，1300rpm，5min，室温离心，弃上清，使用铺板培养液(事先配置，dmem+20％fbs)重悬，调整细胞浓度为2×105cell/ml，取24孔板，每孔加入1ml，置于37℃，5％co2孵箱内孵育24小时，第二天观察，孔内为标准巨噬细胞形态，细胞贴壁，分布均匀，无明显死亡细胞漂浮，为实验可用细胞。

(3)脆弱拟杆菌感染bmdm实验

将重新铺有状态良好的bmdm的5张24孔板取出，吸弃细胞培养上清，分别将实施例1制备的活菌液3，灭活菌液3，裂解物溶液3，上清液3加入24孔板中，每孔1ml，对照组为1ml/孔的medium，置于37℃，5％co2孵箱内分别孵育12小时。

4、结果与分析

将活菌液样品c，灭活菌液样品f，裂解物溶液样品i，培养上清液样品l以及medium五种样品感染bmdm12小时候后，加入2处理后的荧光微球，于37℃下吞噬荧光微球60分钟，采用流式细胞仪进行检测，检测吞噬率(包括黏附及真正吞噬入细胞的微球总数)，结果如表2：

表2不同样品对吞噬细胞吞噬荧光微球的影响

从上述结果可以看出，脆弱拟杆菌活菌、脆弱拟杆菌灭活菌、脆弱拟杆菌裂解物溶液以及脆弱拟杆菌的培养上清液均能增强吞噬细胞对荧光微球吞噬的吞噬作用，其中活菌、灭活菌、裂解物对吞噬细胞吞噬荧光微球的影响一致，大大增强了吞噬细胞对荧光微球的吞噬作用，培养上清液虽也能增强吞噬细胞的吞噬功能，但与活菌液、灭活菌液、裂解物溶液相比，相对较弱。

实施例3不同浓度的样品对吞噬细胞吞噬作用的影响

为了检测不同浓度的样品对吞噬细胞吞噬作用的影响，本实施例采用实施例1制备的脆弱拟杆菌活菌液、灭活菌液、裂解物溶液、培养上清液分别进行实验。

采用实施例2的操作方法，不同浓度的样品对吞噬细胞吞噬作用的影响，结果如表3：

表3不同浓度的样品对吞噬细胞吞噬作用的影响

从上述结果可以看出，脆弱拟杆菌活菌、脆弱拟杆菌灭活菌、脆弱拟杆菌裂解物以及脆弱拟杆菌培养上清液对吞噬细胞吞噬荧光微球的影响与实施例2的一致，其中，随着活菌、灭活菌、裂解物以及上清液的浓度升高，其增强吞噬细胞对荧光微球的吞噬作用也随着增强。

实施例4样品对吞噬细胞吞噬不同种类致病菌的影响

本实施例检测样品对吞噬细胞吞噬不同种类致病菌的影响，所述的样品选自实施例1制备的脆弱拟杆菌活菌液、灭活菌液、裂解物溶液、培养上清液。本实施例以实施例1制备的脆弱拟杆菌活菌液样品c为例。所述的致病菌选自艰难梭菌(clostridiumdifficile)vpi1463菌株、副溶血性弧菌(v.parahaemolyticus，v.p)j5421菌株、志贺氏菌(shigellaflexneri)atcc12022菌株、沙门氏菌(salmonella)o157菌株、大肠杆菌(escherichiacoli)atcc25922菌株、变形杆菌(proteusspecies)cmcc(b)49027菌株以及耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)cmcc(b)52204菌株。本实施例分别针对上述7种致病菌设置7组实验，每组实验分为实验组和对照组，实验组检测添加脆弱拟杆菌活菌液样品c后对吞噬细胞吞噬致病菌的影响，对照组将添加的脆弱拟杆菌活菌液样品c替换为medium(含5％fbs的dmem培养基)，检测吞噬细胞对致病菌的吞噬作用，每组实验重复3次。所述7组实验中致病菌的浓度为2×10⁷cfu/ml。具体实验分组如表4：

表4实验分组

采用实施例3的操作方法，将荧光微球换成表4所示的致病菌，检测样品c对吞噬细胞吞噬不同种类致病菌的影响。

本实施例选用了细胞相关细菌(cellassociatedbacteria，cab)作为其中一项指标，以本实施例为例，cab是指bmdm吞噬致病菌30分钟后进入巨噬细胞内的所有致病菌及黏附于胞膜上的致病菌数目之和。巨噬细胞吞噬菌数(phagocyticbacteria,pb)作为另一项检测指标，因为这是巨噬细胞发挥抗菌能力的重要前提，巨噬细胞不仅能直接利用胞内的酶杀伤致病菌，还能通过抗原提呈方式激活适应性免疫，从而增强机体抗菌能力。

观察各组实验中bmdm吞噬致病菌30分钟后的cab值及pb值是否存在差异，以分析样品c是否影响bmdm吞噬各种致病菌的能力。因本实施例数据为菌浓度数值，带有指数不便于统计，因此所有原始数据需经log10计算后表示。

经log函数换算后的数据经“方差齐性检验”检验两组数据的方差齐性，若p＞0.05，可认为方差齐性，用“unpairedttest”统计分析，当p＜0.05时，视为有统计学差异；若p＜0.05，可认为方差不齐，用“unpairedttestwithwelch’scorrection”统计分析，当p＜0.05时，视为有统计学差异。

具体结果如下：

表5各试验组cab计算结果

表6各试验组pb计算结果

分别将以上7组实验中的对照组与实验组的cab值(经log函数换算后)经“方差齐性检验”，结果均为方差不齐，即p＜0.05，使用“unpairedttestwithwelch’scorrection”进行统计学分析，统计结果显示：以上7组实验中的对照组与实验组的cab值的统计结果均为p＜0.05，即以上7组实验中的对照组与实验组的bmdm细胞相关细菌数有统计学差异(p＜0.05)。分别将以上7组实验中的对照组与实验组的pb值(经log函数换算后)经“方差齐性检验”，方差不齐(p＜0.05)，使用“unpairedttest”进行统计学分析，统计结果显示：以上7组实验中的对照组与实验组的pb值，均为方差不齐，即p＜0.05。上述结果说明：添加脆弱拟杆菌活菌样品后，bmdm吞噬细菌数存在统计学差异(p＜0.05)，即经脆弱拟杆菌活菌液处理的bmdm较对照组而言明显增加了bmdm吞噬致病菌的能力。

从上述结果可以看出，本发明提供的脆弱拟杆菌活菌液能增强吞噬细胞对不同种类致病菌的吞噬作用。灭活菌液、裂解液、上清液也具有类似的作用，具体实验结果省略。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。